Name: Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a investigar a distribuição tecidual, transmissão e efeitos na aptidão do hospedeiro do densovírus HaDV2 na lagarta do algodoeiro. Este protocolo viabiliza estudos controlados de interações vírus-inseto.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional Key Pesquisa Básica da China (No. 2013CB127602) e do Fundo de Ciência para Grupos pesquisa criativa da National Science Foundation da China (No. 31321004).

1. Construção do HaDV2-livre Cotton lagarta Colony <ol><li> Traseira algodão lagarta larvas (H. armigera) com uma dieta artificial 32 numa sala de crescimento controlado ou uma câmara de clima artificial a 25 ± 1 ° C, com 14 horas de luz / 10 horas de escuro e 60% de humidade relativa. </li><li> Auxiliar de par único acasalamento de traças recém eclosed utilizando uma gaiola de plástico por par (10 cm de altura, a 5 cm de diâmetro) coberto com gaze de algodão para garantir uma boa ventilação e para servir como um substrato para oviposição. Para aumentar a probabilidade de obtenção de uma colónia livre de vírus, utilizar, pelo menos, 30 pares de acasalamentos de par único. Traças de alimentação adultos com uma solução de vitamina 10% de açúcar e 2% 32 embebido numa bola de algodão e reabastecido diariamente. </li><li> Como adultos fêmeas depositam seus ovos sobre a gaze de algodão aproximadamente 2 dias pós-acasalamento, mudar a gaze diária. Recolha e manter os ovos de gaze contendo na mesma sala de crescimento (ou Cham clima artificialber) como as mariposas adultas até a eclosão dos ovos. </li><li> Imediatamente transferir larvas recém-nascidos para novas placas de 24 poços, com um indivíduo por poço. </li><li> Cinco dias após a primeira data de postura de ovos, recolher as traças-mãe e armazená-las em azoto líquido. NOTA: Coletar as mariposas 5 dias após a primeira data de postura garante que os pais estão vivos no ponto de coleta e, portanto, evita eventuais impactos do uso de mariposas mortas na precisão extração de DNA. </li><li> Isolar o ADN genómico a partir destas amostras utilizando um estojo de extracção de ADN de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Amplificar um fragmento de 574 pb do gene da actina com os iniciadores da actina F / R actina (actina F: 5-CATCTACGAGGGTTACGC-3 e actina R: 5-CATCTGTTGGAAGGTGGA-3). Visualizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando produtos de electroforese em gel de agarose de acordo com protocolos convencionais; a amplificação bem sucedida do gene da actina assegura que o ADN é de boa qualidade. </li><li> avaliar tele presença de HaDV2 nas traças pai usando PCR com iniciadores específicos: DVVPF (GGATTGGCCTGGGAAATGAC) e DVVPR (CGTTGTTTTTATATCCGAGG) 31. </li></ol></li><li> Uma vez que um par limpo foi identificado, prole traseira daquele par de reprodução HaDV2 não infectadas único para pelo menos cinco gerações e manter esta como a-HaDV2 livre colónia (NONINF-deformação); a colónia HaDV2-infectados é definido como o INF-deformação. </li><li> Para confirmar o estado da infecção HaDV2 no NONINF-deformação (e para excluir o efeito de bactérias ou vírus em desenvolvimento hospedeiro conhecidos), avaliar o estado de infecção por HaDV2, Wolbachia, e H. armigera nucleopolihedrovirus (HaNPV) em oito indivíduos larvas aleatoriamente seleccionadas do NONINF-estirpe utilizando PCR (com iniciadores específicos: DVVPF / DVVPR para HaDV2, NPVF / NPVR para HaNPV, e 81F / 691R para Wolbachia 31, 33). NOTA: Sabe-se que alguns vírus pode ser tardent no hospedeiro infectado, com um nível indetectável, mesmo quando se utiliza uma técnica baseada em PCR. tecnologias NGS poderia ser utilizado para confirmar que não há sequências virais estão presentes nas amostras de ADN genómico. </li></ol> 2. Preparação de HaDV2-Fluidos contendo líquidos NOTA: Mostrámos que a tentativa de purificação das partículas do vírus HaDV2 inibe a sua infectividade e actividade de 31; Portanto, o protocolo seguinte é realizado para atingir a solução HaDV2 infecciosa, filtrando os indivíduos HaDV2-infectados. <ol><li> Recolha mariposas adultas individualmente e imediatamente armazená-las em azoto líquido. </li><li> Completamente moer as traças individuais recolhidos em azoto líquido usando um almofariz e pilão esterilizado. Transferir cerca de 10 ug de detritos para um tubo limpo de 1,5 mL. Transferir o resíduo restante para um novo tubo e armazená-los imediatamente à temperatura de -80 ° C. </li><li> Extrair ADN do 10 ug de detritos, following os protocolos fornecidos pelo fabricante. Uma vez que o ADN de traça foi isolado, para verificar HaDV2 utilizando o protocolo, como descrito na etapa 1.6. </li><li> De acordo com os resultados obtidos no passo 2.3, dividir o resíduo restante em dois grupos: HaDV2-positivo e HaDV2-negativo, dependendo o seu estado de infecção. Adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 8 mM de Na 2 HPO 4, 1,5 mM e KH 2 PO 4, pH 7,5) para cada indivíduo para dissolver completamente os detritos das larvas restante. </li><li> Centrifugar o homogenado (a partir do passo 2.4) em 6500 × g durante 15 min a 4 ° C. Filtra-se o líquido sobrenadante com um filtro de membrana de 0,22 um. Recolher os líquidos filtrados (200 uL por tubo) e armazená-los imediatamente à temperatura de -80 ° C. NOTA: O filtro de membrana de 0,22 mícrons vai filtrar a maior parte da indesejável partículas, bactérias e fungos. Em primeiro lugar pré-resfriamento a centrífuga a 4 ° C. Realizar todos os protocolos involving a operação de líquido filtrado em gelo para evitar o homogeneizado escureçam e coagulação. </li></ol> 3. Construção do HaDV2-infectados Cotton lagarta Colony <ol><li> capacidade de transmissão horizontal de HaDV2 <ol><li> Gerar uma curva padrão HaDV2. <ol><li> Amplificar os fragmentos que contêm os iniciadores (VPF: CTGGTGAGGCGATGGACATG; VPR: TGACAAGATCCAGCGTAGACATC) e sonda (VP-sonda: GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG), que são usados ​​para a quantificação de vírus HaDV2, com os