Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.

O objetivo geral deste experimento é avaliar os efeitos de uma infecção bacteriana na capacidade das células hospedeiras de formar grânulos de estresse para responder ao estresse exógeno. Este método é uma ferramenta valiosa no campo da microbiologia celular para avaliar se um determinado patógeno é ou não capaz de alterar ou subverter toda a via do grânulo de estresse. A principal vantagem desta técnica é que os grânulos de tensão podem ser analisados qualitativa e quantitativamente de maneira rigorosa e automatizada usando programas gratuitos de análise de imagem.

Este método fornece informações sobre a dinâmica da formação e composição de grânulos de tensão e como esses parâmetros são afetados por um patógeno específico. Obrigado. Antes de iniciar o desafio, inocule uma colônia de bactérias vermelhas S.flexneri M90T de uma placa de ágar tríptico de soja 1% Congo recém-listrada em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo oito mililitros de caldo de soja tríptico.

Depois de apertar a tampa, incube a colônia durante a noite com agitação a 222 RPM e 30 graus Celsius. No dia seguinte, subcultive 150 microlitros da bactéria em oito mililitros de caldo de soja tríptico fresco por cerca de duas horas a 37 graus Celsius e 222 RPM para iniciar uma indução de fase exponencial tardia da expressão gênica de virulência e aumentar a infectabilidade bacteriana. Quando a densidade óptica da subcultura estiver entre 0,6 e 0,9, transferir um mililitro da bactéria para um tubo de 1,5 mililitro para sua coleta por centrifugação.

E ressuspenda o pellet em meio de infecção com uma densidade óptica de um. Em seguida, aspire os sobrenadantes de cada poço de uma cultura de lamínula de células HeLa. E lave cuidadosamente as células HeLa com 500 microlitros de meio de célula HeLa fresco em temperatura ambiente por poço.

Substitua a lavagem por 500 microlitros de meio de infecção por poço e centrifugue a placa de 24 poços para girar as bactérias nas células. Transfira as coculturas bacterianas estabelecidas para uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius por 30 minutos para facilitar a infecção da célula hospedeira. No final da incubação, remova as bactérias exógenas das células com três enxágues em um mililitro de meio de cultura HeLa fresco a 37 graus Celsius por lavagem.

Em seguida, cubra as células infectadas com um mililitro de meio de cultura fresco contendo gentamicina e retorne a placa à incubadora de cultura de células. No final da incubação, substitua o meio por 500 microlitros do meio de cultura apropriado, suplementado com o estressor de interesse, e retorne as células à incubadora de cultura de tecidos. Após uma hora, aspire o sobrenadante completamente e fixe as amostras em 0,5 mililitros de paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente em PBS por 30 minutos.

Em seguida, descarte o fixador no recipiente de lixo apropriado e lave as lamínulas com um mililitro de solução salina tamponada com tris por dois minutos com agitação suave. No final da lavagem, aspire completamente o TBS e permeabilize as células em cada poço com 500 microlitros de 0,3%Triton X-100 em TBS. Após 10 minutos, substitua a solução permeabilizante por um mililitro de TBS, agite a placa suavemente e substitua o TBS por um mililitro de solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente.

Para rotular as células com um coquetel de anticorpos primários de interesse, coloque 50 microlitros da mistura de anticorpos primários por lamínula em um pedaço de parafilme plástico firmemente colado na bancada. Em seguida, use uma pinça para pegar a primeira lamínula. E passe a borda da lamínula em um pedaço de papel de seda para remover o excesso de líquido.

Coloque cuidadosamente a lamínula na gota e incube as lamínulas sob as condições de rotulagem apropriadas. No final da incubação de rotulagem de anticorpos primários, transfira cada lamínula para um poço individual de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de TBS por poço e lave as células em temperatura ambiente em um agitador de placas por cinco minutos três vezes. Após a última lavagem, rotule as células em cada lamínula com a mistura apropriada de coquetel de anticorpos secundários, como acabamos de demonstrar.

E incube as lamínulas no escuro por uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação de marcação de anticorpos secundários, lave as células em um mililitro de PBS três vezes em uma nova placa de 24 poços com agitação suave, como acabamos de demonstrar, mas protegidas da luz. Após a última lavagem, mergulhe brevemente cada lamínula em água deionizada para remover o sal, passe as bordas da lamínula em um lenço de papel e monte cuidadosamente as lamínulas em cinco microlitros de meio de montagem de fluorescência por lâmina de microscópio de vidro sem bolhas.

