Protocolos para investigar a distribuição no tecido hospedeiro, o modo de transmissão e o efeito na aptidão do hospedeiro de um Densovírus na lagarta do algodoeiro

O objetivo geral deste protocolo é estudar o efeito de um Densovírus, HaDV2, em seu hospedeiro, Cotton Bollworm. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de interação vírus-host, como o efeito de um vírus agora em seus hospedeiros. A principal vantagem dessa técnica que as larvas usam para construir cepas positivas e negativas para vírus são derivadas dos mesmos par-ne-co-hospedeiros, garantindo o mesmo fundo genético.

Para iniciar o experimento, oito acasalamentos de pares únicos de mariposas recém-fechadas usando uma gaiola de plástico por par coberta com gaze de algodão para garantir uma boa ventilação e servir como substrato de posição do óvulo. Para aumentar a probabilidade de obter uma colônia livre de vírus, utilize pelo menos 30 pares de acasalamentos de par único. Alimente as mariposas adultas com uma bola de algodão embebida em solução de 10% de açúcar e 2% de vitamina e reabasteça a solução diariamente.

O pós-acasalamento de hoje, quando as fêmeas adultas colocam seus ovos na gaze de algodão, começam a trocar a gaze diariamente. Colete e mantenha os ovos contendo gaze na mesma sala de crescimento que as mariposas adultas até que os ovos eclodam. Transfira imediatamente as larvas recém-eclodidas para novas placas de 24 poços com um indivíduo por poço.

Cinco dias após a primeira data de postura, colete as mariposas e armazene-as em nitrogênio líquido. Verifique a presença de HaDV2 dos pais usando PCR com primers específicos e mantenha os indivíduos livres de HaDV2 como a cepa não infectada livre de HaDV2. Colete mariposas adultas individualmente e armazene-as imediatamente em nitrogênio líquido.

Moa completamente as mariposas individuais coletadas em nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão esterilizados. Transfira cerca de 10 microgramas de detritos para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Em seguida, transfira os detritos restantes para um novo tubo e armazene-os imediatamente a 80 graus Celsius.

Extraia o DNA dos 10 microgramas de detritos seguindo os protocolos fornecidos pelo fabricante. Uma vez que o DNA da mariposa tenha sido isolado, verifique se há HaDV2 usando o protocolo. De acordo com os resultados, divida os detritos restantes em dois grupos: HaDV2 positivo e HaDV2 negativo.

Adicione um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, a cada indivíduo para dissolver completamente os detritos larvais restantes. Pré-resfrie a centrífuga a quatro graus Celsius e, em seguida, gire o homogeneizado. No gelo, filtre o sobrenadante líquido com o filtro de membrana de 0,22 mícron.

Colete 200 microlitros por tubo dos líquidos filtrados e armazene-os imediatamente a 80 graus Celsius. Determinar a eficiência da infecção oral com os líquidos filtrados infectados com HaDV2 de diferentes concentrações, diluindo o fluido contendo HaDV2. Em uma capela de exaustão espalhe uniformemente 200 microlitros de HaDV2 contendo líquidos filtrados para cada concentração na superfície da dieta artificial sólida.

Em seguida, comece a transferir 100 larvas recém-eclodidas para o HaDV2 contendo dieta artificial em uma placa de Petri. Bata suavemente a gaze de algodão, incluindo as larvas recém-nascidas, para transferir as larvas da gaze para uma folha de papel branco. Bata o papel suavemente para que as larvas girem a seda e o balão do papel.

Use uma pinça esterilizada para tocar a seda e mover as larvas para uma placa de Petri. Após 48 horas, transfira uma larva individual por poço na dieta artificial para placas de 24 poços. Re-ar as larvas inoculadas com HaDV2, usando as mesmas concentrações para a fase adulta.

Verifique o status de infecção por HaDV2 dos adultos usando o protocolo. Adultos inoculados com 10 elevado ao oitavo número de cópias por microlitro de HaDV2 produziram 100% de infecção e são mantidos como cepa positiva para HaDV2. Para evitar contaminação, esterilize a pinça e a tesoura em etanol 75% três vezes e depois aqueça-as na chama de uma lâmpada de álcool.

Com uma balança analítica, pesar os tubos vazios que serão usados para armazenar os tecidos. Em seguida, coloque as larvas e mariposas adultas da cepa infectada no gelo por aproximadamente cinco minutos. Fixe as larvas congeladas no cistossépimento usando dois pinos de insetos inseridos nas membranas intersegmentares perto da cabeça e do último segmento do abdômen.

