Name: Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a isolar plaquetas humanas lavadas e medir agregação por turbidimetria usando colágeno e o inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF. Este método rápido permite estudar função plaquetária e coagulação sanguínea.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Swiss National Science Foundation (310030_162579 / 1 a Brenda Renata Kwak e 320030_144150 para Pierre Fontana), bem como por uma bolsa da Fundação suíça Coração.

Cinco voluntários saudáveis ​​não relacionados foram recrutados para a amostragem de sangue para testes de isolamento e de agregação de plaquetas. consentimento informado por escrito foi obtido e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Central dos Hospitais da Universidade de Genebra. Todos os voluntários certificados para ser saudável e não ter tomado quaisquer drogas interferir plaquetas durante pelo menos os 10 dias que antecederam os experimentos. 1. Preparação de buffer para coleta de sangue humano e lavou Isolamento de plaquetas <ol><li> Prepara-se uma solução aquosa de 100 mL de ácido-citrato-dextrose (ACD) por dissolução de 1,4 g de mono-hidrato de ácido cítrico (C 6 H 8 O 7 • H2O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trissódico di-hidratado (Na 3 C 6 H 5 O 7 • 2 H2O, 85 mM) e 2 g de D anidro (+) - glucose. O pH da solução é cerca de 4,5. </li><li> Preparar soluções estoque de tampão de Tyrode como segue<ol><li> Preparar a soluo de estoque 1 por dissolução de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de NaHCO3 e 0,58 g de NaH 2 PO 4 * H2O em 500 mL de H2O destilada As respectivas concentrações finais são 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Manter a solução a 4 ° C. </li><li> Preparar a solução stock 2 por dissolução de 10,15 g de MgCl2 * 6 H2O (100 mM) em 500 mL de H2O destilada Mantenha a solução a 4 ° C. </li><li> Preparar solução mãe 3 por dissolução de 10,95 g (100 mM), CaCl2 * 6 H2O em 500 mL de H2O destilada Mantenha a solução a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar tampão de Tyrode por diluição de 2,5 ml de solução de estoque 1 em um volume final de 50 ml com água destilada H 2 O. Isto corresponde a concentrações finais de NaCl 136,5 mM, KCl 2,68 mM, 11,9 mM de NaHCO3 e 0,42 mM NaH 2 PO 4 * H2O Ajustar o pH a 7,35 e esterilizar por filtração com 0,22? m-filters. </li><li> Preparar albumina de tampão de 0,35% de Tyrode (tampão TA 7) por diluição de 5 ml de solução stock de 1, 1 mL de solução stock de 2, 2 mL de solução de reserva 3, 0,5 ml de HEPES 1M, 1,8 ml de 200 g / L de albumina de soro humano e 0,1 g de D anidro (+) - glucose num volume final de 100 mL de H2O destilada <ol><li> Ajustar o pH a 7,35 com HC1 IN e ajustar a osmolaridade a 295 mOsm / l através da adição de H2O destilada (10% do volume total). As concentrações finais nesta solução são: NaCl 124 mM, KCl 2,44 mM, 10,82 mM de NaHCO3, 0,38 mM NaH 2 PO 4 * H2O, MgCl 0,91 mM de 2 * 6 H2O, CaCl 1,82 2 * 6 H2O . Manter tampão TA a 37 ° C durante todo o experimento. </li></ol></li></ol> Coleção 2. Sangue <ol><li> Recolha de 45-50 ml de sangue venoso, a partir da veia antecubital usando uma agulha G 19, e pouca ou nenhuma torniquete, em tubos de 50 ml de ConAtaining ACD anticoagulante (1 volume de ACD para 6 volumes de sangue). Rejeitar os primeiros 1-2 ml de sangue para evitar a presença de trombina e factor tecidular. <ol><li> Após a recolha, misturar o sangue com o ACD por invertendo suavemente o tubo. Incubar a amostra durante 10 min a 37 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de plaquetas humanas lavadas <ol><li> Pré-aqueça o centrifugador a 37 ° C. Todos os passos de centrifugação abaixo são realizadas a esta temperatura. </li><li> Despachar o sangue recolhido em tubos de 15 mL (5 mL por tubo) e centrifugar a 250 xg durante 13 min para se obter o PRP. NOTA: Este passo de centrifugação resulta na produção de três camadas da amostra: 1) A camada superior, composta de plasma, plaquetas, e uma pequena fracção de glóbulos brancos. 2) A camada intermédia, uma porção rica em glóbulos brancos. 3) A camada inferior, que é essencialmente composto por células vermelhas do sangue. </li><li> Recolhe-se o PRP por pipetagem a la superioryer cuidadosamente para um novo tubo de 15 mL para evitar ao máximo a contaminação por glóbulos vermelhos e brancos do sangue, e incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Centrifugar o PRP a 2200 x g durante 12 min (para 5 ml de PRP). NOTA: Esta etapa de centrifugação deve ser realizada com baixa freio ou sem freio. </li><li> Remover o sobrenadante (plasma pobre em plaquetas), e ressuspender cuidadosamente o sedimento com 10 ml de tampão TA contendo 2 ul / ml de heparina (5000 U / mL) e 2,5 mL / mL de 25? M PGI 2, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 2,5 uL / mL de 25? M PGI2 e centrifuga-se durante 8 minutos a 1900 xg (com baixo freio ou sem travão). </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 5 mL de tampão TA