O Modelo WinCF - Um Microcosmo barato e tratável de um muco Plugged Bronquíolo para estudar a Microbiologia do Pulmão Infecções

O objetivo geral deste procedimento é imitar o ambiente pulmonar e cultivar patógenos de uma maneira mais semelhante àquela da qual eles causam doenças. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia das vias aéreas, como como diversos patógenos bacterianos interagem em um pulmão de fibrose cística. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a fácil manipulação das condições experimentais.

Observar respostas microbianas semelhantes a como ocorreriam em um brônquio pulmonar real. Demonstrando o procedimento, estará Will Comstock do nosso laboratório. Para preparar o meio de escarro artificial, combine 16 mililitros de solução estoque de muco previamente preparada, dois mililitros de solução estoque de cloreto de potássio, dois mililitros de solução estoque de cloreto de sódio, 200 microlitros de emulsão de gema de ovo, 5,6 mililitros de solução estoque de DNA, 120 microlitros de solução estoque de ferritina, 5,78 mililitros de solução de aminoácidos essenciais, 5,78 mililitros de solução de aminoácidos não essenciais, e 2,44 mililitros de água estéril.

A criação cuidadosa de meio de escarro artificial estéril é extremamente importante. Como qualquer contaminação pode alterar a atividade bacteriana nos tubos capilares incubados, mais adiante. Depois de agitar suavemente para misturar, pipete cinco mililitros do meio em oito tubos de centrífuga estéreis de 15 mililitros.

O meio agora pode ser modificado para atingir as condições químicas desejadas. Por exemplo, a mídia mostrada aqui teve seu PH alterado e corantes adicionados para refletir suas diferentes acidez. Em seguida, sob uma bio-capa estéril, adicione 900 microlitros de meio a cada um dos oito tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro.

Homogeneizar amostras de escarro previamente adquiridas usando uma seringa de três mililitros para retirar e ejetar repetidamente o escarro até que fique com uma consistência lisa. Adicione 100 microlitros de escarro homogeneizado a cada um dos oito tubos de microcentrífuga. Em seguida, vortex os tubos para misturar suficientemente.

Rotular mais oito tubos de centrífuga estéreis de 15 mililitros de acordo com os tubos de microcentrífuga do meio previamente preparados. Estes serão os tubos de incubação. Use solução de etanol a 70% para esterilizar uma toalha de papel e deixe secar.

Rasgue a toalha em pedaços de cerca de dez centímetros quadrados cada. Em seguida, esmigalhe um pedaço no fundo de cada tubo de incubação. Com um pedaço de papel no fundo de cada tubo de incubação, use 1 mililitro de água estéril para umedecer levemente cada pedaço para criar um ambiente úmido dentro do tubo.

Para cada tubo de meio, encha três tubos capilares de vidro com meio, segurando uma extremidade do tubo no meio e inclinando-o horizontalmente. Permitindo que a ação capilar guie o meio para dentro do tubo. Pare o enchimento colocando suavemente um dedo enluvado sobre a extremidade aberta do tubo e, em seguida, sele a outra extremidade do tubo pressionando-o para baixo em um bloco de selante de massa capilar.

Coloque cada conjunto de três tubos capilares em tubos de incubação de 15 mililitros, com a massa selada voltada para baixo. Em seguida, tampe os tubos e certifique-se de que estejam rotulados. Esses três tubos capilares são para replicação de cada condição de controle.

Quando todos os tubos de incubação são preenchidos com seus tubos capilares designados. Coloque os racks a 37 graus Celsius de forma que os tubos sejam incubados horizontalmente para que qualquer gás gerado não escape pela extremidade aberta. Incubar os tubos durante 48 horas.

Remova os tubos da incubadora, certificando-se de mantê-los na horizontal. Cuidadosamente os tubos capilares para fora dos tubos de incubação, mantendo cada conjunto de três separado dos outros conjuntos. Disponha os tubos capilares um ao lado do outro em uma caixa de luz, todos alinhados de forma que o conteúdo dos tubos fique visível e iluminado por baixo.

Tecer uma lacuna a cada três tubos para separar diferentes condições químicas Próximo Foque a câmera nos tubos diretamente acima deles, de modo que todos os tubos sejam visíveis no campo de view e a luz da caixa de luz forneça contraste e visualização suficientes da cor dos corantes do tubo. Para extrair o conteúdo dos tubos para análise a jusante, remova um conjunto de capilares triplicados da caixa de luz de cada vez. Insira uma agulha de ponta romba de calibre 25 de 0.5 polegada na extremidade obstruída do tubo capilar para quebrar a vedação.

Em seguida, vire o tubo capilar de cabeça para baixo para permitir que o meio goteje da parte superior do para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Se o meio não pingar, use uma pipeta de 200 microlitros para expelir o meio para fora do tubo, pressionando um êmbolo de pipeta quando ele for inserido na extremidade do tubo capilar. Como mostrado aqui, quando nenhuma amostra de escarro foi adicionada ao meio, a única mudança exibida em todo o espectro de pH após 48 horas de incubação foi uma ligeira diminuição no volume do meio resultante de uma pequena evaporação.

Os tubos capilares inoculados apresentaram alterações de volume, aparecimento de bolhas de gás, coloração alterada e aparecimento de depósitos opacos. Esses resultados mostram que bactérias e outros micróbios contidos no escarro adicionado são capazes de crescer e mudar dentro do meio artificial. Após a incubação, outros métodos, como metabolômica e sequenciamento de DNA, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o comportamento dos micróbios que crescem nos tubos capilares.

O sistema winCF é um novo método para estudar a atividade do microbioma pulmonar; importante para muitas doenças, incluindo FC, DPOC, asma e outras.