In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

O objetivo geral deste procedimento é investigar e prever a eficácia dos sistemas de administração de medicamentos baseados em GnRH em culturas de células cancerígenas humanas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia anticancerígena direcionada, como a eficiência com que as células de diferentes tipos de câncer humano tomam medicamentos anticâncer direcionados ao GnRH. A principal vantagem desse método é que ele usa novos análogos de GnRH marcados com fluorescência que permitem o uso simultâneo de microscopia confocal e análise de citometria de fluxo.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia anticancerígena porque os receptores de GnRH são altamente expressos em vários tipos de células cancerígenas, permitindo o direcionamento seletivo delas. Demonstrando o procedimento estará Bianka Gurbi, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Para começar, remova o meio cultivado de cada um dos sete poços de uma lâmina microscópica semeada.

Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido ao poço de controle negativo e 250 microlitros do meio de tratamento de sementes pré-aquecido GnRH a cada um dos seis poços restantes. Incube o slide em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono por cinco horas. Após cinco horas de incubação, aspirar o meio de cada poço e lavar as células com 250 microlitros de PBS.

Em seguida, adicione 250 microlitros de solução de fixação em cada poço e incube a lâmina em temperatura ambiente por 10 minutos. Uma vez fixadas as células, descarte a solução de fixação e lave as células com 250 microlitros de PBS. Adicione 250 microlitros de solução de sonda fluorescente de cinco micromolares preparada em PBS em cada poço e incube a lâmina em temperatura ambiente por 10 minutos.

Depois de remover a solução de sonda fluorescente, lave cuidadosamente as células duas vezes com 250 microlitros de PBS. Finalmente, adicione três a quatro gotas de meio de montagem em cada poço. Mantenha a lâmina no escuro em temperatura ambiente até que seja fotografada ao microscópio.

Remover o meio cultivado de cada um dos cinco alvéolos de uma lâmina microscópica semeada. Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido ao poço de controle negativo e ao segundo poço com as células não tratadas. Pré-trate as células nos três alvéolos restantes com o meio de tratamento pré-aquecido contendo 10 micromolares GnRH FITC.

Incube a lâmina em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, remova o meio apenas das células tratadas e lave as células com 250 microlitros do meio completo pré-aquecido. Em seguida, remova o meio de lavagem.

Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido em cada um dos três poços. Incube a lâmina em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono por uma hora. Após a incubação, descarte o meio de todos os cinco poços e lave as células com 250 microlitros de PBS.

Em seguida, remova o PBS e fixe as células com 250 microlitros de solução fixadora em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, descarte a solução de fixação e lave as células com 250 microlitros de PBS. Adicione 250 microlitros de solução de bloqueio em cada poço e incube a lâmina em temperatura ambiente por uma hora.

Aspirar a solução de bloqueio de cada poço, exceto o controle negativo. Depois de lavar as células com 250 microlitros de PBS, adicione 250 microlitros de solução de anticorpo primário a cada poço. Incube a lâmina em temperatura ambiente por uma hora em um local escuro.

Remova as soluções de cada um dos cinco poços e lave as células com 250 microlitros de PBS. Em seguida, remova o PBS e adicione 250 microlitros de solução de anticorpo secundário. Incube a lâmina em temperatura ambiente por uma hora no escuro.

Aspire a solução de cada poço e lave as células com 250 microlitros de PBS. Remova o PBS de lavagem e, em seguida, adicione 250 microlitros de PBS contendo cinco sondas fluorescentes micromolares em cada poço. Incube a lâmina por 10 minutos em temperatura ambiente.

Remova a solução de sonda fluorescente de cada poço e lave cuidadosamente as células duas vezes com 250 microlitros de PBS. Finalmente, adicione três a quatro gotas de meio de montagem em cada poço. Mantenha a lâmina no escuro em temperatura ambiente até que seja fotografada ao microscópio.

Visualize as células sob um microscópio de varredura a laser confocal invertido. Ligue os lasers de 488 nanômetros e 633 nanômetros. Verifique o laser amplificação e o tamanho do orifício.

Imagem da amostra de controle negativo. Otimize o sinal observado para o núcleo e ajuste o sinal do FITC e Alexa 546 para que fique próximo de zero. Em seguida, usando os mesmos parâmetros, crie imagens das amostras tratadas.

Descarte o meio completo de todos os sete poços de uma placa de cultura semeada. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo pré-aquecido no poço de controle negativo e um mililitro do meio de tratamento pré-aquecido nos seis poços restantes. Incube a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono por cinco horas.

Depois de descartar o meio de todos os poços, lave cuidadosamente as células duas vezes com dois mililitros de PBS. Remova o PBS e adicione 500 microlitros de solução de tripsina EDTA em cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius até que as células se desprendam, o que levará aproximadamente 10 minutos.

Usando um mililitro de meio completo, neutralize a tripsina em cada poço e agite a placa. Em seguida, suspenda as células por pipetagem suave. Transferir as suspensões para tubos FACS separados e centrifugar as amostras a 150 vezes G a quatro graus Celsius durante quatro minutos.

Transvasar cuidadosamente os sobrenadantes. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS gelado em cada tubo FACS e ressuspenda suavemente as células. Mantenha os tubos no gelo até serem analisados pelo FACS.

Apresentamos aqui a análise da captação de GnRH em células de carcinoma de faringe. O tratamento de cinco horas com um micromolar de complexo fluorescente de GnRH resultou em ingestão leve, mas distinguível, manifestada como sinal fluorescente verde localizado em células cancerígenas da faringe. O aumento adicional da dosagem complexa levou a uma maior absorção, demonstrando dependência da dose da captação de GnRH em células de carcinoma de faringe.

A captação dependente do receptor de GnRH e a distribuição celular do ligante em seu receptor em células de câncer de pulmão foram analisadas por tratamento simultâneo com complexo fluorescente de GnRH e coloração do receptor e núcleos de GnRH tipo um. Os resultados mostram que o receptor de GnRH tipo um está associado à membrana celular, enquanto a proteína GnRH é internalizada nas células e permanece em seu citoplasma. A captação de GnRH em células de carcinoma de faringe também foi estudada usando análise FACS.

Os resultados mostram que a captação de GnRH observada quando as células foram tratadas com um micromolar de conjugado de GnRH foi fortemente aumentada quando a dose aplicada às células foi aumentada para 10 micromolares. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em oito horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de proteger as amostras tratadas e os corantes fluorescentes da luz direta.

Após este procedimento, outros métodos, como viabilidade celular ou ensaios de apoptose, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a eficiência com que o medicamento direcionado ao GnRH pode inibir o crescimento de um determinado tipo de câncer. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia do câncer explorarem a eficácia dos sistemas de administração de medicamentos baseados em GnRH nas células cancerígenas aderentes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar esses conjugados de GnRH marcados com fluorescência para explorar a suscetibilidade das células cancerígenas para terapias direcionadas ao GnRH.