contendo 2,5 uL / mL de 25? M PGI2 usando uma pipeta de Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Durante o período de incubação, pipeta 150 uL da suspensão de plaquetas empara um tubo de 1,5 ml e contagem de plaquetas, usando um contador de células automatizado (que detecta o tamanho das células do sangue medindo as mudanças na resistência de corrente contínua). </li><li> Após a incubação de 10 min, adicionar 2,5 mL / mL de 25? M PGI2 para a suspensão de plaquetas e centrifugar imediatamente a 1900 x g durante 8 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento para uma concentração de 250.000 plaquetas / microlitro com um volume adequado de tampão TA (isto é, se a contagem de células é de 500.000 por ml, ressuspender em 10 ml de tampão TA) contendo 32 pL / mL de apirase em 0,01 L / ml (concentração final de 0,32 U / ml). NOTA: alta concentração de apirase é utilizado para evitar a dessensibilização de receptores P2X1 induzidas pela secreção espontânea de ATP 10, 11 na ausência de agonistas. Isto é importante porque as respostas induzidas por colagénio são induzidas por parácrina rápido / activação autócrina de P2X1 por ATP libertado from plaquetas activadas. Se a via de sinalização de plaquetas não requer criticamente preservação da função P2X1, usar 0,02 U / mL de apirase. Vários estudos (revisto em Mahaut-Smith et al. 10) demonstraram que a 0,02 U / mL de apirase evita ADP dessensibilização do receptor de P2Y1 com respostas P2X1 negligenciáveis. </li><li> Incubar a suspensão de células durante pelo menos 30 min a 37 ° C antes da realização das medições aggregometric. A preparação é estável durante 5 a 8 horas. </li></ol> 4. agregometria <ol><li> Preparar fibrinogénio (56 mg / mL) em tampão de Tyrode. </li><li> Pipetar 260 L de suspensão de plaquetas em cuvetes de vidro (Figura 1A; cuvete esquerdo) contendo 10 ul de fibrinogénio (56 mg / mL) e uma haste de agitação magnética, depois incubar a suspensão durante 2-3 min a 37 ° C em poços de incubação presentes no agregómetro (Figura 1B e 1C). </li><li> Pré-incubar com o Panx1inibidor Brilliant Blue FCF pela adição de 10 uL de uma solução 2,8 mM ou estoque 28 mM (concentração final de 100 uM e 1 mM, respectivamente) durante 7 minutos a 37 ° C. </li><li> Calibrar o agregómetro para um valor assumptive agregação de 100%, medindo a OD de uma cuvete contendo 10 ul de fibrinogénio (56 mg / mL), 10 uL Brilliant Blue FCF (2,8 mM ou 28 mM) e tampão TA sem plaquetas. <ol><li> Coloque a cuvete num agregado bem sob agitação automática e pressionar o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro (isto é, prima F1 se bem a agregação 1 é utilizado). NOTA: Este experimento descrito abaixo inclui Brilliant Blue FCF. O composto usado para calibragem tem de ser ajustado para a condição experimental. </li></ol></li><li> Calibrar o agregómetro para um valor assumptive agregação 0% utilizando a mesma amostra de plaquetas que será utilizado para a experiência sob mexendo automáticag. <ol><li> Coloque a cuvete na agregação bem e pressione o botão correspondente no teclado do computador ligado à agregómetro. Aguarde cerca de 20-30 s antes de prosseguir. Este atraso serve para assegurar que nenhuma agregação acontece antes da adição dos agonistas. NOTA: Como qualquer diferença no número de plaquetas pode ter um efeito sobre a DO medida, o passo de calibração 0% precisa de ser repetido para cada medição individual. </li></ol></li><li> Adiciona-se 20 uL de agonista desejado, tal como 15 ug de colagénio / ml (1? G / ml final) ou 1,125 mM de ácido araquidónico (75 uM final), na cuvete. começar imediatamente a gravação, sob agitação automático contínuo pressionando o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro. NOTA: A adição do agonista induz a activação de plaquetas. Agregados de plaquetas pode ser claramente distinguida na cuvete de vidro no final da expericia (Figura 1A; right cuvete). </li><li> A gravação é interrompida automaticamente após 6 min. Neste ponto, salvar os dados clicando no ícone salvar do computador. NOTA: O cálculo da taxa de agregação é executada pelo computador, que expressa os resultados finais do processo de agregação como uma porcentagem. </li><li> Analisar os dados. <ol><li> Para informação adicional sobre extensa protocolos para a preparação das suspensões de plaquetas lavadas e medição turbidimétrica de agregação de plaquetas, referem-se outros papéis de autoria de peritos no campo 12, 13. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Há um grande interesse em encontrar novos medicamentos capazes de modular a função das plaquetas, a fim de prevenir a trombose sem aumentar o risco de hemorragia. Para este efeito, em testes in vitro de laboratório, que pode de forma fiável e reprodutível monitorizar respostas de agregação em plaquetas humanas são absolutamente necessárias. agregometria Turbidimétrico é uma técnica fácil de executar. No entanto, algumas precauções devem ser mantidos em mente. As medições têm de ser executadas sob agita...

