Name: CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de sítio de enzima de restrição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprenda o método CAPRRESI para fusão de genes quiméricos em engenharia genética. Esta técnica utiliza sítios de enzimas de restrição em sequências sinônimas de DNA para gerar construtos híbridos de forma rápida e econômica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, CONACYT, México (número de concessão 154833) e pela Universidade Nacional Autônoma do México. Os autores agradecem a Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos e Soledad Juárez pelo seu conselho administrativo e técnico.

1. Protocolo CAPRRESI NOTA: A Figura 1 representa o protocolo CAPRRESI geral. Esta técnica é baseada em um projeto in silico e a construção subsequente das quimeras desejadas. <ol><li> Seleção do plasmídeo de clonagem, pUC18 ou pUC19. <ol><li> Selecione o vetor pUC que melhor se adequa às demandas técnicas. NOTA: Ambos os vetores têm a mesma seqüência, exceto para a orientação do site de clonagem múltipla. Isto é importante para o desenho de oligonucleótidos e a ruptura do plasmídeo PCR. </li></ol></li><li> Análise in silico dos genes do tipo selvagem e sequências pUC18 / 19. <ol><li> Obtenha as seqüências de DNA dos genes do tipo selvagem e guarde-os em um arquivo formato FASTA ( por exemplo, genes.fas). NOTA: As seqüências de vetores pUC18 / 19 estão contidas no arquivo pUC.fas ( Figura 1 , passo 1). </li><li> Determine qual restrição enzYmes não cortam os genes do tipo selvagem e as seqüências pUC18 / 19 executando o script REsearch.pl. Alternativamente, execute uma pesquisa de site de enzimas de restrição com uma ferramenta online ( Figura 1 , etapa 2). <ol><li> Digite o seguinte em um terminal: Perl REsearch.pl genes.fas Perl REsearch.pl pUC.fas NOTA: Estes comandos criarão os seguintes arquivos de saída: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas e pUC_re.fas. </li><li> Selecione as enzimas de restrição apropriadas para clonar os genes do tipo selvagem no site de clonagem múltipla do vetor pUC18 / 19 escolhido comparando os arquivos genes_re.fas e pUC.fas. Escolha a orientação da inserção em relação ao gene de resistência à ampicilina ( ampR ) do vetor pUC18 / 19. </li></ol></li><li> Desenhe os oligonucleótidos para trás e reverso para amplificar a região de codificação dos genes do tipo selvagem (oligonucleótidos externos). Inclua o local adequado da enzima de restrição em cada extremidade 5 &#39;Dos oligonucleótidos; Isso irá definir a orientação da inserção. <ol><li> Incluir um local de ligação ao ribossoma funcional nos oligonucleótidos para a frente. </li><li> Insira ambos os genes de tipo selvagem na mesma orientação dentro do vetor. </li></ol></li></ol></li><li> Seleção das regiões de quebra para montagem de quimera e ruptura de plasmídeos. <ol><li> Obtenha a sequência de aminoácidos do tipo selvagem e os genes ampR executando o script translate.pl ( Figura 1 , passo 3). <ol><li> Digite o seguinte em um terminal: Perl translate.pl genes.fas Perl translate.pl ampR.fas NOTA: Este script criará os seguintes arquivos de saída: genes_aa.fas e ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> Alinhe globalmente as duas sequências de aminoácidos de tipo selvagem com um software apropriado ( por exemplo, MUSCLE) 9 . </li><li> Selecione as regiões de ruptura desejadas (3-6 aminoácidos) para quimera asseCom base no alinhamento da sequência. Salve-os em um arquivo no formato FASTA ( por exemplo , regions.fas). </li><li> Localize as sequências de DNA que codificam os trechos de aminoácidos selecionados em ambos os genes do tipo selvagem. </li></ol></li><li> Geração in silico de sequências de DNA sinônimo contendo sites de enzimas de restrição. <ol><li> Obtenha todas as seqüências de DNA de sinônimo que codificam para cada estiramento da sequência de aminoácidos selecionado como regiões de ruptura ( Figura 1 , etapa 4); Essas seqüências foram armazenadas no arquivo regions.fas. <ol><li> Digite o seguinte em um terminal: Perl synonym.pl regions.fas NOTA: Este script criará o arquivo de saída region_syn.fas. </li></ol></li><li> Procure por sites de enzimas de restrição encontrados em seqüências de DNA sinônimo. <ol><li> Digite o seguinte em um terminal: perl REsynonym.pl regions_syn.fas NOTA: Este script criará o arquivo de