O Modelo WinCF - Um Microcosmo barato e tratável de um muco Plugged Bronquíolo para estudar a Microbiologia do Pulmão Infecções

O objetivo geral deste procedimento é imitar o ambiente pulmonar e cultivar patógenos de maneira mais semelhante àquela em que eles causam doenças. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de microbiologia das vias aéreas, como, por exemplo, como patógenos bacterianos diversos interagem no pulmão de um paciente com fibrose cística. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma manipulação fácil das condições experimentais.

Para observar respostas microbianas semelhantes às que ocorreriam em um brônquio pulmonar real. Demonstrando o procedimento, estará Will Comstock do nosso laboratório. Para preparar o meio artificial de escarro, combine 16 mililitros de solução estoque de muco previamente preparada, dois mililitros de solução estoque de cloreto de potássio, dois mililitros de solução estoque de cloreto de sódio, 200 microlitros de emulsão de gema de ovo, 5,6 mililitros de solução estoque de DNA, 120 microlitros de solução estoque de ferritina, 5,78 mililitros de solução de aminoácidos essenciais, 5,78 mililitros de solução de aminoácidos não essenciais e 2,44 mililitros de água estéril.

A preparação cuidadosa do meio artificial estéril de escarro é extremamente importante. Qualquer contaminação pode alterar a atividade bacteriana nos tubos capilares incubados posteriormente. Após agitar suavemente para homogeneizar, pipete cinco mililitros do meio em oito tubos estéreis de centrífuga de 15 mililitros.

O meio pode agora ser modificado para atingir as condições químicas desejadas. Por exemplo, os meios mostrados aqui tiveram seu pH alterado e corantes adicionados para refletir suas diferentes acidez. Em seguida, sob uma capela de biosegurança estéril, adicione 900 microlitros de meio a cada um dos oito tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Homogeneíze amostras de escarro previamente obtidas utilizando uma seringa de três mililitros para retirar e expelir repetidamente o escarro até que apresente uma consistência uniforme. Adicione 100 microlitros do escarro homogeneizado a cada um dos oito tubos de microcentrífuga. Em seguida, agite os tubos em vórtex para misturar adequadamente.

Rotule mais oito tubos estéreis de centrífuga de 15 mililitros de acordo com os tubos de microcentrífuga de meio previamente preparados. Esses serão os tubos de incubação. Use solução de etanol 70% para esterilizar uma toalha de papel e deixe secar.

Retire o papel-toalha em pedaços de aproximadamente quatro polegadas quadradas cada. Em seguida, amasse um pedaço no fundo de cada tubo de incubação. Com um aglomerado de papel no fundo de cada tubo de incubação, utilize 1 mililitro de água estéril para umedecer levemente cada aglomerado, criando um ambiente úmido no interior do tubo.

Para cada tubo de meio, encha três tubos capilares de vidro com o meio mantendo uma das extremidades do tubo no meio e inclinando-o horizontalmente. Deixe a ação capilar conduzir o meio para dentro do tubo. Interrompa o enchimento colocando suavemente um dedo com luva sobre a extremidade aberta do tubo e, em seguida, feche a outra extremidade do tubo pressionando-a contra um bloco de selante de argila capilar.

Coloque cada conjunto de três tubos capilares em tubos de incubação de 15 mililitros, com o lado vedado com massa vedante virado para baixo. Em seguida, tampe os tubos e certifique-se de que estão devidamente rotulados. Esses três tubos capilares são para replicação de cada condição controle.

Quando todos os tubos de incubação estiverem preenchidos com seus respectivos tubos capilares, coloque as grades a 37 graus Celsius de modo que os tubos sejam incubados na posição horizontal, impedindo que qualquer gás gerado escape pela extremidade aberta. Incube os tubos por 48 horas.

Retire os tubos do incubador, certificando-se de mantê-los na posição horizontal. Retire cuidadosamente os tubos capilares dos tubos de incubação, mantendo cada conjunto de três separado dos demais conjuntos. Disponha os tubos capilares lado a lado sobre uma caixa de luz, alinhando-os de modo que o conteúdo dos tubos fique visível e iluminado por baixo.

Tecer uma lacuna a cada três tubos para separar diferentes condições químicas. Em seguida, foque a câmera diretamente sobre os tubos de forma que todos os tubos fiquem visíveis no campo de visão e a luz da caixa de luz forneça contraste suficiente e permita a visualização da cor dos corantes nos tubos. Para extrair o conteúdo dos tubos para análises posteriores, remova um conjunto de capilares triplicados da caixa de luz de cada vez. Insira uma agulha romba de 25 gauge e 0,5 polegada na extremidade tampada do tubo capilar para romper o selo.

Em seguida, vire o tubo capilar de cabeça para baixo para permitir que o meio escorra da porção superior para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Se o meio não escorrer, utilize uma pipeta de 200 microlitros para expelir o meio do tubo, pressionando o êmbolo da pipeta quando esta for inserida na extremidade do tubo capilar. Como mostrado aqui, quando nenhuma amostra de escarro foi adicionada ao meio, a única alteração observada ao longo do espectro de pH após 48 horas de incubação foi uma ligeira redução no volume do meio, resultante da evaporação mínima.

Os tubos capilares inoculados apresentaram alterações no volume, surgimento de bolhas de gás, coloração modificada e formação de depósitos opacos. Esses resultados indicam que as bactérias e outros microrganismos presentes no escarro adicionado são capazes de crescer e se modificar no meio artificial. Após a incubação, outros métodos, como metabolômica e sequenciamento de DNA, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o comportamento dos microrganismos que crescem nos tubos capilares.

O sistema winCF é um método novo para estudar a atividade do microbioma pulmonar; importante para diversas doenças, incluindo FC, DPOC, asma e outras.