iniciadores de novo (PF: GGACAATGCTGGTGAGGC; PR: AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG). Utilizar o programa seguinte: 30 s a 94 ° C, 30 s a 53 ° C, e 60 s a 72 ° C durante 40 ciclos de PCR numa máquina 31. Adicionar 1 mL de DNA genómico contendo o genoma HaDV2 (passo 2.3) para a reacção de 25 pL de PCR como ADN molde. Clonar os fragmentos amplificados num vector de clonagem de acordo com os protocolos do fabricante. </li><li> Calcule o número de cópias deplasmídeos com a seguinte equação: cópias / mL = (N × Um C) / (n x M x 10 9), em que N é um número de Avogadro (6,02 x 10 23 moléculas / mole); C é a concentração em massa de plasmídeos (ng / pl), o qual pode ser medido usando microespectrofotometria; n é o comprimento do plasmídeo recombinante contendo o produto de PCR (5195 pb); e M é o peso molecular de um par de base médio de ADN de cadeia dupla (660 g / mol). </li><li> Prepare seis diluições em série de 10 vezes em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, com concentrações de 1,5 x 10 9, 1,5 x 10 8, 1,5 x 10 7, 1,5 x 10 6, 1,5 x 10 5, e de 1,5 × 10 4 número cópia / mL. </li><li> Realizar em tempo real da reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), utilizando iniciadores específicos (VPF / VPR) e uma sonda (VP-sonda) para gerar ciclo tridimeShold (CT) valores dos plasmídeos descritos no passo 3.1.1.3. Execute três repetições técnicos independentes e média-los para outros cálculos. </li><li> Com base nos resultados acima, gerar uma curva padrão, correlacionando concentrações HaDV2 transformou-log2 para os valores médios relacionados CT. </li></ol></li><li> Quantificar HaDV2 nos fluidos líquidos filtrados. <ol><li> Pipetar uma amostra de teste de 100 ul de fluido de líquido filtrado (passo 2.6) contendo HaDV2 para extracção de ADN. </li><li> Use tempo real, qPCR para obter os valores de Ct para os fluidos líquidos e calcular o número de cópias usando a curva padrão no passo 3.1.1. </li></ol></li><li> Determinar a eficiência de infecção oral com líquidos filtrados HaDV2-infectadas de diferentes concentrações. <ol><li> Dilui-se o fluido líquido contendo HaDV2 para as seguintes concentrações: 10 8, 10 7, 10 6, número 10 5, 10 4, e 0 cópia / mL. </li><li> Espalhar a di artificialet uniformemente em um de 9 cm de diâmetro placa de Petri antes da solidificação. Uniformemente distribuído líquido HaDV2 contendo filtrado (200 uL) para cada concentração na superfície da dieta artificial sólido. Faça isso em um exaustor. </li><li> Transferir 100 larvas recém-eclodidos para a dieta artificial contendo HaDV2 numa placa de Petri. Suavemente bater a gaze de algodão (incluindo larvas recém-chocados) para transferir as larvas da gaze a uma folha de papel branco. Bata o papel com cuidado para que a seda larvas rotação e &quot;balão&quot; fora do papel. Use uma pinça esterilizados para tocar a seda e mover as larvas para uma placa de Petri. </li><li> Após 48 h, a transferência das larvas com a dieta artificial para placas de 24 poços (um indivíduo por poço). </li><li> Traseira as larvas inoculadas com HaDV2 nas concentrações acima para o estágio adulto. </li><li> Recolher as traças adultas, extrair o ADN, e detectar HaDV2 usando PCR, tal como descrito na etapa 1.5. NOTA: Aqui, obter um 100% taxa de infecção HaDV2 do cobollworms tton usando o 10 8 número de cópias / mL e assim estabelecer a colónia HaDV2-infectadas (INF-tensão). </li></ol></li></ol></li><li> capacidade de transmissão vertical de HaDV2 <ol><li> Seleccione traças adultas dos NONINF e INF-estirpes para gerar pares individuais de ♀- / ♂-, ♀ + / ♂-, ♀- / ♂ + e ♀ + / ♂ + (+: positivo para a infecção HaDV2; -: negativo para HaDV2 infecção). </li><li> Transferir a descendência dos pares acima para placas de 24 poços sem vírus; traseiro para as larvas do terceiro instar. </li><li> Extrai-se a DNA a partir de larvas de terceira instar recolhido para usar como molde para determinar a presença de HaDV2, tal como descrito na etapa 1.5. </li></ol></li></ol> 4. Tecido de distribuição de HaDV2 <ol><li> Para evitar a contaminação a partir de vírus e bactérias, esterilizar os fórceps e tesouras em etanol a 75% três vezes e, em seguida, aquecê-los na chama de uma lâmpada de álcool. NOTA: sterilizatio Fórcepsn é necessária quando ocorre contaminação. </li><li> Usando uma balança analítica, pesam os tubos vazios que são para ser usados ​​para armazenar os tecidos. </li><li> Coloque as traças adultas e larvas de INF-estirpe em gelo durante aproximadamente 5 min. </li><li> Dissecar as seguintes tecidos sob um estereomicroscópio em larvas, fêmeas adultas, e os machos adultos em uma placa de Petri limpa contendo tampão PBS. <ol><li> Para larvas, hemolinfa pipeta e dissecar o intestino anterior, intestino médio, intestino grosso, a gordura do corpo, e os túbulos de Malpighi (Figura 1A). Imediatamente transferir cada tecido para os tubos em azoto líquido. <ol><li> Fixar as larvas congelado em cystosepiment usando dois pinos de insectos (200 um de diâmetro, 20 mm de comprimento), inserir nas membranas intersegmentares perto da cabeça e o último segmento abdómen (Figura 1A). </li><li> Cortar o Proleg no abdómen posterior das larvas para que a hemolinfa as larvas flui para fora. Pipetar a hemolinfa de larvas no prazo de 10 s utilizando um micropipette para evitar o escurecimento e coagulação da hemolinfa. NOTA: feniltioureia (50 ug / ml) podem ser misturados numa proporção / vol 01:20 vol com hemolinfa para evitar melanização. </li><li> Usando um par de tesouras, fazer uma incisão na cutícula que vão desde o último membrana intersegmental na cabeça. Dissecar todos os tecidos remanescentes sob um estereomicroscópio usando duas pinças; a imagem para cada tecido é mostrado na Figura 1A. </li><li> Misturar as amostras de tecido a partir de três indivíduos em conjunto como um replicado. </li><li> Para evitar a contaminação dos restantes tecidos com a hemolinfa durante a dissecção, lavar os tecidos dissecados em tampão PBS três vezes. Em seguida, testar