Name: In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a quantificar a captação de análogos de GnRH marcados com fluoróforo em linhagens de células cancerígenas humanas usando microscopia confocal e citometria de fluxo. Este método avança terapias anticâncer direcionadas.

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O projeto foi apoiado pelo National Research Fund OTKA (K 104045).

1. Preparação de Culturas de Células e Reagentes <ol><li> Manter as culturas de células em meio recomendado pelo fabricante, suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e antibióticos (meio completo chamado). Manter o frasco de cultura de células numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C. Seguir a proliferação de células de confluência e por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase). </li><li> Quando as células atingem a confluência adequada, remover o meio, e lava-se a cultura com 2-3 ml, estéril tamponada de fosfato-salina (PBS). Remover o PBS e adicionar 0,5 mL, solução estéril de 0,25% de tripsina-EDTA para a cultura de células e incubar a 37 ° C até que as células de separar (aproximadamente 10 min). </li><li> Suspender as células em 3-4 mL de meio completo estéril para parar tripsina e transferi-los para um tubo de centrífuga estéril. Centrifugar as células a 150 xg durante 4 minutos à temperatura ambiente (TA). Descartar o sobrenadante com cuidado e suspender o pEllet em 2-3 mL de meio completo estéril. </li><li> Retire 100 uL da suspensão de células e misturar-se com 100 uL de 0,4% (m / V) de tripano azul solução, para corar as células mortas. Carga de 10 ul desta mistura em um hemocitómetro e determinar o número de células viáveis ​​por microscópio invertido. </li><li> Dilui-se a quantidade necessária de suspensão de células preparada no Passo 1.3 até 10 mL com meio completo estéril, contendo 4 x 10 4 células / mL. </li><li> Adicionar 250 uL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (10 4 células / cavidade) em sete poços do primeiro vidro de fundo de 8 poços lâmina de microscópio. Use este slide no método de captação de GnRH. </li><li> Adicionar 250 uL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (10 4 células / cavidade) em cinco poços da segunda corrediça de 8 poços microscópica. Esta corrediça vai ser utilizada no método de expressão do GnRH-IR. </li><li> Adicionar 1 mL de suspensão de células (preparado no passo 1.5) por poço (4 x 10 4 células / cavidade) em sete WELsl de uma placa de 12 poços. Esta placa irá ser utilizado no método de quantificação de GnRH. </li><li> Deixe as células aderir sobre as duas lâminas de microscopia e a placa. Incubar-los numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C durante 48 h. </li><li> Após a incubação de verificar as células por microscópio invertido (usando 10X objectiva de contraste de fase). Se as células são saudáveis ​​e anexado, continue com os seguintes passos. </li><li> Preparar solução mãe de 10 mM a GnRH-FITC em dimetil sulfóxido (DMSO) a partir de cada um dos três conjugados de 18. (Utilize estas concentrações de diluição: 16,43 mg / mL [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I, 16,97 mg / mL [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-II e 16,47 mg / mL [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Manter estas soluções estoque em um local escuro à temperatura ambiente e usá-los dentro de algumas semanas. </li><li> Diluir 1,7 mL de cada uma das três soluções de estoque 10 mM de GnRH-FITC em 1,7 ml de meio completo. Agitar estas soluções. (Tse são a 10 uM GnRH-FITC tratamento de meios.) Diluir 150 uL cada uma das três 10 uM de GnRH-FITC meio de tratamento