Em seguida, no abdômen posterior, corte a properna das larvas para que a hemolinfa flua para fora. Use uma pipeta para pipetar cerca de 10 microlitros de hemolinfa larval em cerca de 10 segundos para evitar o escurecimento e a coagulação da hemolinfa. Com uma tesoura faça uma incisão na cutícula que vai desde a última membrana intersegmentar até a cabeça.

Usando duas pinças, disseque o intestino anterior, o intestino médio, o intestino grosso, o corpo gorduroso e os túbulos de Malpighi. Para evitar a contaminação dos tecidos remanescentes com a hemolinfa durante a dissecção, lave os tecidos dissecados em tampão PBS. Misture amostras de tecido de três indivíduos como um replicante.

Transfira imediatamente cada tecido para os tubos em nitrogênio líquido. Em uma placa de Petri limpa contendo tampão PBS, disseque os tecidos de adultos femininos e masculinos e transfira imediatamente cada tecido para os tubos em nitrogênio líquido. Pesar os tubos e os tecidos acima juntos separadamente e calcular a massa dos tecidos.

Extraia o DNA desses tecidos e realize kPCR para quantificar o título viral de cada tecido. Coloque pelo menos 100 pupas ou mariposas adultas recém-emergidas derivadas da cepa não infectada em uma gaiola de malha de arame de 5 litros coberta com gaze de algodão. Após dois dias, as fêmeas adultas acasaladas começarão a botar ovos na gaze de algodão.

Colete e mantenha a gaze de algodão contendo os ovos. Prossiga com a inoculação de larvas de recém-nascidos transferindo as larvas de recém-nascidos da cepa não infectada para a dieta artificial contendo HaDV2 para estabelecer a cepa infectada. Da mesma forma, transferir larvas de recém-nascidos para a dieta artificial coberta com líquido filtrado livre de HaDV2 para estabelecer os grupos controle, a cepa não infectada.

Incluir pelo menos 240 larvas em cada tratamento. Após 48 horas, transfira uma larva individual por poço para placas de 24 poços. Numere sequencialmente cada larva em cada poço e registre o estágio de ínstar e o status de sobrevivência diariamente.

Cerca de cinco dias depois, quando a dieta artificial se deteriora, transfira simultaneamente esses indivíduos para um novo prato de 24 poços contendo dieta artificial fresca. Pesar as larvas do sétimo ao 11º dia com uma balança analítica. Após a pesagem, retorne individualmente as larvas para a placa de 24 poços.

Após a muda para o quinto ínstar, cerca de dez dias após a eclosão, transfira as larvas para tubos de vidro. Transfira os indivíduos para o tubo de vidro no mesmo horário todos os dias. As larvas de quinto ínstar também podem ser identificadas pela largura da cápsula da cabeça.

Em seguida, codifique cada larva com seu número de referência original no tubo de vidro usando tinta ou marcadores. Registre o status larval diariamente. Registre as pupas e a data de eclosão de cada indivíduo no tubo de vidro e registre a massa de pupas de três dias.

Após a eclosão, coloque uma fêmea e um macho em uma única gaiola com 10% de sacarose e 2% de solução de vitamina. Reabasteça a solução de sacarose todos os dias. Registre a data da morte de cada mariposa.

Quando os ovos forem postos, troque a gaze de algodão diariamente. Conte o número de ovos imediatamente. Finalmente, conte os filhotes recém-nascidos enquanto eles eclodem.

Tri-ais foram realizados para garantir a qualidade dos espécimes utilizados no experimento. Progênies de pais machos e fêmeas livres de HaDV2 foram criadas como a cepa não infectada. Amplificamos com sucesso o gene da actina em pais e progênies usando o mesmo molde de DNA, sugerindo que os moldes de DNA eram de boa qualidade.

As oito progênies selecionadas aleatoriamente também estavam livres de HaDV2, HaNPV e Wolbachia. Uma curva padrão que define a relação entre o log da qualidade do material de partida e os valores de CT obtidos mostra uma forte correlação linear entre os valores de CT e o log do número inicial de cópias do gene de HaDV2. O número de cópias do HaDV2 foi calculado por micrograma de cada tecido, e a porcentagem do título total de HaVD2 para o tecido específico revelou que o HaDV2 estava distribuído principalmente no corpo adiposo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as larvas delicadas durante os primeiros cinco dias após a eclosão durante o procedimento de en-tire.