saída region_syn-re.fas. </li></ol></li><li> Escolha uma enzima de restrição que é compartilhada entre as sequências de sinônimo de ambos os genes do tipo selvagem; Este site será usado para montar quimeras através da digestão de enzimas de restrição. Verifique se a enzima de restrição escolhida não corta nem os genes do tipo selvagem nem as sequências do vetor pUC18 / 19. <ol><li> Compare as enzimas de restrição encontradas nos arquivos genes_re.fas, pUC_re.fas e regions_syn-re.fas. </li></ol></li><li> Em silico, substitua os originais por suas seqüências de DNA sinônimo nos loci correspondentes em ambos os genes de tipo selvagem. Anexe sinônimo de seqüências de DNA ao arquivo de seqüência de tipos selvagens (genes.fas). </li><li> Obtenha a sequência de aminoácidos dos genes contidos no arquivo genes.fas ( perl translate.pl genes.fas ). </li><li> Alinhar as sequências de aminoácidos traduzidas a partir de sequências de DNA de tipo selvagem e sinônimo. Verifique se ambas as seqüências são as mesmas. </li><li> Repita todas as etapas desta seção com o gene ampR presente no pUVetor C18 / 19. NOTA: O objetivo é interromper o gene ampR (arquivo ampR.fas) em duas partes complementares. A enzima de restrição selecionada para interromper o gene ampR deve ser diferente da utilizada para a montagem da quimera. </li></ol></li><li> Clonagem independente dos dois genes de tipo selvagem no vetor pUC18 / 19 selecionado (Figura 1, passo 3). <ol><li> Purificar o DNA plasmídico pUC18 / 19 escolhido usando um kit de purificação de DNA plasmídico. <ol><li> Por exemplo, transformar E. coli DH5a com plasmídeo pUC18 e crescer os transformantes durante a noite a 37 ° C em Ampicilina sólida LB-0.3 mg / mL (Amp). Escolha uma colônia de transformantes, inocule uma nova placa Amp LB-0.3 mg / mL e aumente durante a noite a 37 ° C. </li><li> Faça parte da cultura anterior e cresça-a em LB-0.3 mg / mL Amp líquido por 6-8 h a 37 ° C. Extraia o DNA do plasmídeo usando um kit. </li></ol></li><li> PCR amplifica genes de tipo selvagem a partir do DNA genômico total usando o apropriadoOligonucleótidos externos de riato. Use, se possível, uma polimerase de DNA de alta fidelidade. Selecione a DNA polimerase que maximiza o rendimento. Execute PCR de acordo com as diretrizes do fabricante e a temperatura de fusão dos oligonucleótidos. <ol><li> Execute ciclos de PCR, dependendo da polimerase de DNA, tamanho de amplicão, modelo e oligonucleótidos utilizados. Por exemplo, para amplificar o DNA de rpoD , prepare uma reação de 50 μL: 5 μL de tampão 10x, 2 μL de MgSO4 50 mM, 1 μL de mistura dNTP 10 mM, 2 μL de cada oligonucleótido 10 μM (Tabela 2), 2 ΜL de ADN modelo (DNA total de E. coli DH5a), 35,8 μL de água ultra-pura e 0,2 μL de DNA-polimerase de alta fidelidade. Execute os seguintes ciclos de PCR: 1 min a 94 ° C para a desnaturação inicial seguido de 30 ciclos de amplificação (30 s a 94 ° C para desnaturação, 30 s a 60 ° C para recozir os oligonucleótidos e 2 min a 68 ° C Para estender). </li><li> Dissolver 1,2 g deAgarose em 100 mL de água de dupla destilação, aquecendo-os no microondas. Monte uma bandeja de gel e pente e coloque-os no rotor de gel horizontal. Encha a bandeja de gel com a solução de agarose derretida e deixe solidificar. Remova o pente. </li><li> Coloque o gel na câmara de eletroforese. Câmara de enchimento com tampão 1x Tris-acetato-EDTA. Carregar 50 μL de produtos de PCR nos poços de gel. Eletroforese as amostras ( por exemplo , a 110 V por 1 h). </li><li> Após a eletroforese, mancha o gel em 100 mL de água duplamente destilada contendo 100 μL de solução de brometo de etidio 1 mg / mL durante 10 minutos com agitação lenta. Lave o gel em água duplamente destilada durante mais 10 minutos em agitação lenta; Use um agitador horizontal. Cuidado: O brometo de etidio é um composto tóxico; Use luvas de proteção e um casaco de laboratório de algodão. </li><li> Purifique o DNA do gene do tipo selvagem das faixas correspondentes do gel usando um kit. Visualize as bandas colocando o gel corado em uma câmara UV (Comprimento de onda recomendado: 300 nm). Mantenha a exposição do gel ao mínimo. Use um kit de purificação de DNA e siga as instruções do fabricante. Atenção: a radiação UV é perigosa; Use um escudo protetor, óculos e um casaco de laboratório de algodão. </li></ol></li><li> Digest purificado wildtype genes e