Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

O objetivo geral deste experimento é avaliar os efeitos de uma infecção bacteriana na capacidade das células hospedeiras de formar grânulos de estresse em resposta a estresse exógeno. Este método é uma ferramenta valiosa na área de microbiologia celular para determinar se um determinado patógeno é capaz de alterar ou subverter toda a via de formação de grânulos de estresse. A principal vantagem desta técnica é que os grânulos de estresse podem ser analisados de forma qualitativa e quantitativa de maneira rigorosa e automatizada, utilizando programas gratuitos de análise de imagens.

Este método fornece informações sobre a dinâmica da formação e composição de grânulos de estresse e como esses parâmetros são afetados por um patógeno específico. Obrigado. Antes de iniciar o desafio, inocular uma colônia vermelha de bactéria S.flexneri M90T de uma placa recentemente estriada de ágar tripticaseína soja com 1% de ágar vermelho Congo em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo oito mililitros de caldo tripticaseína soja.

Após fechar a tampa, incubar a colônia durante a noite com agitação a 222 RPM e 30 graus Celsius. No dia seguinte, fazer uma subcultura de 150 microlitros das bactérias em oito mililitros de caldo tripticasa soja fresco por cerca de duas horas a 37 graus Celsius e 222 RPM para iniciar a indução na fase exponencial tardia da expressão dos genes de virulência e para aumentar a infectabilidade bacteriana. Quando a densidade óptica da subcultura estiver entre 0,6 e 0,9, transferir um mililitro das bactérias para um tubo de 1,5 mililitro para sua coleta por centrifugação.

E ressuspenda o pellet em meio de infecção com densidade óptica de um. Em seguida, aspire os sobrenadantes de cada poço de um cultivo de lâminas com células HeLa. E lave cuidadosamente as células HeLa com 500 microlitros de meio fresco para células HeLa à temperatura ambiente por poço.

Substitua a lavagem por 500 microlitros de meio de infecção por poço e centrifugue a placa de 24 poços para sedimentar as bactérias sobre as células. Transfira as coculturas bacterianas sedimentadas para um incubador de cultura tecidual a 37 graus Celsius por 30 minutos para facilitar a infecção das células hospedeiras. Ao final da incubação, remova as bactérias exógenas das células com três lavagens de um mililitro de meio de cultura de células HeLa fresco a 37 graus Celsius por lavagem.

Em seguida, cubra as células infectadas com um mililitro de meio de cultura fresco contendo gentamicina e retorne a placa ao incubador de cultura celular. Ao final da incubação, substitua o meio por 500 microlitros do meio de cultura apropriado, suplementado com o agente estressor de interesse, e retorne as células ao incubador de cultura de tecidos. Após uma hora, aspire completamente o sobrenadante e fixe as amostras em 0,5 mililitros de paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, descarte o fixador no recipiente de resíduos apropriado e lave as lamínulas com um mililitro de solução salina tamponada com tris durante dois minutos com agitação suave. Ao final da lavagem, aspire completamente o TBS e permeabilize as células em cada poço com 500 microlitros de Triton X-100 0,3% em TBS. Após 10 minutos, substitua a solução permeabilizante por um mililitro de TBS, agite suavemente a placa e substitua o TBS por um mililitro de solução bloqueadora por uma hora à temperatura ambiente.

Para marcar as células com um coquetel de anticorpos primários de interesse, coloque 50 microlitros da mistura de anticorpos primários por lamínula sobre um pedaço de Parafilm de plástico firmemente fixado na bancada. Em seguida, use pinças para pegar a primeira lamínula e toque a borda da lamínula em um pedaço de papel-toalha para remover o excesso de líquido.

Coloque cuidadosamente a lamínula sobre a gota e incube as lamínulas nas condições apropriadas de marcação. Ao final da incubação com o anticorpo primário, transfira cada lamínula para um poço individual de uma nova placa de 24 poços contendo um mililitro de TBS por poço e lave as células à temperatura ambiente em um agitador de placas durante cinco minutos, três vezes. Após a última lavagem, marque as células em cada lamínula com a mistura apropriada de coquetel de anticorpo secundário, conforme acabou de ser demonstrado.

E incubar as lamínulas no escuro por uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação com o anticorpo secundário, lavar as células com um mililitro de PBS três vezes em uma nova placa de 24 poços com agitação suave, conforme acabou de ser demonstrado, mas protegido da luz. Após a última lavagem, mergulhar brevemente cada lamínula em água desionizada para remover o sal, secar levemente as bordas das lamínulas em um papel absorvente e montar cuidadosamente as lamínulas sobre cinco microlitros de meio de montagem fluorescente por lâmina de microscopia de vidro, sem formar bolhas.