o estado HaDV2-infecção de PBS utilizada para a lavagem. Se o tampão de lavagem final é HaDV2-livre, o tecido deve ser limpo de qualquer contaminação com hemolinfa. </li></ol></li><li> Para as fêmeas adultas, dissecar a cabeça (cérebro), os músculos, a gordura do corpo, intestinos, tubos de Malpighi, e do ovário (A Figura 1B) sob um estereomicroscópio em tampão PBS. Para adultos do sexo masculino, dissecar a cabeça (cérebro), os músculos, a gordura do corpo, intestinos, tubos de Malpighi, e testulos (Figura 1C) sob um estereomicroscópio em tampão PBS. Imediatamente transferir cada tecido para os tubos em azoto líquido. <ol><li> Usando fórceps e tesouras, remover as asas das traças adultas e lavar o corpo restante três vezes para limpar as escalas. </li><li> Separe a cabeça, tórax e abdómen com uma tesoura. </li><li> Remova o endoskeleton do tórax e recolher o músculo. </li><li> Usando fórceps, remover a cutícula do abdómen e dissecar os outros tecidos seguintes Figuras 1B e 1C. </li><li> Misturar as amostras de tecido a partir de três indivíduos em conjunto como um replicado. Lavam-se os tecidos dissecados em tampão PBS três vezes. </li></ol></li></ol></li><li> Pesar os tubos e os tecidos acima quando eles foram congelados e assegurar que o mjumentos de diferentes tecidos são quase iguais. Massa (tecidos) = massa (tubos / amostra de tecido) - massa (apenas tubo) </li><li> Extrair o ADN a partir destes tecidos e executar qPCR, conforme descrito no passo 3.1.2. </li><li> Calcular o número de cópias por cada mg de tecido utilizando a curva padrão gerada no passo 3.1.1. Usar o tulo de vus por unidade de massa para corrigir a polarização amostra causado por qualquer diferença na quantidade de tecido utilizado para a extracção do ADN. </li><li> Calcular a percentagem de HaDV2 no tecido específico como se segue: percentagem de HaDV2 para cada tecido = HaDV2 número de cópias por mg de tecido testado / (soma do número de cópias por mg de todos os tecidos). </li></ol> 5. Os bioensaios testar o efeito de HaDV2 sobre Desenvolvimento Anfitrião <ol><li> Lugar, pelo menos, 100 pupas ou traças adultas emergidas recentemente derivadas da estirpe em NONINF-, uma gaiola de 5 L, de arame de algodão-cobertas de gaze. Após 2 dias, as fêmeas adultas acasaladas vai começar a colocar ovos na gaze de algodão. Coletar e mantera gaze de algodão contendo os ovos; os ovos eclodem em cerca de três dias. </li><li> A inoculação das larvas recém-nascido com HaDV2. <ol><li> Transferir as larvas neonato da NONINF-tensão para a dieta artificial contendo HaDV2 (10 8 número de cópias / mL) para estabelecer o INF-deformação. </li><li> Da mesma forma, transferir larvas neonato para a dieta artificial coberto com líquido filtrado HaDV2-livre (passo 2.4) para estabelecer os grupos de controlo (NONINF-deformação). Incluem, pelo menos, 240 larvas em cada tratamento (Figura 2A). NOTA: As larvas que são usados ​​para construir o NONINF- e INF-estirpes são derivadas a partir da mesma coorte pai e escotilha, ao mesmo tempo, assegurando o mesmo fundo genético. Certifique-se de que as NONINF- e INF-estirpes são mantidos na mesma câmara climatizada (a 25 ± 1 ° C, com 14 horas de luz / 10 horas de escuro e 60% de humidade relativa) por uma taxa síncrono de desenvolvimento; a taxa pode variar dependendo da temperatura e humidade. Lidar com a deliccomiam larvas suavemente. </li></ol></li><li> Após 48 h, transferem as larvas individualmente para placas de 24 cavidades (uma individuais por poço) (Figura 2B). <ol><li> número sequencial de cada larva em cada poço e registrar o estágio instar e status de sobrevivência diária. </li><li> Cerca de 5 dias mais tarde, quando a dieta artificial se deteriora, transferir simultaneamente estes indivíduos para uma nova placa de 24 poços contendo fresco dieta artificial (Figura 2C). </li><li> Pesar as larvas a partir do dia 7 a 11 pós-eclosão usando uma balança analítica com uma precisão de 0,0001 g. Após a pesagem, o retorno individualmente as larvas para a placa de 24 poços. </li></ol></li><li> Após a muda para o quinto instar, após o quarto ecdise (cerca de 10 dias após a eclosão), transferir as larvas para tubos de vidro (altura 10 cm, 2 centímetros de diâmetro) (Figura 2D); quinto instar das larvas também podem ser identificados pela largura da cápsula cabeça (aproximadamente 2,6 mm). NOTA: Transferir os indivíduospara o tubo de vidro, ao mesmo tempo em cada dia. <ol><li> Código cada larva com o seu número de referência original no tubo de vidro com tinta ou marcadores. Grave o estado larval diária; no interior dos tubos de vidro, as larvas pupate após cerca de cinco dias, a fase de pupa dura cerca de 11 dias. </li><li> Registre a data pupas e eclosão de cada indivíduo no tubo de vidro. Grave a massa de pupas de 3 dias de idade. </li></ol></li><li> Após a eclosão, colocar um fêmea e um macho em uma única gaiola com sacarose a 10% e solução de vitaminas 2% (Figura 2E). Reabastecer a solução de sacarose a todos os dias. Registre a data da morte de cada traça. </li><li> Quando os ovos são colocados, mudar a gaze de algodão diária. Contar o número de ovos imediatamente. Contagem crias recém-eclodidas, enquanto que choquem. </li><li> Durante os bioensaios, seleccionar aleatoriamente oito indivíduos para cada tratamento para confirmar o estado de infecção de HaDV2. Extrai-se a ARN total das amostras utilizando o reagente de tripsina comercialseguindo o protocolo do fabricante. Sintetizar a primeira cadeia de cDNA, seguindo o protocolo do fabricante e usá-lo como um modelo para testar se os vírus são transcritos com sucesso. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nas últimas poucas décadas, a maioria dos estudos sobre as interacções-virus de insecto têm-se centrado na abelha do mel saúde 34, 35, 36, os vectores de doenças humanas 37, planta vírus 38, e alguns vírus patogénicos de insectos que têm um grande potencial como agentes de controle biológico 39. Pouca atenção tem sido dada ao vírus secretas em insetos, espe...