pUC18 / 19 plasmídeo DNA com as enzimas de restrição de acordo com as instruções do fabricante. Use possíveis enzimas de digestão rápida quando possível. Por exemplo, digerir 6 μL de DNA de pUC18 (300 ng / μL) em 10 μL de água ultrapura, 2 μL de tampão 10X, 1 μL de enzima de restrição Kpn I e 1 μL de enzima de restrição Xba I. Deixe a reacção a 37 ° C durante 30 min. <ol><li> Inactive as enzimas de restrição de acordo com as diretrizes do fabricante. Por exemplo, inactivar a reacção de digestão dupla Kpn I- Xba I a 80 ° C durante 5 min. </li></ol></li><li> Inserção de mistura: DNA de vetor em uma rati volumétricaO de 3: 1. Siga as instruções do fabricante para uma reação de ligadura. Utilize enzimas de ligação rápidas quando possível (deixe a reação a 25 ° C durante 10 min). NOTA: Tipicamente, a concentração de DNA após a purificação usando os kits é suficientemente boa para reações de digestão e ligadura. Por exemplo, adicione 6 μL de ADN de rpoD ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 3 μL de ADN de pUC18 ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 10 μL de tampão 2x, 1 μL de ultrapura Água e 1 μL de T4 DNA ligase. Deixe a reacção de ligação a 25 ° C durante 10 min. </li><li> Transforme o DH5a de E. coli com 2-4 μL da reação de ligação, conforme descrito nos Materiais Suplementares. Placa as células transformadas em placas sólidas LB / Amp / X-gal / IPTG. Deixe as placas durante a noite a 37 ° C. </li><li> Selecione as colônias de E. coli transformantes de cor branca e arrase-as em uma nova placa LB / Amp. Deixe as placas durante a noite a 37 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Execute uma PCR de colônia para escolher os candidatos para seqüenciar a reação, conforme descrito nos Materiais Suplementares. Extrair o DNA do plasmídeo dos candidatos. Alternativamente, digerir o DNA do plasmídeo candidato com as mesmas enzimas de restrição usadas para clonar as inserções. </li><li> Construções de candidatos de seqüência com um provedor de serviços de seqüenciamento 10 . Monte a sequência em silico usando um ensamblador de DNA 11 ( Figura 1 , etapa 5). </li></ol></li><li> Interrupção do plasmídeo por PCR seguido de digestão com enzimas de restrição. <ol><li> Desenhe em silico os oligonucleótidos avançados e reversos em regiões de ruptura para genes de tipo selvagem e ampR , respectivamente. Substituir em silico o fragmento de tipo selvagem pela sua correspondente sequência de DNA de sinônimo (obtida no passo 1.4). NOTA: Esta seqüência de DNA sinônimo contém um site de enzimas de restrição. Os oligonucleótidos avançados e reversos se sobrepõem em tO site da enzima de restrição. Os oligonucleótidos devem variar de 21 a 27 nucleótidos, terminam com uma citosina ou guanina e contêm um site de enzimas de restrição. Um oligonucleótido para a frente tem a mesma sequência que a sua região alvo no modelo de DNA. Um oligonucleótido reverso é a sequência complementar reversa da região alvo no modelo de DNA. </li><li> Use as duas construções de genes de tipo selvagem como o modelo de DNA para reações de PCR ( por exemplo, pUC18 rpoD e pUC18 sigA ). Obtenha duas partes complementares de cada construção (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 e pUC18 sigA σ3-σ4) ( Figura 1 , etapa 6). </li><li> Carregar amostras de DNA em um gel de agarose 1-1.2% [p / v]. Separar os produtos de PCR do modelo de DNA por eletroforese ( por exemplo, 110 V por 1 h). Alternativamente, digerir as reações de PCR com Dpn I para quebrar o modelo de DNA. NOTA: DpnA enzima reconhece apenas sequências de DNA metiladas (5&#39;-GATC-3 &#39;). <ol><li> Purifique as amostras usando um kit de purificação de DNA. Siga as diretrizes do fabricante. </li></ol></li><li> Duplique todos os fragmentos de DNA complementares com as enzimas de restrição apropriadas de acordo com as instruções do fabricante. Utilize enzimas de restrição de digestão rápida quando possível. Por exemplo, digerimente o fragmento de DNA pUC18rpoDσ1-σ2 com Afl II e Spe I usando o protocolo do fabricante. Deixe a reação de digestão a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Inactive as enzimas de restrição de acordo com as diretrizes do fabricante. Por exemplo, inactive Afl II- Spe I a 80 ° C durante 20 min. </li></ol></li><li> Recuperação de plasmídeos usando ligadura de DNA e transformação