de 1,35 ml de meio completo. Agitar estas soluções, bem como (estas são a 1 uM a GnRH-FITC meio de tratamento). NOTA: Todos GnRH-FITC contendo meio de tratamento deve ser protegido da luz e usou-se dentro de poucos h. </li><li> Pré-aqueça o seis GnRH-FITC meio de tratamento (preparado no passo 1.12) e 4 ml de meio completo a 37 ° C. </li><li> Dilui-se 3 mL de solução de sonda fluorescente a 5 mM (de contraste nuclear mencionado na Lista de Materiais) em 3 mL de PBS a 5 uM. Esta solução deve ser protegido da luz, mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas. </li></ol> 2. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) <ol><li> Método de captação de GnRH <ol><li> Tome a primeira lâmina de microscópio, preparada no passo 1.6 e pipeta o meio completo de cada um dos sete também. Adicionar 250 mL de medi completo pré-aquecidoUM para o primeiro poço. Usar isso como controlo negativo. Adicionar 250 mL de pré-aquecido a GnRH-FITC tratamento de meios (de 1,13) para cada um dos próximos seis poços (3 poços com 1 uM e 3 com 10 uM). Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 5 h. </li><li> Pipetar a meio de cada poço e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de solução de fixação (10% de formalina tamponada neutra) a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min. </li><li> Pipetar a solução de fixação a partir de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 5 uM solução de sonda fluorescente preparado no passo 1.14 a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min. </li><li> Pipetar a solução de sonda fluorescente de cada poço, e lavar as células duas vezes com 250 ul de PBS com cuidado. Adicionar 3-4 gotas de meio de montagem em cada poço, finalmente. Mantenha o slide no escuro à temperatura ambiente, até que a imagem. </li&gt; </ol></li><li> Método de expressão do GnRH-IR <ol><li> Aqui a segunda lâmina de microscópio, de 8 poços preparado no passo 1.7 e pipetar para a forma completa a partir de cada um dos cinco poços. </li><li> Adicionar 250 mL de meio completo pré-aquecido no primeiro poço, use esta como controle negativo. Adicionar 250 mL de meio completo pré-aquecido no segundo poço também, e usar isso para examinar expressão GnRH-IR antes do tratamento GnRH. </li><li> Adicionar 250 uL de cada uma das três pré-aquecido 10 uM meios tratam a GnRH-FITC para os próximos três poços. Use esses poços para pré-tratamento das células com conjugados de GnRH-FITC antes de examinar a expressão GnRH-IR. Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Pipetar para fora do meio de tratamento a partir de cada um dos três poços, que vai ser utilizado para examinar a expressão de GnRH-IR após o tratamento com GnRH e lavar estes poços com 250 uL de meio completo pré-aquecido. Adicionar 250uL de meio completo pré-aquecido em cada um dos três poços. Incubar a lâmina numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Pipetar para a forma de cada um dos cinco poços e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de solução de fixação a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 10 min. </li><li> Pipetar a solução de fixação a partir de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo albumina de soro bovino a 5% (BSA) em solução de bloqueio a cada poço e incubar a corrediça à TA, durante 1 h. </li><li> Diluir 10 uL de anticorpo primário GnRH-IV em 1 mL de PBS (1: 100 ratio). Mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas. </li><li> Pipetar para fora a solução de bloqueio de BSA a partir de cada cavidade, excepto o controlo negativo (primeira cavidade). Lavam-se as células com 250 ul de PBS (excepto o controlo negativo). Adicionar 250 uL