As plaquetas são componentes cruciais do sangue e a sua principal função-juntamente com factores de coagulação-se para parar o sangramento após a lesão do vaso sanguíneo. As plaquetas são fragmentos pequenos (2-3 mm) anuclear derivados de megacariócitos de medula óssea 1. As plaquetas circulam no estado n activado, durante a qual eles aparecem como estruturas em forma de lente. Após a interrupção do endotélio, as plaquetas se reúnem para o local da lesão vaso sanguíneo para tapar o buraco, um processo chamado hemostasia primária. Inicialmente, as plaquetas para anexar moléculas de sub-endotelial, tais como o colagénio e o factor de von Willebrand, que são expostos como um resultado do passo de lesão-adesão 2. Em seguida, eles mudam de forma e secretar passo mensageiros-activação química. Finalmente, eles se conectam uns com os outros colmatando passo receptores de agregação. hemostase primária é seguida por um processo secundário envolvendo activação da cascata de coagulação com a deposição de fibrina, que estabilizams o trombo inicial 2. Eventos isquémicos agudos, tais como enfarte do miocárdio 3 muitas vezes resultar de trombos que formam por causa de ruptura física (ruptura) de uma placa aterosclerótica. medicamentos anti-plaquetários atuais são a pedra angular do tratamento desta doença generalizada, mas seu benefício clínico é limitado por um aumento do risco de sangramento. As drogas mais prescritas em pacientes com doenças cardiovasculares, compostos da aspirina e anti-P2Y12, o alvo do tromboxano A2 e os percursos ADP 4, respectivamente, que são as principais vias que conduzem à activação de plaquetas. No entanto, pesquisas inovadoras para novos alvos que otimamente equilibrar efeitos antitrombóticos e risco hemorrágico ainda é necessária. A partir da década de 1960 5 até hoje, agregometria turbidimétrico tem desempenhado um papel crucial na pesquisa, aumentando o nosso conhecimento da reatividade plaquetária e iN, a monitorização da actividade dos reagentes anti-trombóticos em seres humanos. Turbidimetria foi inicialmente aplicada ao PRP extraída a partir de amostras de sangue. Com efeito, a colheita de sangue realizada em tubos contendo citrato permite a produção rápida e grande de PRP sem ter qualquer efeito sobre a integridade e a função das plaquetas. No entanto, a estabilidade a curto prazo (cerca de 3 h) de PRP e os restantes enzimas plasmáticas, tais como a trombina, e a baixa concentração de cálcio associado com perfis de agregação potencialmente artefatuais são de grande inconveniente para a utilização de PRP. Um importante passo em frente tem sido o desenvolvimento de um método para o isolamento de plaquetas com centrifugação e passos de lavagem 6 adicional. Em suma, o PRP foi isolado a partir de sangue total recolhido de ácido-citrato-dextrose (ACD) e as plaquetas são isolados depois de passos de centrifugação de série antes de serem ressuspensas num tampão iso-osmótico fosfato (tampão de Tyrode) contendo glucose, albumina do soro humano e divalente cções (Ca 2+ e Mg 2+). Para evitar alterações na reactividade das plaquetas, o pH do tampão de Tyrode é cuidadosamente mantida a 7,35-7,4. Além disso, a activação indesejada de plaquetas é impedida pela adição de prostaciclina (PGI 2) antes de alguns passos de centrifugação. Finalmente, a adição de apirase evita que as plaquetas lavadas de se tornar resistente contra a acção de ATP / ADP. A suspensão de plaquetas resultante não tem factores coagulantes e a estabilidade de plaquetas é aumentada de pelo menos duas vezes, em comparação com soluções de PRP. Além disso, o facto de que as plaquetas são inactivos mas garante intactas a reprodutibilidade das medições turbidimétricas e fornece a capacidade para estudar a acção de agonistas ou antagonistas de agregação de plaquetas de uma forma optimizada. Usando este método, temos demonstrado num estudo recente de que a inibição da formação de canais Panx1 por uma abordagem genética (knock-out ratinhos) ou diminuir a actividade de canal Panx1 por farmacológicaaproxima-se reduzida a agregação de plaquetas induzida por colagénio 7. Panx1 forma canais de ATP de libertação, que são ubiquamente expressos em muitos tipos de células incluindo plaquetas humanas 7, 8. De facto, foi demonstrado por turbidimetria em plaquetas humanas lavadas que um 7 min de pré-incubação com um painel de mais-ou-menos específicos bloqueadores químicos (probenecida, mefloquina e 10 péptidos Panx1) antes da adição de vários agonistas, inibiu especificamente induzida por colagénio agregação plaquetária enquanto as respostas de plaquetas para AA e ADP não foram afetados. Nós demonstramos que o ATP libertação por meio de canais Panx1 interfere especificamente na via de sinalização de GPVI que conduz à agregação induzida por colagénio. Curiosamente, vários compostos aprovados pela FDA, com aplicações em outras doenças (probenecida, mefloquina) afectar a actividade de canais Panx1 em plaquetas. Por um lado, isso abre novas perspectivas terapêuticas para selecionarvamente modificar a reactividade de plaquetas. Por outro lado, deve-se considerar os potenciais efeitos secundários destes compostos. Neste contexto, o corante de alimentos seguros Brilliant Blue FCF usado em vários doces e bebidas energéticas tem sido descrito como um inibidor selectivo da Panx1 9. Descrevemos aqui um protocolo para o isolamento de plaquetas humanas lavadas e medições turbidimétricas de agregação de plaquetas adaptado para investigar o efeito do corante azul brilhante FCF como um antagonista da agregação plaquetária.