bacteriana. <ol><li> Misture os fragmentos de DNA adequados numa proporção volumétrica 1: 1 para montar o gene quimérico desejado ( figura1, passo 7). NOTA: Desta forma, a integridade do gene ampR é restaurada, produzindo uma proteína funcional. <ol><li> Por exemplo, misture 4 μL de pUC18 rpoD σ1-σ2 DNA (digerido com Afl II- Spe I, 150 ng / μL), 4 μL de pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL), 10 μL de tampão 2x, 2 μL de água ultrapura e 1 μL de T4 DNA ligase; A concentração de DNA após a purificação do kit é suficientemente boa para digestão e subseqüente ligadura. Deixe a reação de ligação a 25 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Transforme E. coli DH5a com 3-5 μL da reação de ligadura da montagem da quimera (Materiais Suplementares). Crescer as células transformantes em placas LB / Amp / X-gal / IPTG durante a noite a 37 ° C durante a noite. </li><li> Selecione as colônias de E. coli transformantes de cor branca e arrase-as em uma nova placa LB / Amp. Deixe as placas durante a noite em 37° C. </li><li> Execute uma PCR de colônia para escolher candidatos para uma reação de seqüenciamento, conforme descrito nos Materiais Suplementares. Visualize bandas em um gel de agarose de 1-1,2% (p / v) realizando eletroforese (descrito no passo 2.3.2.1). </li><li> Cultive culturas de candidatos positivos. Extrair DNA de plasmídeo deles usando um kit de purificação de DNA de plasmídeo. </li></ol></li></ol> 2. Construcções quiméricas candidatas a sequências <ol><li> Certifique-se de que a qualidade do DNA do plasmídeo seja suficientemente boa para a reação de seqüenciamento, seguindo as diretrizes do provedor de serviços de sequências. Extraia DNA usando kits de purificação. Por exemplo, na página da internet do provedor de serviço de seqüência, preste especial atenção à concentração de DNA recomendada para as amostras. Obtenha a concentração de amostras usando um instrumento de quantificação de DNA. </li><li> Construções quiméricas candidatas de seqüência com um provedor de serviço de seqüenciamento 10 . </li><li> Assemble se<html> Lendo com uma incubadora de DNA in silico 11 . </li><li> Alinhe as seqüências quiméricas montadas em silo em silico usando ferramentas de alinhamento de seqüência 9 , 12 . Verifique se o gene quimérico foi fundido com sucesso. </li></ol> 3. Preparação de preparações NOTA: Todas as etapas envolvendo células vivas devem ser realizadas em uma capa limpa de fluxo laminar com o queimador Bunsen. <ol><li> Produção de células competentes de E. coli DH5a. <ol><li> Para produzir células compatíveis com E. coli , siga os protocolos 13 publicados ou consulte os Materiais Suplementares . Alternativamente, use células competentes comercialmente disponíveis. </li></ol></li><li> Células competentes de E. coli DH5α transformadoras. <ol><li> Para a transformação química das culturas de E. coli , siga os protocolos publicadosClass = &quot;xref&quot;&gt; 13 ou veja os Materiais Suplementares . Alternativamente, use eletroporação para transformação bacteriana. Se forem utilizadas células competentes comercialmente disponíveis, siga as diretrizes do fabricante. </li></ol></li><li> ADN genômico e plasmídico purificante de E. coli DH5a. <ol><li> Execute a extração de ácido nucleico, como indicado nos Materiais Suplementares , usando kits comercialmente disponíveis ou seguindo protocolos publicados 13 . </li></ol></li><li> Execute PCR de colônia. <ol><li> Use esta técnica para identificar colônias de transformantes candidatas para reação subseqüente de seqüenciamento. NOTA: Este método não representa uma verificação final da integridade das seqüências. Uma descrição detalhada desta técnica está disponível nos Materiais Suplementares . </li></ol></li><li> Preparando as soluções. <ol><li> Vejo <s&gt; Tabela 1 para obter mais informações sobre a preparação da solução. </li></ol></li><li> Faça o download dos scripts e arquivos de seqüência necessários para o protocolo CAPRRESI. <ol><li> Baixe arquivos de banco de genes contendo a sequência de genoma completa das espécies desejadas, extraie a seqüência de DNA do gene escolhido usando um navegador de genoma e guarde-o no formato de arquivo fasta. Baixe os scripts Perl necessários para o protocolo CAPRRESI. Armazene os scripts e os arquivos de seqüência no mesmo diretório. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