Em seguida, sele a lamínula com esmalte. E armazene os slides conforme apropriado até a imagem. Para obter imagens das células por microscopia confocal de fluorescência, comece selecionando a objetiva apropriada e os canais fluorescentes apropriados para aquisição de imagens.

Em seguida, adquira pilhas de imagens das células, usando o software de imagem apropriado. Quando todas as imagens tiverem sido capturadas, use o software de análise de imagem apropriado para recolher as pilhas de imagens e salvá-las como arquivos TIFF. Em seguida, carregue um controle e uma imagem TIFF experimental na plataforma de análise de imagem e selecione Tabela de pesquisa para abrir os parâmetros do canal na janela Sequência.

Clique em todas as caixas de seleção da guia de canal para desativar todos os canais. Em seguida, clique no canal zero e clique na barra de cores do canal zero para selecionar a cor preferida, aumentando a intensidade do canal conforme necessário para visualizar todas as estruturas. Depois de selecionar e ajustar cada um dos canais de cores apropriados para a análise experimental, selecione a guia de tela e ajuste a guia de zoom para visualizar cerca de 10 células por campo de visualização.

Usando a ferramenta polígono, clique na célula de interesse e estenda a linha ao redor da célula para delinear o limite da célula. Para nomear essa região de interesse, na janela da região de interesse, clique com o botão direito do mouse na célula de interesse e clique duas vezes no nome da região de interesse para modificá-la. Depois de selecionar e nomear todas as células de interesse da mesma maneira, abra o aplicativo Detector de Pontos na guia de detecção e rastreamento.

Abra a guia Pré-processamento e selecione o canal a ser analisado. Na guia Detector, selecione Detectar pontos brilhantes sobre fundo escuro e selecione a escala e a sensibilidade apropriadas. Na guia Região de interesse, selecione a região de interesse sugerida na sequência.

Na guia Filtragem, selecione NoFiltering. Na guia Saída, selecione a saída apropriada. Selecione Remover pontos anteriores renderizados como regiões de interesse e clique em nenhum arquivo selecionado para selecionar a pasta para salvar o arquivo.

Em seguida, na guia Exibir, selecione as opções apropriadas de interesse e clique em Iniciar detecção. Dentro do software de análise de imagem, o detector de pontos pode ser usado para identificar os grânulos de tensão dentro de cada uma das regiões de interesse designadas. Uma imagem binária pode então ser gerada para exibir todos os grânulos de tensão identificados.

A análise de grânulos de tensão deve ser cuidadosamente adaptada a cada mercado de grânulos de tensão analisado. Por exemplo, alterar o requisito de tamanho da região de interesse detectada ou alterar a sensibilidade dos parâmetros de detecção leva a resultados variados. Em escalas de tamanho de pixel mais altas, grânulos de tensão menores não serão contados e o número de grânulos de tensão diminuirá.

Enquanto o aumento da sensibilidade resulta em um aumento no número de grânulos de tensão. Por exemplo, neste experimento, uma escala de dois com sensibilidade de 100 deu o melhor resultado do marcador de grânulos de tensão G3BP1. Enquanto uma escala de dois com sensibilidade de 55 deu o melhor resultado para o marcador de grânulos de tensão EIF3B.

A área de superfície pode então ser calculada a partir do tamanho dos grânulos de tensão. Os gráficos de distribuição de frequência são úteis para destacar mudanças no tamanho dos grânulos de tensão entre diferentes populações de células. Além disso, a intensidade da fluorescência pode fornecer informações sobre a qualidade dos grânulos de tensão analisados.

Uma vez dominado, todo o desafio celular pode ser feito em cerca de seis a sete horas, e a análise pode ser concluída em mais duas a três horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre processar as amostras de controle e experimentais ao mesmo tempo e sob as mesmas condições para minimizar a variabilidade nos dados. Seguindo este procedimento, a análise também pode ser estendida para um volume tridimensional para obter informações adicionais sobre a localização do grânulo de tensão.

Este procedimento semiautomatizado permite uma análise rigorosa e imparcial dos grânulos de estresse em células não infectadas e infectadas. Pode revelar subversões anteriormente desconhecidas da via do grânulo de tensão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como infectar células com bactérias, como induzir a formação de grânulos de estresse e como usar uma abordagem semiautomatizada para analisar grânulos de estresse de maneira qualitativa e quantitativa.

E não se esqueça de que, com Shigella flexneri e grânulos de estresse, agentes indutores como o clotrimazol podem ser perigosos, e que precauções como usar luvas, trabalhar em um laboratório BL2 e descartar adequadamente todos os reagentes são necessárias.