de PBS contendo anticorpo primário GnRH-IV preparado no passo 2.2.7 em EACh poço (excepto o controlo negativo). Incubar a lâmina à TA, durante 1 hora, num local escuro. </li><li> Diluir 2,5 mL de anticorpo secundário marcado Alexa 546 em 1,25 ml de PBS (1: 500 ratio). NOTA: Esta solução deve ser protegido da luz, mantê-lo à temperatura ambiente e usá-lo dentro de algumas horas. </li><li> Pipeta soluções de cada um dos cinco poços e lava-se as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 546 AF anticorpo secundário marcado, preparado no passo 2.2.9 em cada poço. Incubar as lâminas à temperatura ambiente, durante 1 h na escuridão. </li><li> Pipetar a solução de cada cavidade e lavar as células com 250 uL de PBS. Adicionar 250 uL de PBS contendo 5 uM solução de sonda fluorescente preparado no passo 1.14 a cada poço e incuba-se a lâmina durante 10 min, à RT. </li><li> Pipetar a solução de sonda fluorescente de cada cavidade e lavar as células duas vezes com 250 ul de PBS com cuidado. Adicionar 3-4 gotas de meios de montagem para cada poço, depois. Mantenha o slide no escuroà temperatura ambiente até a imagem microscópica. </li></ol></li><li> imagiologia <ol><li> Imagem as células por confocal invertido microscópio de varredura a laser (usando 63X objetiva de imersão em óleo) <ol><li> Use as seguintes comprimentos de onda de excitação / emissão. conjugados GnRH: 488/514 nm, anticorpo marcado Alexa 546: 488/546 nm (uso apenas para o método de expressão GnRH-IR), DRAQ5 sonda fluorescente: 633/680 nm. </li><li> Configurar os parâmetros de imagem usando as células de controlo negativo. Use esses parâmetros para células de imagem tratada (Figura 3). Re-ajustar parâmetros de imagem em cada lâmina de microscópio, no início da análise. Aperfeiçoar e exportar as imagens com o software fornecido pelo fabricante, se necessário. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. celular activada por fluorescência (FACS) <ol><li> Método de quantificação de GnRH <ol><li> Pegue a placa preparado no passo 1.8 e pipeta o meio completo da EACH dos sete poços. Adicione 1 mL de meio completo pré-aquecido no primeiro poço. Usar isso como controlo negativo. Adicionar 1 mL de cada uma das seis pré-aquecido tratamento de imagens (3 poços com 1 uM e 3 poços com 10 ^ M) para os próximos seis poços. Incubar a placa numa atmosfera humidificada, 5% de CO2 incubadora a 37 ° C durante 5 h. </li><li> Pipetar a meio de cada poço. Lavar as células duas vezes com 2 mL de PBS com cuidado. Adicionar 500 ul de solução de tripsina-EDTA em cada poços. Incubar a placa a 37 ° C até que as células de separar (aproximadamente 10 min). </li><li> Adicionar 1 ml de meio completo a cada poço para parar a tripsina. Agitar a placa. Suspender as células suavemente com uma pipeta, e transferir a suspensão de cada cavidade para tubos FACS. Centrifugar os tubos a 150 xg durante 4 min, a 4 ° C. </li><li> Derrama o sobrenadante cuidadosamente, com um movimento. Adicionar 500 uL de PBS arrefecido em gelo a cada tubo de FACS e gentilmente re-suspender as células. Manter os tubos em gelo até ao fimda experiência. </li></ol></li><li> Análise e cálculo <ol><li> Analisar as células por citometria de fluxo. Por excitação, utilizar a 488 nm de comprimento de onda do laser de árgon e utilizar para a detecção de comprimento de onda de 530 nm. Configure o citômetro de fluxo parâmetros executando as células de controlo negativo. Usar estes parâmetros para analisar as células tratadas (Figura 4A). Avaliar os dados com o software do fabricante, determinar os valores de média intensidade de fluorescência (MFI), e calcular os valores relativos das IFM. </li></ol></li></ol>