Em seguida, selar a lamínula com esmalte de unha. E armazenar as lâminas adequadamente até a aquisição de imagens. Para observar as células por microscopia confocal de fluorescência, comece selecionando o objetivo apropriado e os canais fluorescentes adequados para a aquisição de imagens.

Em seguida, adquira pilhas de imagens das células utilizando o software de imagem apropriado. Quando todas as imagens tiverem sido capturadas, utilize o software adequado de análise de imagem para colapsar as pilhas de imagens e salve-as como arquivos TIFF. A seguir, carregue uma imagem TIFF controle e uma experimental na plataforma de análise de imagem e selecione Lookup Table para abrir os parâmetros do canal na janela Sequence.

Clique em todas as caixas de seleção das guias de canal para desativar todos os canais. Em seguida, clique no canal zero e na barra de cor do canal zero para selecionar a cor desejada, aumentando a intensidade do canal conforme necessário para visualizar todas as estruturas. Após selecionar e ajustar cada um dos canais de cor apropriados para a análise experimental, selecione a guia de tela e ajuste a guia de zoom para visualizar cerca de 10 células por campo de visão.

Usando a ferramenta de polígono, clique na célula de interesse e estenda a linha ao redor da célula para delimitar o contorno celular. Para nomear esta região de interesse, na janela de região de interesse, clique com o botão direito na célula de interesse e clique duas vezes no nome da região de interesse para modificá-lo. Após selecionar e nomear todas as células de interesse da mesma maneira, abra o aplicativo Spot Detector dentro da guia de detecção e rastreamento.

Abra a guia Pré-processamento e selecione o canal a ser analisado. Na guia Detector, selecione Detectar pontos brilhantes sobre fundo escuro e escolha a escala e sensibilidade apropriadas. Na guia Região de Interesse, selecione a região de interesse sugerida na sequência.

No separador Filtragem, selecione SemFiltragem. No separador Saída, selecione a saída apropriada. Selecione Remover pontos anteriores renderizados como regiões de interesse e clique em nenhum arquivo selecionado para selecionar a pasta onde o arquivo será salvo.

Em seguida, na guia Exibição, selecione as opções apropriadas de interesse e clique em Iniciar Detecção. No software de análise de imagens, o detector de pontos pode ser usado para identificar os grânulos de estresse dentro de cada uma das regiões de interesse designadas. Uma imagem binária pode então ser gerada para exibir todos os grânulos de estresse identificados.

A análise de grânulos de estresse deve ser cuidadosamente adaptada a cada mercado de grânulos de estresse analisado. Por exemplo, alterar o requisito de tamanho da região de interesse detectada ou modificar a sensibilidade dos parâmetros de detecção leva a resultados variáveis. Em escalas maiores de tamanho de pixel, grânulos de estresse menores não serão contabilizados, e o número de grânulos de estresse diminuirá.

Embora o aumento da sensibilidade resulte em um aumento no número de grânulos de estresse. Por exemplo, neste experimento, uma escala de dois com uma sensibilidade de 100 forneceu o melhor resultado para o marcador de grânulos de estresse G3BP1. Enquanto uma escala de dois com uma sensibilidade de 55 forneceu o melhor resultado para o marcador de grânulos de estresse EIF3B.

A área de superfície pode então ser calculada a partir do tamanho das granulações de estresse. Gráficos de distribuição de frequência são úteis para destacar mudanças no tamanho das granulações de estresse entre diferentes populações celulares. Além disso, a intensidade da fluorescência pode fornecer informações sobre a qualidade das granulações de estresse analisadas.

Uma vez dominado, o desafio de célula inteira pode ser realizado em cerca de seis a sete horas, e a análise pode ser concluída em mais duas a três horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de sempre processar as amostras controle e experimentais ao mesmo tempo e nas mesmas condições, para minimizar a variabilidade dentro dos dados. Após este procedimento, a análise também pode ser estendida a um volume tridimensional para obter insights adicionais sobre a localização dos grânulos de estresse.

Este procedimento semi-automatizado permite uma análise rigorosa e imparcial de grânulos de estresse em células não infectadas e infectadas. Ele pode revelar subversões previamente desconhecidas na via de grânulos de estresse. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como infectar células com bactérias, como induzir a formação de grânulos de estresse e como utilizar uma abordagem semi-automatizada para analisar grânulos de estresse de maneira qualitativa e quantitativa.

E não se esqueça de que Shigella flexneri e agentes indutores de grânulos de estresse, como o clotrimazol, podem ser perigosos, e que precauções, como o uso de luvas, o trabalho em laboratório BL2 e a correta descarte de todos os reagentes, são necessárias.