CAPRRESI foi projetado como uma alternativa ao PRM 2 . O PRM original é uma técnica poderosa; Ele permite a fusão de seqüências de DNA ao longo de qualquer parte dos genes selecionados. Para PRM, os genes de tipo selvagem devem ser clonados no mesmo plasmídeo. Depois disso, os oligonucleótidos são projetados dentro de genes de resistência de tipos selvagens e antibióticos encontrados no plasmídeo. A interrupção do plasmídeo é conseguida através de PCR utilizando polimerases de DNA de extrema extr...

A montagem de genes quiméricos tem sido amplamente utilizada na biologia molecular para elucidar a função protéica e / ou para fins biotecnológicos. Existem diferentes métodos para a fusão de genes, tais como a ampliação de produto de PCR em sobreposição 1 , a recuperação de plasmídeo 2 , a recombinação homóloga 3 , os sistemas 4 de CRISPR-Cas9, a recombinação 5 dirigida ao local e a montagem 6 de Gibson. Cada um destes oferece vantagens técnicas diferentes; Por exemplo, a flexibilidade do design de PCR sobreposto, a seleção in vivo de construções durante a recuperação do plasmídeo ou a alta eficiência dos sistemas CRISPR-Cas9 e Gibson. Por outro lado, podem surgir algumas dificuldades ao executar alguns desses métodos; Por exemplo, as duas primeiras abordagens dependem de fragmentos de DNA de extremidade frouxa, e a ligação destes tipos de produtos pode ser tecnicamente desafiadora em comparação com a SticLigação com ky-ended. A recombinação direta do site pode deixar vestígios de seqüências de DNA extra (cicatrizes) no original, como no sistema CreWloxP 5 . CRISPR-Cas9 às vezes pode modificar outras regiões do genoma além do site alvo 4 . Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de local de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo para a fusão de genes codificadores de proteínas que combina o método de recuperação de plasmídeo (PRM) com a inserção de sítios de enzimas de restrição em sequências de DNA sinônimo, aumentando a eficiência de ligadura . Para garantir a integridade da sequência de aminoácidos, os sítios de enzimas de restrição são inseridos em trechos de seqüência de DNA sinônimo. Entre os benefícios do CAPPRESI, é que pode ser realizada usando reagentes / ferramentas de laboratório comuns ( por exemplo , enzimas, células competentes, soluções e termociclador) e que pode dar resultados rápidos (quando as enzimas apropriadas são usadas). Baseando-se na restriçãoOs sites enzimáticos que emergem de seqüências de DNA sinônimas podem limitar a seleção dos pontos de fusão exatos dentro das proteínas de interesse. Nesses casos, os genes alvo devem ser fundidos usando oligonucleótidos sobrepostos, e os locais de enzimas de restrição devem ser inseridos no gene de resistência do vetor. CAPRRESI consiste em sete etapas simples ( Figura 1 ): 1) seleção do vetor de clonagem, pUC18 ou pUC19 6 ; 2) análise in silico das sequências do tipo selvagem a serem fundidas; 3) seleção de regiões de quebra para montagem de quimera e ruptura de plasmídeo; 4) geração in silico de sequências de DNA sinônimo contendo sites de enzimas de restrição; 5) clonagem independente dos genes do tipo selvagem no plasmídeo selecionado; 6) interrupção do plasmídeo por PCR, seguida de digestão com enzimas de restrição; E 7) recuperação de plasmídeo usando ligadura de DNA e transformação bacteriana. Os genes quiméricos produzidos por esta técnica devem ser verificados wSeqüenciamento. Os vetores pUC18 / 19 oferecem vantagens técnicas para a clonagem e a montagem de quimeras, como tamanho pequeno ( ie, 2.686 pares de bases), número de cópias elevado, características de reação de seqüenciamento vantajosas e disponibilidade comercial 7 . Aqui, um hospedeiro Escherichia coli foi usado para montar e lidar com as quimeras porque as culturas bacterianas são baratas e crescem rapidamente. Diante disso, será necessária a clonagem subsequente dos fragmentos de fusão nos plasmídeos alvo finais ( por exemplo, vetores de expressão como pRK415 em bactérias ou pCMV em células de mamífero). CAPRRESI foi testado para a fusão de dois genes primários do fator sigma: E. colirpoD e Rhizobium etlisigA . Os fatores sigma primários são subunidades de ARN polimerase responsáveis ​​pela iniciação da transcrição e consistem em quatro domínios ( ie, σ1, σ2, σ3 e σ4) 8 . A sequência de aminoácidos lengtH de proteínas codificadas por rpoD e sigA são 613 e 685, respectivamente. RpoD e SigA compartilham 48% de identidade (98% de cobertura). Esses fatores sigma primários foram divididos em dois fragmentos complementares entre as regiões σ2 e σ3. Dois genes quiméricos foram montados de acordo com este projeto: quimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) e quimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Os produtos de fusão de DNA foram verificados por sequenciação.