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<li>Leurs, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-III+based+multifunctional+drug+delivery+systems+containing+daunorubicin+and+methotrexate%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate.</a> Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

As experiências aqui descritas usar análogos de GnRH marcadas seletivamente para o rastreio aderente culturas de células in vitro. A microscopia confocal e métodos de citometria de fluxo são adequados para controlar e quantificar a absorção celular destes conjugados da GnRH-FITC em um momento e de modo dependente da concentração. Estas experiências têm os seguintes passos críticos: 1) manter uma cultura de células estéril e saudável; 2) péptidos GnRH deve ser de elevada qualidade; 3) concentrações ra...

<html> Sistemas de entrega de drogas específicas base de péptidos tornaram-se um desenvolvimento rápido e a área promissor na terapia do cancro ao longo dos últimos anos um, 2. Gonadotropina humana tipo I libertando receptor da hormona (GnRH-IV) situa-se principalmente na glândula pituitária, mas também está presente em vários outros tecidos que são responsáveis por auto-reprodução 3. GnRH-IV é também expressa num número de tecidos de cancro, relacionada ou não com o sistema reprodutivo 4, 5. A expressão elevada de GnRH-IR em várias células de tumores malignos em comparação com tecidos saudáveis fornece uma oportunidade para terapia alvo 5, 6. Muitos hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) análogos têm sido desenvolvidos nas últimas décadas, que poderiam ser utilizados como porções de direccionamentof &quot;&gt; 7, 8, 9. Estes péptidos são capazes de entregar agentes anticancerígenos com elevada selectividade para as células tumorais malignas que sobre-expressa a GnRH-IV 6. Vários fármacos anti-tumorais conjugados da GnRH com maior selectividade e maior eficiência do que o não conjugado correspondendo livre de drogas foram relatados 7, 8, 9. Publicações anteriores cerca de péptidos da GnRH e seus receptores relatado que a GnRH-IR pode assumir várias conformações diferentes que têm selectividade para GnRH análogos 10. A GnRH-IR altamente variável tem complexos e várias vias de sinalização são dotados de actividade diferente contra os seus ligandos naturais e artificiais 11. Estes fatos fazem investigação de sistemas baseados em GnRH desafiador. Por outro lado, o<html> y possuem potencial terapêutico promissor. Várias experiências com péptidos GnRH radiomarcados foram anteriormente relatados 12, 13, 14, 15, mas experimentos nos quais foram usados análogos de GnRH fluorescente etiquetado ainda são limitados. Enquanto marcação radioactiva oferece alta sensibilidade, marcação fluorescente tem várias outras vantagens, por exemplo, o manuseio mais fácil, ea capacidade de contracoloração com diferentes fluoróforos. Três análogos de GnRH comuns que têm sido utilizados com sucesso para a entrega de drogas são a [D-Lys6] -GnRH-I, [D-Lys6] -GnRH-II e III-GnRH, mas a eficácia destes péptidos como porções de direccionamento é raramente comparado 16, 17. Por outro lado, os resultados obtidos em experiências separadas em que foram utilizadas células de cancro diferentes e os análogos da GnRH é diversa. ntent &quot;&gt; Com base nestas considerações, nós nos concentramos em que o tumor alvo e potencial de entrega da droga destes péptidos GnRH e, assim, sintetizada e caracterizada a [D-Lys 6 (ITCF)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - conjugados peptídicos de GnRH-III 18 Estes análogos são marcados selectivamente com FITC na cadeia lateral do seu (razão de péptido-FITC Lys ou D-Lys 1: 1 em cada um. conjugado). a ideia era que a marcação fluorescente seletivo pode oferecer novas informações sobre esses peptídeos, e permite que sua boa localização e quantificação confiável. estes conjugados têm um manuseamento seguro e detecção confiável, o que tornará mais fácil para comparar sua eficiência segmentação tumor, ea triagem de numerosos tipos de células tumorais malignas. esperamos que up-to experimentos data com estes conjugados peptídeo poderia contribuir para o desenvolvimento de câncer de romance alvo conjugados GnRH-drogas, e ajudar a identificar novos tar terapêuticafica bem. O presente artigo propõe demonstrar algumas experiências bem reprodutíveis e rápidos com conjugados de GnRH-FITC. A expressão na superfície celular da GnRH-R é uma condição determinante sobre a absorção de GnRH, por isso investigado simultaneamente o nível da superfície celular da GnRH-IR sobre as linhas de células testadas. Nós visualizados os conjugados da GnRH-IR e GnRH-FITC por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) e quantificado a absorção celular de conjugados da GnRH-FITC utilizando células activadas por fluorescência (FACS).