<table><tbody><tr><td>ácido cítrico mono-hidratado (C6H8O7*H2O)</td><td>Roth</td><td>5949-29-1</td><td>perigo de lesões oculares/irritação</td></tr><tr><td>citrato trissódico di-hidratado (Na3C6H5O7 * 2H 2O)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804-D</td><td></td></tr> <tr><td>(+) -glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>sódio (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>potássio (KCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-Bicarbonato</td><td></td></tr> <tr><td>de sódio (NaHCO 3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>-</td></tr><tr><td>Diidrogenofosfato de sódio monohidratado (NaH2PO4*H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>magnésio hexahidratado (MgCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-Cloreto</td> <td>de</td></tr> <tr><td>cálcio hexahidratado (CaCl2*6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442909</td><td>perigo de dano/irritação ocular</td></tr><tr><td>Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico (Hepes)</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>15630-albumina</td><td></td></tr> <tr><td>sérica humana</td><td>CSL Behring</td><td>00257/374-ácido</td><td></td></tr> <tr><td>clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Corrosivo e irritante para o sistema respiratório. Pode causar danos graves à pele e aos olhos.</td></tr><tr><td>Eppendorf 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>heparina</td><td>Drosspharm AG/SA</td><td>20810</td><td></td></tr><tr><td>prostaciclina I2 (PGI2)</td><td>Cayman</td><td>18220-apirase</td><td></td></tr> <tr><td>de batatas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535-fibrinogênio</td><td></td></tr> <tr><td>(Haemocomplettan)</td><td>CSL Behring</td><td>HS</td><td></td></tr> <tr><td>73466011-trombo-aggragometer SD-Medical</td><td>SD-Innovation</td><td>TA8V-Brilliant</td><td></td></tr> <tr><td>blue FCF (Erioglaucine dissodium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80717</td><td>Nocivo à vida aquática com efeitos duradouros (Evita liberação para o meio ambiente)</td></tr><tr><td>colágeno</td><td>Horm, Nycomed-ácido</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>araquidônico</td><td>Bio/Data corporation</td><td>C/N contador de</td> <td>101297-cell</td></tr> <tr><td>Sysmex KX-21N</td><td>Sysmex Digitana&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056-cubetas</td> <td>de</td></tr> <tr><td>vidro</td><td>SD-Innovation</td><td></td> <td>THCV1000-agitadores</td></tr> <tr><td>magnéticos</td><td>SD-Innovation</td><td>THA100</td><td>-</td></tr></tbody></table>

turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: o efeito do inibidor pannexin1-brilliant blue fcf na agregação induzida por colagénio

Turbidimetry on Human Washed Platelets: The Effect of the Pannexin1-inhibitor Brilliant Blue FCF on Collagen-induced Aggregation

Turbidimetria é uma técnica de laboratório que é aplicado para medir a agregação de plaquetas em suspensão em qualquer de plasma (plasma rico em plaquetas, PRP) ou em tampão de plaquetas lavadas (), pelo uso de um ou uma combinação de agonistas. A utilização de plaquetas lavadas separadas do seu ambiente de plasma e na ausência de anticoagulantes permite o estudo das propriedades intrínsecas de plaquetas. Entre o grande painel de agonistas, o ácido araquidónico (AA), a adenosina-di fosfato de (ADP), colagénio e trombina são os mais frequentemente utilizados. A resposta de agregação é quantificada através da medição da densidade óptica relativa (DO) ao longo do tempo de suspensão de plaquetas, sob agitação contínua. As plaquetas em suspensão homogénea limitar a passagem de luz após a adição de um agonista, alteração da forma das plaquetas ocorre a produção de um pequeno aumento transitório da OD. Seguindo este passo de activação inicial, a formação de coágulos de plaquetas formar gradualmente, o que permite a passagem de luz através da suspensão como um result de diminuição da OD. O processo de agregação é em última análise, expresso como uma percentagem, em comparação com o diâmetro externo de plasma pobre em plaquetas ou tampão. calibração rigorosa é, portanto, essencial no início de cada experimento. Como uma regra geral: calibração de 0% é definido através da medição da DO de uma suspensão de plaquetas não estimuladas ao medir o OD do meio de suspensão que não contém plaquetas representa um valor de 100%. A agregação plaquetária é geralmente visualizado como uma curva de agregação em tempo real. Turbidimetria é uma das técnicas de laboratório mais comumente utilizados para a investigação da função plaquetária e é considerado como padrão-ouro histórico e utilizado para o desenvolvimento de novos agentes farmacêuticos que visam inibir a agregação plaquetária. Aqui, nós descrevemos protocolos detalhados para 1) preparação de plaquetas humanas lavadas e 2) análise turbidimétrico de agregação induzida por colagénio de plaquetas humanas lavadas pré-tratados com o corante alimentar azul brilhante FCF que foi recentemente idencado como um inibidor dos canais de Pannexin1 (Panx1).

O software aggregometer produz automaticamente as curvas de agregação e dá os valores de agregação máxima em percentagem. Os valores podem ser copiados para um software de análise de dados, a fim de realizar a análise estatística e visualizar os valores de agregação máxima na forma de gráficos de barras. Opcionalmente, cada ponto individual da curva de agregação pode ser exportado sucessivamente para um software de folha de cálculo e, em seguida, para o software de estatística (por e...