Nas últimas décadas, o desenvolvimento da tecnologia de sequenciação, tais como a sequenciação de última geração (NGS) facilitou a descoberta de diversos novos ADN e ARN de vírus, vírus especialmente não patogénicas, mas também novos isolados de vírus anteriormente conhecidas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. No modelo de organismo de Drosophila melanogaster, mais do que 20 novos genomas virais parciais foram detectadas utilizando técnicas de metagenomic 13. Muitas sequências virais, incluindo novos vírus, também foram identificadas em outros insectos, tais como abelhas, mosquitoes, psilídeos citrinos asiáticos, libélulas, e várias espécies de lepidópteros 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. No futuro, pode-se esperar que mais novos vírus vai ser descoberto em insetos usando essas tecnologias avançadas; Assim, a nossa compreensão da interacção hospedeiro-vírus pode mudar de acordo com 6, 9. Por exemplo, as interacções vírus-hospedeiro são considerados para ser mais complicado do que se pensava anteriormente, porque muitos vírus novos estão a ser definida como parceiros mutualistic em vez de agentes patogénicos rígidas 22. Por exemplo, o DplDNV densovírus mutualística em Dysaphis plantaginea induz a metamorfose e alado<html> aumenta a mobilidade, o que facilita a dispersão do hospedeiro, bem como o vírus 23. Além disso, os vírus mutualistas têm sido descritas com relação à saúde dos mamíferos, a seca e tolerância ao frio das plantas, bem como o impacto de infecções bacterianas 24. Seneca vale vírus-001 é mostrado para mediar a citotoxicidade selectiva para células de tumor neuroendócrino com cancro caracteriza 25. Infecções por vírus da hepatite A suprimir a replicação do vírus da hepatite C e podem conduzir a recuperação do vírus da hepatite C 26. Latência herpesvírus confere proteção simbiótica de infecção bacteriana 27. A glicoproteína do envelope do retrovírus humano endógeno HERV-W induz resistência celular ao vírus da necrose do baço 28. Curvularia vírus tolerância térmica (CThTV) a partir de um endófito de fungos está envolvido na interacção entre mutualística este fungo e um grama de pânico tropicalref &quot;&gt; 29. Por isso, o conhecimento das interacções entre os vírus recém-descobertos e seus hospedeiros deve gerar novas perspectivas sobre sua biologia e gestão. No entanto, os novos vírus, especialmente os vírus secretas exibindo sem sinais óbvios típicos de infecção aguda, tem raramente sido investigada, e precisamos de um gasoduto e protocolos para investigar os impactos dos vírus recém-descobertos em seus hospedeiros. Anteriormente, relataram a prevalência de um novo monosense densovírus Helicoverpa armigera densovírus (HaDV2) na lagarta do algodão, Helicoverpa armigera, e apresentou evidências de uma relação de mutualismo entre HaDV2 ea lagarta do algodão 30, 31. Neste papel, iremos descrever o protocolo laboratorial para estudar em detalhe a interacção entre HaDV2 e seu hospedeiro lagarta do algodão. O protocolo aqui apresentado também pode ser altamente relevante para os pesquisadores que examinam o role de outros vírus oralmente transmissíveis, especialmente em pragas de lepidópteros.

