Técnicas para induzir e quantificar a senescência celular

O objetivo geral dessas técnicas é fornecer uma caixa de ferramentas para permitir a indução, monitoramento e quantificação da senescência celular. Esses métodos podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre a identificação e quantificação da senescência celular e os fatores biológicos que regulam o envelhecimento celular e do organismo. A principal vantagem dessas técnicas é que elas abrangem uma variedade de métodos para monitorar a senescência celular em diferentes modelos, tecidos e tipos de células.

Comece por plaquear as células proliferativas de interesse de passagem inicial a uma densidade esparsa na placa apropriada para a análise. E cultive as células durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos. Quando as células estiverem 50-60% confluentes, aspire o meio de crescimento e lave as células com PBS duas vezes.

Após a segunda lavagem, cubra as células com uma fina camada de PBS. E expor as células a uma única dose de 10 graus de irradiação gama. Substitua o PBS por meio de crescimento.

E retorne as células para a incubadora. Troca do meio a cada 48 a 72 horas com monitoramento diário de alterações morfológicas em microscópio óptico. Sete a 10 dias após a irradiação, descongele todos os reagentes de um kit comercial de ensaio de beta-galactosidase associada à senescência em banho-maria a 37 graus Celsius.

Quando todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente, prepare as soluções fixadoras e de coloração de acordo com as instruções do fabricante. E lave delicadamente cada poço com PBS em temperatura ambiente. Tome cuidado para enxaguar as células com cuidado, pois as células de senescência não aderem bem e podem ser facilmente removidas durante as lavagens.

Fixe as células em cada poço com um mililitro de solução fixadora por poço por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Seguido por duas lavagens de dois mililitros com PBS por poço. Em seguida, adicione um mililitro de solução de coloração beta-galactosidase a cada poço e cubra a placa com papel alumínio para uma cultura de 24 a 48 horas em uma incubadora a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono.

Verifique as células em 24 horas. Quando as células estiverem suficientemente coradas, substitua a solução beta-gal por PBS fresco e examine as culturas em um microscópio óptico com uma câmera acoplada a uma objetiva de 10x ou superior. As células beta-galactosidase associadas à senescência aparecerão em azul.

Em seguida, obtenha pelo menos cinco imagens não sobrepostas por poço. E conte manualmente o número total de células positivas para beta-galactosidase associadas à senescência e o número total de células por imagem para calcular a porcentagem de células beta-galactosidase associadas à senescência por poço. 10 dias após a irradiação gama, lave as células três vezes com PBS.

Após a última lavagem, substitua o PBS por 2,5 mililitros de meio livre de soro, suplementado com antibióticos por placa de seis centímetros e retorne as células à incubadora de cultura de tecidos durante a noite. Na manhã seguinte, transfira o meio para um tubo cônico no gelo. E lave as células duas vezes com PBS fresco.

Em seguida, tripsinize e conte as células. Em seguida, centrifugue o sobrenadante colhido da placa de cultura de células. Em seguida, filtre-o através de um filtro de seringa de 0,45 micrômetro e congele o meio em alíquotas de 500 microlitros a 80 graus Celsius até sua análise por ELISA.

O aumento da coloração beta-gal associada à senescência ocorre com a senescência replicativa e induzida por danos ao DNA. Observe a forma plana ampliada das células senescentes em comparação com a aparência fusiforme dos fibroblastos em proliferação. Neste experimento, células senescentes jovens ou replicativas em proliferação foram fixadas conforme descrito no protocolo escrito.

E corado com um anticorpo contra um biomarcador para quebras de fita dupla de DNA e DAPI. Com um aparente aumento no número de fosi de quebra de fita dupla de DNA observado nas células senescentes. A análise de RT-qPCR de fatores de fenótipo secretor associados à senescência revela que pelo menos alguns fatores são regulados positivamente após a senescência induzida por irradiação gama em fibroblastos diplóides humanos de baixa passagem no nível de MRNA.

O que é confirmado por ELISA dos sobrenadantes de cultura de células irradiados com gama. Uma vez dominada, a indução de danos ao DNA e a coloração SA beta-gal podem ser concluídas em aproximadamente 30 minutos de tempo prático. O meio de condição para quantificar os níveis de proteína SASP pode ser preparado em cerca de 30 minutos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorá-los passando por mudanças morfológicas nas culturas de células antes de prosseguir para a quantificação do marcador senescente. Após seu desenvolvimento, essas técnicas abriram caminho para pesquisadores nas áreas de envelhecimento e câncer explorarem a senescência em uma variedade de tecidos, culturas de células e organismos modelo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir, monitorar e quantificar a senescência celular.