<table><tbody><tr><td>Banco de células EBC-1</td><td>JCRB</td><td>JCRB0820</td><td>Carcinoma de células escamosas de pulmão humano</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>Adenocarcinoma pancreático humano</td></tr><tr><td>Detroit-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>Carcinoma faríngeo humano</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Meio com L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Meio de cultura para células BxPC-3</td></tr><tr><td>Eagle's Minimum Essential Meio</td><td>Lonza</td><td>BE12-611F</td><td>Meio de cultura para células EBC-1, e complementado com 0,1% de piruvato de sódio para células Detroit-562</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Euro Clone</td><td>ECS0180L</td><td>Complementa o meio de cultura</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>Complementa o meio de cultura (antibióticos)</td></tr> <tr><td>Frascos de Cultura de Células de Linha Padrão</td><td>VWR</td><td>10062-872</td><td>Fornecem ambiente de crescimento consistente e estéril para células</td></tr><tr><td>Mistura de tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>Remova as células anexadas</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Solução Solvente</td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Usado para contar células</td></tr> <tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-I</td><td>feito por nós</td><td>- </td><td>Pureza &ge; 98% (HPLC)</td></tr> <tr><td>[D-Lys6(FITC)]-GnRH-II</td><td>feito por</td> <td>nós-Pureza</td> <td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr> <tr><td>[Lys8(FITC)]-GnRH-III</td><td>feito por</td> <td>nós-Pureza</td> <td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr> <tr><td>lâmina microscópica de 8 poços com fundo de vidro</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Uso em experimento CLSM</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células Corning Costar, 12 poços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>Uso em FACS experimento</td></tr><tr><td>Solução de fixação (10% de formalina tamponada neutra)</td> <td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>Fixar células aderentes</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>Prevenir a ligação inespecífica dos anticorpos</td></tr><tr><td>GnRHR Anticorpo Proteintech</td><td></td><td>19950-1-AP</td><td>Reagente de imunocitoquímica, liga-se aos receptores GnRH tipo I humano</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário, conjugado Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td><td>Reagente de imunocitoquímica, liga-se ao anticorpo primário</td></tr><tr><td>Solução de sonda fluorescente (Draq5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>Núcleos de contracoloração</td></tr><tr><td>Fluoromount Meio de Montagem Aquosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td>Use em experimento CLSM, preservando a fluorescência</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Elektro-Optika Ltd.&nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>Verifique o fenótipo e a confluência das culturas celulares</td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser confocal invertido</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>Uso no experimento CLSM</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>Uso no experimento FACS</td></tr></tbody></table>

in vitro imaging and quantificação da segmentação eficiência drogas de análogos de gnrh fluorescente etiquetado

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

análogos de GnRH são porções de direccionamento eficaz e capaz de entregar agentes anticancerígenos seletivamente em células tumorais malignas quais os receptores GnRH altamente expresso. No entanto, a análise quantitativa de captação celular análogos de GnRH &#39;e os tipos de células investigadas em sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH são actualmente limitada. Previamente introduzido, fluorescente marcado selectivamente GnRH I, -II e -III derivados fornecem grande detectabilidade, e eles têm propriedades químicas adequadas para experiências reprodutíveis e robustas. Descobrimos também que os métodos apropriados up-to-date com estes análogos de GnRH rotulados poderia oferecer novas informações sobre os sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH. Este manuscrito apresenta algumas experiências simples e rápido sobre a absorção celular de [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-I, [D-Lys6 (FITC)] - a GnRH-II e [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III na EBC-1 (pulmão), o BxPC-3 (pâncreas) e na Detroit-562- (faringe) T malignaUmor células. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, o nível da superfície celular de receptores de GnRH-I também foi examinada com estas linhas de células antes e após o tratamento com GnRH por microscopia confocal de varrimento laser. A absorção celular de conjugados da GnRH-FITC foi quantificada por separação de células activadas por fluorescência. Nestas experiências foi observada pequenas diferenças entre os análogos do GnRH e as principais diferenças entre os tipos de células. As diferenças significativas entre as linhas de células são correlacionados com o seu nível distinto de receptores de superfície celular GnRH-I. Os experimentos introduzidas contêm métodos práticos para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção de conjugados de GnRH-FITC em um tempo e forma dependente da concentração em várias culturas de células aderentes. Esses resultados poderiam predizer a eficácia da segmentação de drogas de conjugados de GnRH na cultura celular dado, e oferecem uma boa base para novas experiências no exame dos sistemas de entrega de medicamentos à base de GnRH.