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Corning</td><td>07-200-740</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>Kit de extração de DNA</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-03</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr><td>termociclador</td><td>Veriti; Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; filtro de membrana m</td><td>Millipore</td><td>SLGS025NB</td><td></td></tr><tr><td>pEASY-T Cloning Vector</td><td>TransGen, Pequim, China</td><td>CT301-02</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>IDEAL-TEK</td><td>2.SA</td><td></td></tr><tr><td>Premix Ex Taq (Sonda qPCR)</td><td>Takara</td><td>RR390A</td><td></td></tr><tr><td>Sondas</td><td>Invitrogen</td><td>Pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Primers</td><td>Invitrogen</td><td>Pedido</td><td></td> personalizado</tr><tr><td>microespectrofotometria NanoDrop 2000c&nbsp;</td><td>Termocientífico&nbsp;</td><td>não disponível</td><td></td></tr><tr><td>7500 Sistema de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>não disponível</td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio SZX-16</td><td>Olympus</td><td>não disponível</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td></td><td></td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr><tr>complexo <td></td><td></td><td>vitamínico</td><td>Vários fornecedores disponíveis.</td></tr></tbody></table>

protocolos para investigar a distribuição host-tecido, de modo transmissão e efeito sobre a aptidão do host de um densovírus na lagarta do algodão