<table><tbody><tr><td>Polimerase de DNA Taq de platina Alta fidelidade</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Produz uma mistura de produtos de PCR com extremidade em saliência romba / 3'-A</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de plasmídeo de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Usado para todas as reações de purificação de plasmídeo</td></tr><tr><td>Kit de purificação de produto de PCR de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Usado para todas as reações de purificação de PCR de géis</td></tr> <tr><td>de agaroseEnzima de restrição AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Reconhece a sequência 5'-CTTAAG-3' e corta a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>KpnI-HF enzima de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Reconhece a sequência 5'-GGTACC-3' e corta a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>SpeI-HF enzima de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Reconhece a sequência 5'-ACTAGT-3' e corta a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>XbaI enzima de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Reconhece a sequência 5'-TCTAGA-3' e corta a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>Ampicilina de sódio sal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Ácido nalidíxico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Cultura de células bacterianas</td></tr><tr><td>Peptona de caseína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Cultura de células bacterianas</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>Cultura de células bacterianas</td></tr><tr><td>XbaI enzima</td><td>de restrição Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Enzima de XbaI enzima</td></tr> <tr><td>KpnI</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td> Kit de ligação rápida <td>KpnI enzyme</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Kit de ligação rápida de DNA</td></tr><tr><td>AflII enzima de restrição</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>AflII de digestão rápida enzyme</td></tr><tr><td>SpeI enzima de restrição</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Aqui, apresentamos a montagem da quimera por recuperação do plasmídeo e inserção do sistema enzimático de restrição (CAPRRESI). CAPRRESI beneficia de muitos pontos fortes do método original de recuperação de plasmídeos e introduz a digestão de enzimas de restrição para facilitar as reações de ligação de DNA (necessárias para a montagem da quimera). Para este protocolo, os usuários clonam os genes do tipo selvagem no mesmo plasmídeo (pUC18 ou pUC19). Após a seleção in silico de regiões de sequências de aminoácidos onde as quimeras devem ser montadas, os usuários obtêm todas as seqüências de DNA sinônimo que as codificam. Os scripts perl ad hoc permitem aos usuários determinar todas as seqüências de DNA sinônimo. Após este passo, outro script Perl procura sites de enzimas de restrição em todas as seqüências de DNA sinônimo. Esta análise in silico também é realizada utilizando o gene de resistência à ampicilina ( ampR ) encontrado em plasmídeos pUC18 / 19. Os usuários projetam oligonucleótidos dentro de regiões sinônimas para interromper genes de tipo selvagem e ampR por PCR. Depois do obtAinando e purificando fragmentos de DNA complementares, a digestão com enzimas de restrição é realizada. A montagem da quimera é conseguida ligando fragmentos de DNA complementares apropriados. Os vetores pUC18 / 19 são selecionados para CAPRRESI porque oferecem vantagens técnicas, como tamanho reduzido (2.686 pares de bases), alto número de cópias, características vantajosas de reação de sequenciação e disponibilidade comercial. O uso de enzimas de restrição para o conjunto de quimeras elimina a necessidade de polimerases de DNA que produzem produtos de extremidade contundente. CAPRRESI é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

