In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

O objetivo geral deste procedimento é investigar e prever a eficácia de sistemas de liberação de fármacos baseados em GnRH em culturas de células cancerígenas humanas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de terapia antineoplásica direcionada, como a eficiência com que células de diferentes tipos de câncer humano absorvem fármacos antineoplásicos direcionados por GnRH. A principal vantagem deste método é que utiliza novos análogos de GnRH marcados com fluoróforos, que permitem o uso simultâneo de microscopia confocal e análise por citometria de fluxo.

As implicações dessa técnica estendem-se à terapia anti-câncer porque os receptores de GnRH são altamente expressos em vários tipos de células cancerígenas, permitindo o direcionamento seletivo a elas. A demonstração do procedimento será feita por Bianka Gurbi, aluna de doutorado do meu laboratório. Para começar, remova o meio cultivado de cada um dos sete poços de uma lâmina microscópica semeada.

Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido ao poço do controle negativo e 250 microlitros do meio de tratamento com sementes contendo GnRH pré-aquecido a cada um dos seis poços restantes. Incube a lâmina em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono, durante cinco horas. Após cinco horas de incubação, aspire o meio de cada poço e lave as células com 250 microlitros de PBS.

Posteriormente, adicione 250 microlitros de solução fixadora em cada poço e incube a lâmina à temperatura ambiente por 10 minutos. Após a fixação das células, descarte a solução fixadora e lave as células com 250 microlitros de PBS. Adicione 250 microlitros de solução fluorescente de cinco micromolar preparada em PBS em cada poço e incube a lâmina à temperatura ambiente por 10 minutos.

Após remover a solução do marcador fluorescente, lave cuidadosamente as células duas vezes com 250 microlitros de PBS. Por fim, adicione três a quatro gotas de meio de montagem em cada poço. Mantenha a lâmina no escuro à temperatura ambiente até ser analisada ao microscópio.

Remova o meio cultivado de cada um dos cinco poços de uma lâmina microscópica semeados. Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido ao poço do controle negativo e ao segundo poço com as células não tratadas. Pré-trate as células nos três poços restantes com os meios de tratamento pré-aquecidos contendo 10 micromolar de GnRH FITC.

Incube o lâmina em uma estufa a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono, por uma hora. Posteriormente, remova somente o meio das células tratadas e lave as células com 250 microlitros do meio completo pré-aquecido. Em seguida, remova o meio de lavagem.

Em seguida, adicione 250 microlitros do meio completo pré-aquecido em cada uma das três poças. Incube a lâmina em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono, durante uma hora. Após a incubação, descarte o meio das cinco poças e lave as células com 250 microlitros de PBS.

Em seguida, remova o PBS e fixe as células com 250 microlitros de solução fixadora à temperatura ambiente por 10 minutos. Depois, descarte a solução fixadora e lave as células com 250 microlitros de PBS. Adicione 250 microlitros de solução bloqueadora em cada poço e incube a lâmina à temperatura ambiente por uma hora.

Aspire a solução bloqueadora de cada poço, exceto do controle negativo. Após lavar as células com 250 microlitros de PBS, adicione 250 microlitros de solução de anticorpo primário a cada poço. Incube a lâmina à temperatura ambiente por uma hora em local escuro.

Remova as soluções de cada um dos cinco poços e lave as células com 250 microlitros de PBS. Em seguida, remova o PBS e adicione 250 microlitros de solução de anticorpo secundário. Incube a lâmina à temperatura ambiente por uma hora no escuro.

Aspire a solução de cada poço e lave as células com 250 microlitros de PBS. Remova o PBS de lavagem e, em seguida, adicione 250 microlitros de PBS contendo sonda fluorescente a cinco micromolares em cada poço. Incube a lâmina por 10 minutos em temperatura ambiente.

Remova a solução do corante fluorescente de cada poço e lave cuidadosamente as células duas vezes com 250 microlitros de PBS. Por fim, adicione três a quatro gotas de meio de montagem em cada poço. Mantenha a lâmina no escuro à temperatura ambiente até ser analisada ao microscópio.

Imagee as células em um microscópio confocal a laser invertido. Ligue os lasers de 488 nanômetros e 633 nanômetros. Verifique a amplificação do laser e o tamanho do pinhole.

Image o amostra controle negativo. Otimize o sinal observado para o núcleo e ajuste os sinais de FITC e Alexa 546 para que estejam próximos de zero. Em seguida, utilizando os mesmos parâmetros, image as amostras tratadas.

Descarte o meio completo de todos os sete poços de uma placa de cultura semeados. Em seguida, adicione um mililitro de meio completo pré-aquecido ao poço do controle negativo e um mililitro dos meios de tratamento pré-aquecidos aos seis poços restantes. Incube a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius, cinco por cento de dióxido de carbono, por cinco horas.

Após descartar o meio de todos os poços, lave cuidadosamente as células duas vezes com dois mililitros de PBS. Remova o PBS e então adicione 500 microlitros de solução de tripsina-EDTA em cada poço. Incube a placa a 37 graus Celsius até que as células se desprendam, o que levará aproximadamente 10 minutos.

Usando um mililitro de meio completo, neutralize a tripsina em cada poço e agite a placa. Em seguida, suspenda as células por pipetagem suave. Transfira as suspensões para tubos FACS separados e centrifugue as amostras a 150 ×g a quatro graus Celsius por quatro minutos.

Decante cuidadosamente os sobrenadantes. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS gelado em cada tubo de FACS e ressuspenda suavemente as células. Mantenha os tubos no gelo até a análise por FACS.

Apresenta-se aqui a análise da captação de GnRH em células de carcinoma de faringe. O tratamento por cinco horas com um micromolar do complexo fluorescente de GnRH resultou em uma captação leve, mas distinguível, manifestada como sinal fluorescente verde localizado nas células de câncer de faringe. O aumento adicional da dose do complexo levou a uma captação aumentada, demonstrando a dependência da dose na captação de GnRH em células de carcinoma de faringe.

A captação dependente de receptor de GnRH e a distribuição celular do ligante em seu receptor em células de câncer de pulmão foram analisadas por meio do tratamento simultâneo com complexo fluorescente de GnRH e coloração do receptor de GnRH tipo um e dos núcleos. Os resultados mostram que o receptor de GnRH tipo um está associado à membrana celular, enquanto a proteína GnRH é internalizada nas células e permanece em seu citoplasma. A captação de GnRH em células de carcinoma de faringe também foi estudada utilizando análise por FACS.

Os resultados mostram que a captação de GnRH observada quando as células foram tratadas com um micromolar de conjugado de GnRH foi fortemente aumentada quando a dose aplicada às células foi elevada para 10 micromolares. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em oito horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de proteger as amostras tratadas e os corantes fluorescentes da luz direta.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de viabilidade celular ou apoptose, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a eficiência com que a droga direcionada ao GnRH pode inibir o crescimento de um determinado tipo de câncer. Após esse desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de terapia contra o câncer explorarem a eficácia de sistemas de liberação de fármacos baseados em GnRH na adesão a células cancerígenas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar esses conjugados de GnRH marcados com fluorescência para investigar a suscetibilidade das células cancerígenas a terapias direcionadas ao GnRH.