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Muitos vírus novos foram descobertos em hospedeiros animais, utilizando tecnologias de sequenciamento de próxima geração. Anteriormente, relatou um vírus mutualistic, Helicoverpa armigera densovírus (HaDV2), em uma espécie de lepidópteros, a lagarta do algodão, Helicoverpa armigera (Hubner). Aqui, descrevemos os protocolos que são atualmente utilizados para estudar o efeito da HaDV2 em seu hospedeiro. Primeiro, estabelecer uma colônia lagarta do algodão livre de HaDV2 partir de um único par de reprodução. Em seguida, por via oral inocular alguns prole das larvas neonato com HaDV2 que contém o líquido filtrado para produzir duas colónias com o mesmo fundo genético: um HaDV2-infectadas, o outro não infectadas. Um protocolo para comparar parâmetros de tabela de vida (por exemplo, larvas, pupas e adultos períodos e fecundidade) entre os indivíduos infectados e HaDV2--uninfected também é apresentada, assim como os protocolos para a determinação da distribuição do tecido hospedeiro e a eficiência de transmissão de HaDV2. Estes protocolos would também ser adequado para investigar os efeitos de outros vírus transmitidos por via oral sobre os seus hospedeiros de insectos lepidópteros, hospedeiros, em particular.

Progénies dos pais que estavam HaDV2-livre (Figura 3A) foram criados como o NONINF-deformação. Nós com sucesso amplificado o gene da actina utilizando os mesmos moldes de ADN, sugerindo que os moldes de ADN foram de boa qualidade (Figura 3B). Além disso, os seleccionados aleatoriamente oito progénies também estavam livres de HaDV2 (Figura 3C), HaNPV (Figura 3D), e Wolbachia (Figura 3E)....

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a distribuição de tecido hospedeiro, o modo de transmissão, eo efeito sobre a aptidão anfitrião de um densovírus dentro de uma espécie de lepidópteros, a lagarta do algodão. Este protocolo pode também ser utilizado para estudar a interacção entre outros vírus oralmente transmitidos e os seus hospedeiros de insecto.

Protocolos para investigar a distribuição Host-tecido, de modo Transmissão e Efeito sobre a aptidão do host de um densovírus na lagarta do algodão