A Figura 1 mostra CAPRRESI. Usando este método, dois genes quiméricos foram montados trocando os domínios de dois fatores sigma primários bacterianos ( isto é, E. coli RpoD e R. etli SigA). As seqüências de DNA dos genes rpoD e sigA foram obtidas usando o Artemis Genome Browser 14 dos arquivos Genoma GenBank NC_000913 e NC_007761, respectivamente. A sequência de DNA do vetor pUC18 foi obtida a partir do banco de...

Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Este vídeo demonstra um procedimento chamado Montagem de Quimeras por Recuperação de Plasmídeo e Inserção de Sítios de Restrição, ou CAPRRESI, no qual dois genes quiméricos são gerados mediante a introdução de sítios específicos de enzimas de restrição em DNA sinônimo e, em seguida, o corte e a troca das sequências de DNA. No CAPRRESI, os genes do tipo selvagem de interesse são primeiramente inseridos nos sítios de clonagem múltipla do mesmo vetor. Em seguida, são selecionadas as regiões de quebra para cada gene com a mesma sequência de aminoácidos e seleciona-se a região de quebra para o gene de resistência à ampicilina.Scripts em Perl são utilizados para determinar sequências sinônimas contendo sítios de restrição para cada região de quebra. Utilizando oligos especialmente desenhados, é realizada PCR para produzir quatro partes complementares que contêm DNA sinônimo com os sítios desejados para a enzima de restrição. Os produtos de PCR resultantes são purificados, digeridos e, em seguida, ligados para gerar uma sequência quimérica.A principal vantagem desta técnica é que ela facilita as fusões gênicas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia molecular, como, por exemplo, quais são as funções da nossa proteinase. Inicie este procedimento com os genes de interesse já inseridos nos locais de clonagem múltipla dos vetores.Aqui, os genes rpoD e sigA, que codificam fatores de sinalização bacterianos necessários para iniciar a síntese de RNA, foram clonados no vetor pUC18 conforme detalhado no texto acompanhante. Para projetar o oligonucleotídeo para a produção da proteína quimérica, execute primeiro o script Perl translate.pl para obter a sequência de aminoácidos dos genes rpoD, sigA e ampR.Em seguida, utilizando o servidor web Muscle, alinhe as sequências de aminoácidos de rpoD e sigA. Para cada sequência, selecione uma região de quebra com a mesma sequência de três a seis aminoácidos. Salve as sequências no arquivo regions.fas.Em seguida, selecione uma sequência de três a seis aminoácidos dentro do gene ampR e salve essa sequência no arquivo regions.fas. Para determinar todas as sequências de DNA sinônimas, execute o script perl synonym.pl. Depois, para identificar quais enzimas de restrição cortam as sequências sinônimas, execute o script resynonym.pl.Em seguida, utilize as sequências de DNA sinônimas para projetar oligonucleotídeos que incorporem o mesmo sítio de enzima de restrição nas regiões de quebra de rpoD e sigA. Projete um oligonucleotídeo para interromper o gene ampR que incorpore um sítio de enzima de restrição diferente. Os oligonucleotídeos direto e reverso se sobrepõem no sítio de enzima de restrição.Os oligonucleotídeos devem ter entre 21 e 27 nucleotídeos e conter citosina ou guanina, além de um sítio para enzima de restrição. Um oligonucleotídeo direto possui a mesma sequência da região-alvo no DNA molde. Um oligonucleotídeo reverso é a sequência complementar invertida da região-alvo no DNA molde.Pedir os oligos a um fornecedor de síntese de DNA. Quando os oligonucleotídeos chegarem, utilizá-los para realizar PCR usando os plasmídeos rpoD e sigA em pUC18 como DNA molde. Isso produzirá duas partes complementares para cada construção.Após a PCR, realize eletroforese em gel de agarose para separar os produtos da PCR do molde de DNA. A purificação das partes complementares do plasmídeo é essencial para evitar contaminação pelo plasmídeo parental. Os plasmídeos parentais podem ser eliminados por meio da purificação em gel, como estamos demonstrando aqui, ou pela digestão com a enzima de restrição dpn1, que pode ser usada para degradar os plasmídeos parentais.Após a eletroforese, corar o gel com solução de brometo de etídio. Visualizar as bandas colocando o gel corado em uma câmara de UV a 300 nanômetros. Manter a exposição do gel ao mínimo.Em seguida, recorte os trechos contendo os produtos de PCR e coloque-os em tubos de microcentrífuga. Utilize um kit para purificar as amostras de DNA e, em seguida, com as enzimas de restrição fast digest apropriadas, realize uma dupla digestão em todos os fragmentos de DNA complementares. AFL2 e SPE1 são usadas para fundir as partes complementares do plasmídeo.Incube a reação de digestão a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, inative as enzimas de restrição de acordo com as orientações do fabricante. Por exemplo, inative AFL2, SPE1 a 80 graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, combine os fragmentos de DNA apropriados com tampão de ligação, água e ligase T4 de DNA. Incube a reação de ligação a 25 graus Celsius por 10 minutos. Dessa forma, a integridade do gene ampR é restaurada, produzindo uma proteína funcional.Após a ligação, transforme E. coli DH5 alpha com três a cinco microlitros da reação de ligação do conjunto da quimera. Plaque as células transformadas em placas de LB com ampicilina, x-gal e IPTG e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, selecione colônias brancas de E. coli transformadas e risque-as em uma nova placa de LB com ampicilina.Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Para escolher candidatos para o sequenciamento, realize PCR de colônia. Visualize as bandas em um gel de agarose 2% em proporção um para um, realizando eletroforese como antes.Selecione colônias candidatas que apresentem a dobra de DNA do tamanho correto para inoculação de culturas. No dia seguinte, extraia o DNA plasmidial delas utilizando um kit. Após a purificação do plasmídeo, envie as amostras para sequenciamento.Construtos quiméricos rpoD sigA foram gerados conforme detalhado neste vídeo. Após o sequenciamento, o alinhamento dos genes do tipo selvagem e quiméricos foi realizado utilizando o software MUSCLE. As sequências dos genes quiméricos foram então montadas com o software MURA, como mostrado aqui.As sequências sinônimas aparecem em preto e o sítio AFL2 aparece sublinhado. Esses dados de sequenciamento demonstram o uso bem-sucedido do método CAPRRESI para gerar construtos quiméricos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa opção para fundir segmentos gênicos.