Descreve-se um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano seguido por meio de medições de agregação plaquetária induzida por agonistas por turbidimetria. Como exemplo, aplicam-se este método para estudar a resposta de agregação de plaquetas humanas a colagénio depois de uma pré-incubação com o inibidor do canal Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio

Turbidimetry is a laboratory technique that is applied to measure the aggregation of platelets suspended in either plasma (platelet-rich plasma, PRP) or ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano, seguido por medições da agregação plaquetária induzida por agonistas por meio de turbidimetria. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia plaquetária humana, como os efeitos da inibição da pannexina-1 sobre a agregação plaquetária induzida por agonistas. A principal vantagem desta técnica é que ela é rápida e fácil de executar, ao mesmo tempo em que permite o monitoramento confiável e reprodutível das respostas de agregação.A agregometria por transmissão de luz não é usada apenas para fins de pesquisa, mas também para a investigação da função plaquetária em pacientes com distúrbios hemorrágicos. Para começar, dissolva 1,4 gramas de ácido cítrico monoidratado, 2,5 gramas de citrato de sódio diidratado e dois gramas de D-glucose anidro em água destilada para preparar 100 mililitros de uma solução de ACD com pH aproximadamente 4,5. Em seguida, prepare o tampão de Tyrode diluindo 2,5 mililitros da solução estoque um em um volume final de 15 mililitros de água destilada.Ajuste o pH para 7,35 adicionando ácido clorídrico

turbidimetry-on-human-washed-platelets-effect-pannexin1-inhibitor

Research

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Medicine

Medicina

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Este vídeo demonstra o método para avaliar o impacto da tensão de cisalhamento nas plaquetas. O tratamento com anticorpos induz dissociação e alterações conformacionais nos complexos mecanorreceptores, ativando as plaquetas e expressando marcadores na superfície. Esses marcadores são observados por meio de imunomarcação e citometria de fluxo.

Os efeitos do estresse de cisalhamento em plaquetas tratadas com anticorpos contra receptores mecanossensoriais

Este vídeo demonstra a análise turbidimétrica para avaliar a agregação plaquetária induzida por colágeno em plaquetas humanas pré-tratadas e lavadas. Os poços de controle mostram agregação induzida por colágeno, enquanto uma alta concentração de inibidores bloqueia os canais de anexina-1, inibindo assim a agregação plaquetária induzida por colágeno, evidente pela turbidez inalterada.

Uma análise turbidimétrica para monitorar a agregação induzida por colágeno de plaquetas humanas pré-tratadas

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Nós descrevemos um método da em-solução para aplicar a tesoura uniforme aos receptores de superfície da plaqueta usando o viscometry da cone-placa. Esse método também pode ser usado de forma mais ampla para aplicar cisalhamento a outros tipos de células e fragmentos de células e não precisa direcionar um par de receptor de ligante específico.

Um ensaio de cisalhamento uniforme para receptores de superfície de células e plaquetas humanas através de Viscometry de cone-Plate

Um protocolo detalhado para imagens de plaquetas migratórias únicas usando amarras avidina-biotina funcionalizadas por RGD com densidade ajustável é fornecido, revelando que as plaquetas geram força suficiente para romper a ligação avidina-biotina.

Um ensaio in vitro para estudar a migração plaquetária usando amarras Avidina-Biotina Funcionalizadas por RGD

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

O metabolismo plaquetário é de interesse, particularmente no que se refere ao papel da hiper e hipoatividade plaquetária no sangramento e distúrbios trombóticos. O isolamento de plaquetas do plasma é necessário para alguns ensaios metabólicos; Apresentamos aqui um método para isolamento de metabólitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Preparação de plaquetas humanas lavadas para estudos quantitativos de fluxo metabólico

A citometria de fluxo multicolorida para plaquetas pode identificar novos subtipos de plaquetas dentro de subpopulações clássicas de plaquetas, como plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Isso permite a comparação de diferentes padrões de subpopulação induzidos por vários agonistas plaquetários. Aqui, um procedimento para estabelecer um painel de citometria de fluxo multicolorido é descrito em detalhes.

Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

O presente protocolo fornece um conjunto abrangente de procedimentos necessários para analisar plaquetas pró-coagulantes, que exibem características sobrepostas de necrose, apoptose e ativação plaquetária.

Análise abrangente de plaquetas pró-coagulantes exibindo características de necrose, apoptose e ativação plaquetária

Aprenda a isolar plaquetas humanas lavadas e medir agregação por turbidimetria usando colágeno e o inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF. Este método rápido permite estudar função plaquetária e coagulação sanguínea.

Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio (Vídeo) | JoVE Journal

Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio

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