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

O objetivo geral deste protocolo é estudar o efeito de um Densovírus, HaDV2, sobre seu hospedeiro, a lagarta-do-algodoeiro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de interação vírus-hospedeiro, como o efeito de vírus recém-identificados sobre seus hospedeiros. A principal vantagem desta técnica é que as larvas utilizadas para construir linhagens positivas e negativas para o vírus são derivadas dos mesmos pais-co-hospedeiros, garantindo a mesma origem genética.Para iniciar o experimento, realize oito acasalamentos individuais de mariposas recém-emergidas, utilizando uma gaiola de plástico por casal, coberta com gaze de algodão para garantir boa ventilação e servir como substrato para a postura dos ovos. Para aumentar a probabilidade de obter uma colônia livre de vírus, utilize pelo menos 30 pares de acasalamentos individuais. Alimente as mariposas adultas com uma bola de algodão embebida em solução de 10% de açúcar e 2% de vitaminas, e reponha a solução diariamente.No dia de hoje após o acasalamento, à medida que as fêmeas adultas depositam seus ovos na gaze de algodão, comece a trocar a gaze diariamente. Colete e mantenha as gazes contendo ovos na mesma sala de crescimento utilizada para as mariposas adultas até a eclosão dos ovos. Transfira imediatamente as larvas recém-eclodidas para novas placas de 24 poços, com um indivíduo por poço.Cinco dias após a data da primeira postura de ovos, colete as mariposas adultas e armazene-as em nitrogênio líquido. Verifique a presença de HaDV2 nos pais utilizando PCR com primers específicos e mantenha os indivíduos livres de HaDV2 como a linhagem não infectada livre de HaDV2. Colete as mariposas adultas individualmente e armazene-as imediatamente em nitrogênio líquido.Triture completamente as mariposas individuais coletadas em nitrogênio líquido utilizando um almofariz e pistilo esterilizados. Transfira cerca de 10 microgramas de resíduos para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Em seguida, transfira os resíduos restantes para um novo tubo e armazene-os imediatamente a 80 graus Celsius.Extraia o DNA dos 10 microgramas de detritos seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante. Após o isolamento do DNA da mariposa, verifique a presença de HaDV2 utilizando o protocolo. De acordo com os resultados, divida os detritos restantes em dois grupos: positivo para HaDV2 e negativo para HaDV2.Adicione um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, a cada amostra para dissolver completamente os detritos larvais remanescentes. Resfrie previamente a centrífuga a quatro graus Celsius e, em seguida, centrifugue o homogeneizado. Na presença de gelo, filtre o sobrenadante líquido com um filtro de membrana de 0,22 mícron.Colete 200 microlitros por tubo dos líquidos filtrados e armazene-os imediatamente a 80 graus Celsius. Para determinar a eficiência de infecção oral com os líquidos filtrados infectados com HaDV2 em diferentes concentrações, dilua o fluido contendo HaDV2. Em uma cabine de segurança química, espalhe uniformemente 200 microlitros dos líquidos filtrados contendo HaDV2 para cada concentração sobre a superfície da dieta artificial sólida.Em seguida, comece a transferir 100 larvas recém-eclodidas para a dieta artificial contendo HaDV2 em uma placa de Petri. Bata suavemente a gaze de algodão, que contém as larvas recém-eclodidas, para transferir as larvas da gaze para uma folha de papel branco. Bata levemente no papel para que as larvas produzam seda e se elevem do papel por balonismo.Use pin&ccedil;as esterilizadas para tocar a seda e mover as larvas para uma placa de Petri. Ap&oacute;s 48 horas, transfira uma larva individual por po&ccedil;o na dieta artificial para placas de 24 po&ccedil;os. Re-alimente as larvas inoculadas com HaDV2, utilizando as mesmas concentra&ccedil;&otilde;es at&eacute; a fase adulta.Verifique o status de infecção por HaDV2 dos adultos utilizando o protocolo. Adultos inoculados com dez elevado à oitava potência por microlitro de HaDV2 apresentaram 100% de infecção e são mantidos como linhagem positiva para HaDV2. Para prevenir contaminação, esterilize a pinça e as tesouras em etanol 75% três vezes e, em seguida, aqueça-as na chama de uma lâmpada de álcool.Usando uma balança analítica, pese os tubos vazios que serão utilizados para armazenar os tecidos. Em seguida, coloque as larvas e mariposas adultas da linhagem infectada sobre gelo por aproximadamente cinco minutos. Fixe as larvas congeladas no cystosepiment usando dois alfinetes entomológicos inseridos nas membranas intersegmentares próximas à cabeça e ao último segmento abdominal.Em seguida, no abdômen posterior, corte a perna falsa das larvas para que o hemolinfa escoe. Use uma pipeta para coletar cerca de 10 microlitros de hemolinfa larval em aproximadamente 10 segundos, para evitar escurecimento e coagulação da hemolinfa. Com uma tesoura, faça uma incisão na cutícula que se estenda desde a última membrana intersegmentar até a cabeça.Usando duas pinças, dissecar o intestino anterior, intestino médio, intestino posterior, corpo gorduroso e túbulos de Malpighi. Para evitar a contaminação dos tecidos remanescentes com hemolinfa durante a dissecação, lavar os tecidos dissecados em tampão PBS. Misturar amostras de tecidos de três indivíduos juntos como uma única replicata.Transfira imediatamente cada tecido para os tubos em nitrogênio líquido. Em uma placa de Petri limpa contendo tampão PBS, dissecar os tecidos de adultos fêmeas e machos e transferir imediatamente cada tecido para os tubos em nitrogênio líquido. Pese os tubos e os tecidos mencionados separadamente e calcule a massa dos tecidos.Extraia o DNA desses tecidos e realize a kPCR para quantificar a título viral de cada tecido. Coloque pelo menos 100 pupas ou mariposas adultas recém-emergidas derivadas da linhagem não infectada em uma gaiola de malha metálica de 5 litros coberta com gaze de algodão. Após dois dias, fêmeas adultas acasaladas começarão a depositar ovos sobre a gaze de algodão.Colete e mantenha a gaze de algodão contendo os ovos. Prossiga com a inoculação de larvas neonatas transferindo as larvas neonatas da linhagem não infectada para a dieta artificial contendo HaDV2, a fim de estabelecer a linhagem infectada. Da mesma forma, transfira larvas neonatas para a dieta artificial coberta com líquido filtrado livre de HaDV2 para estabelecer os grupos controle, ou seja, a linhagem não infectada.Inclua pelo menos 240 larvas em cada tratamento. Após 48 horas, transfira um indivíduo larval por poço para placas de 24 poços. Numere sequencialmente cada larva em cada poço e registre diariamente o estágio de ínstar e o status de sobrevivência.Aproximadamente cinco dias depois, quando a dieta artificial se deteriorar, transfira simultaneamente esses indivíduos para uma nova placa de 24 poços contendo dieta artificial fresca. Pese as larvas do sétimo ao 11º dia utilizando uma balança analítica. Após a pesagem, devolva individualmente as larvas à placa de 24 poços.Após a muda para o quinto estágio, cerca de dez dias após a eclosão, transfira as larvas para tubos de vidro. Transfira os indivíduos para o tubo de vidro no mesmo horário todos os dias. O quinto estágio larval também pode ser identificado pela largura da cápsula cefálica.Em seguida, identifique cada larva com seu número de referência original no tubo de vidro usando tinta ou marcadores. Registre diariamente o estado das larvas. Anote a data de formação da pupa e de emergência de cada indivíduo no tubo de vidro e registre a massa das pupas com três dias de idade.Após a eclosão, coloque uma fêmea e um macho em uma única gaiola com solução de 10% de sacarose e solução de 2% de vitaminas. Reponha a solução de sacarose diariamente. Registre a data de morte de cada mariposa.Quando os ovos forem postos, troque a gaze de algodão diariamente. Conte imediatamente o número de ovos. Por fim, conte as proles recém-eclodidas enquanto elas eclodem.Foram realizados três ensaios para garantir a qualidade dos espécimes utilizados no experimento. Progênies provenientes de pais machos e fêmeas livres de HaDV2 foram criadas como a linhagem não infectada. Amplificamos com sucesso o gene da actina em pais e progênies utilizando o mesmo molde de DNA, sugerindo que os moldes de DNA eram de boa qualidade.As oito progênies selecionadas aleatoriamente também estavam livres de HaDV2, HaNPV e Wolbachia. Uma curva padrão definindo a relação entre o log da quantidade de material inicial e os valores de CT obtidos mostra uma forte correlação linear entre os valores de CT e o log do número inicial de cópias do gene de HaDV2. O número de cópias de HaDV2 foi calculado por micrograma de cada tecido, e a porcentagem do título total de HaDV2 para o tecido específico revelou que HaDV2 estava principalmente distribuído no corpo gorduroso.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular as larvas delicadas durante os primeiros cinco dias após a eclosão em todo o procedimento.