caprresi-chimera-assembly-plasmid-recovery-restriction-enzyme-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

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Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Metodologias de direcionamento de genes podem ser usadas para gerar camundongos transgênicos com alelos knockout, knock-in e marcados.  Aqui, descrevemos um método aprimorado de recombinação em E. coli, que chamamos de 'subclonagem mais inserção', que pode ser usado para gerar vetores de direcionamento de genes personalizados rapidamente.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

A síntese de plasmídeos personalizados é trabalhosa e demorada. Este protocolo descreve o uso da clonagem de montagem Gibson para reduzir o trabalho e a duração do procedimento de clonagem de DNA personalizado. O protocolo descrito também produz construções de proteínas marcadas confiáveis para a expressão de mamíferos a um custo semelhante à clonagem tradicional de DNA de cortar e colar.

Geração de plasmídeo vectores que expressam proteínas marcadas-bandeira nos termos do regulamento de Alongamento Human Fator-1α Promotor Usando Assembleia Gibson

A introdução de múltiplas alterações genômicas em cianobactérias é uma ferramenta essencial no desenvolvimento de cepas para fins industriais e de pesquisa básica. Descrevemos um sistema para geração de mutantes não marcados na espécie modelo de cianobactéria Synechocystis sp. PCC6803 e mutantes marcados em Synechococcus sp. PCC7002.

Geração de mutantes sem marcadores marcados e no modelo de cianobactérias da espécie

Proteínas estruturalmente relacionadas frequentemente exercem funções biológicas distintas. A troca das regiões equivalentes destas proteínas a fim de criar proteínas quiméricas constitui uma abordagem inovadora para identificar regiões críticas da proteína que são responsáveis pela sua divergência funcional.

Identificação de regiões de proteína funcional através de construção de proteínas quiméricas

Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

Sistemas CRISPR-Cas e proteínas anti-CRISPR foram integrados ao esquema de portões booleanos em Saccharomyces cerevisiae. Os novos circuitos lógicos pequenos mostraram bom desempenho e aprofundaram a compreensão dos fatores de transcrição baseados em dCas9/dCas12a e das propriedades das proteínas anti-CRISPR.

Circuitos Digitais Gênicos Baseados em Sistemas CRISPR-Cas e Proteínas Anti-CRISPR

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

A montagem in vivo é um método de clonagem independente de ligação que depende de enzimas intrínsecas de reparo de DNA em bactérias para montar fragmentos de DNA por recombinação homóloga. Este protocolo é eficaz em termos de tempo e custo, uma vez que são necessários poucos reagentes e a eficiência da clonagem pode chegar aos 99%.

Uso de montagem in vivo para construção de plasmídeo de alta eficiência

Aprenda o método CAPRRESI para fusão de genes quiméricos em engenharia genética. Esta técnica utiliza sítios de enzimas de restrição em sequências sinônimas de DNA para gerar construtos híbridos de forma rápida e econômica.

CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

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