Imagens obtidas por microscopia confocal de varrimento laser (CLSM) oferecem informações espetacular sobre a absorção de conjugados de GnRH-FITC na cultura de células dada em um tempo e forma dependente da concentração. Em paralelo com estes conjugados da GnRH-FITC, a presença da GnRH-IV na superfície da célula, também é verificável pela experiência CLSM. Além disso, usando uma sonda fluorescente de ADN de coloração vermelho-extremo, é possível contracoloração os núcleos de células além ...

Selectivamente marcado fluorescente GnRH-I, -II e -III derivados são ferramentas confiáveis para acompanhar e quantificar a sua captação celular. Este manuscrito apresenta experiências para visualizar, quantificar e comparar a eficiência de absorção destes conjugados da GnRH em várias linhas celulares.

In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar e prever a eficácia de sistemas de liberação de fármacos baseados em GnRH em culturas de células cancerígenas humanas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de terapia antineoplásica direcionada, como a eficiência com que células de diferentes tipos de câncer humano absorvem fármacos antineoplásicos direcionados por GnRH. A principal vantagem deste método é que utiliza novos análogos de GnRH marcados com fluoróforos, que permitem o uso simultâneo de microscopia confocal e análise por citometria de fluxo.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia anti-câncer porque os receptores de GnRH são altamente expressos em vários tipos de células cancerígenas, permitindo o direcionamento seletivo a elas. A demonstração do procedimento será feita por Bianka Gurbi, aluna de doutorado do meu laboratório. Para começar, remova o meio cultivado de cada um dos sete poços de uma lâmina microscópica semeada.Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido ao poço do controle negativo e 250 microlitros do meio de tratamento com sementes contendo GnRH pré-aquecido a cada um dos seis poços restantes. I

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar a validação ex vivo de experimentos de imagem de xenoenxerto de fluorescência de infravermelho próximo in vivo em camundongos usando nanocorpos marcados com fluoróforo e anticorpos convencionais.

Validação de nanocorpo e Antibody Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria de fluxo e microscopia

Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas.

O uso de Ex Vivo Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.

Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal

Este protocolo descreve a detecção de microscopia confocal de receptor acoplado a proteína G (GPCR) internalização em células de mamífero. Ele inclui a cultura de células de base, transfecção, e procedimento de microscopia confocal e fornece um método eficiente e facilmente interpretável para detectar a localização subcelular e internalização de GPCR expresso-fusão.

Detecção de activados por ligandos L acoplado a proteína do receptor de internalização por Microscopia Confocal

Descreveremos um protocolo para pré-clínicos em vivo rastreamento de metástases. É baseado em um repórter de radionuclídeos-fluorescência combinando o symporter de iodeto de sódio, detectado pelo não-invasiva [18F] tetrafluoroborate-animal de estimação e uma proteína fluorescente para confirmação simplificada ex vivo . O método é aplicável para pré-clínicos na vivo celular rastreamento além da biologia do tumor.

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Ortotópico intracraniana injeção de células de tumor tem sido usada na pesquisa do câncer para estudar a biologia do tumor de cérebro, progressão, evolução e resposta terapêutica. Aqui nós apresentamos fluorescência molecular tomografia computadorizada de xenografts tumor, que fornece em tempo real imagens intravital e quantificação de um tumor massa em modelos pré-clínicos glioblastoma.

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O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Aprenda a quantificar a captação de análogos de GnRH marcados com fluoróforo em linhagens de células cancerígenas humanas usando microscopia confocal e citometria de fluxo. Este método avança terapias anticâncer direcionadas.

In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

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