protocols-for-investigating-host-tissue-distribution-transmission

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos técnicas de infecção oral de larvas de lepidópteros com baculovírus, a fim de determinar a eficiência inseticida.

Protocolos para a Infecção Oral de lagartas de Lepidoptera com Baculovirus

Melhorar a nossa compreensão e nossa capacidade de gerir muitos dos vírus de plantas a insetos transmitidas requer o uso do vetor. Insecto de transmissão de vírus de plantas é uma interacção tritrófica, e como tal requer a manipulação de insetos, vírus e vegetais. Vectores deve ser criado em grandes números e manipulado de tal forma que para assegurar altas taxas de transmissão para as plantas de teste. As noções básicas de criação e manipulação de...

Transmissão de vírus de plantas Usando Whiteflies

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Harvesting Recombinant Aedes aegypti Densovirus from Infected Cells

Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Os ratos de algodão são extremamente excitáveis e têm uma forte resposta de fuga ou luta. Um método de manejo otimizado para reduzir o estresse dos animais é descrito, o que tornará os ratos de algodão mais acessíveis como um modelo pré-clínico.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Nós relatamos usando uma artificial intrônicas pequeno RNA expressão estratégia para desenvolver um recombinante com defeito não Aedes aegypti densovirus (AaeDV) na vivo sistema de entrega. Um procedimento detalhado para a construção, embalagens e análise quantitativa dos vetores rAaeDV tão bem quanto a infecção larval é descrito.

Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Tabelas de vida permitem a quantificação das fontes e as taxas de mortalidade nas populações de insetos e contribuam para a compreensão, previsão e manipulação dinâmica populacional em agroecossistemas. São apresentados métodos para realização e análise de tabelas de vida baseada em coorte no campo para um inseto com estágios de vida imatura séssil.

Metodologia para desenvolvimento de tabelas de vida para insetos sésseis no campo utilizando a mosca branca, Bemisia tabaci, em algodão como um modelo de sistema

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Aqui, um protocolo é apresentado para a seleção não-destrutiva rápida de genótipos do algodão para a resistência do nematóide do reniformes. O protocolo envolve o exame visual das raízes de mudas de algodoeiro infectadas com nematoides para determinar a resposta da infecção. O disparo vegetativo de cada planta é então propagado para recuperar plantas para a produção de sementes.

Triagem de genótipos de algodão para resistência ao nematódeo reniforme

Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

Descrevemos um método de imunofluorescência e PCR quantitativo para localização e quantificação de begomovírus em tecidos de insetos. O protocolo de imunofluorescência pode ser usado para colocalizar proteínas virais e vetores. O protocolo quantitativo PCR pode ser estendido para quantificar vírus em corpos inteiros de moscas brancas e plantas infectadas por vírus.

Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

Aprenda a investigar a distribuição tecidual, transmissão e efeitos na aptidão do hospedeiro do densovírus HaDV2 na lagarta do algodoeiro. Este protocolo viabiliza estudos controlados de interações vírus-inseto.

Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro (Vídeo) | JoVE Journal

Protocolos para investigar a distribuição Host-tecido, de modo Transmissão e Efeito sobre a aptidão do host de um densovírus na lagarta do algodão

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