Name: Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprenda a analisar a formação de grânulos de estresse em células de mamífero após desafio bacteriano usando imunofluorescência. Este método automatizado permite investigar respostas celulares em interações hospedeiro-patógeno.

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O PS é um destinatário da subvenção do Grand Challenge de Bill e Melinda Gates OPP1141322. O PV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da mobilidade pós-doutora da Fundação Nacional da Ciência Nacional da Suíça e uma bolsa de pós-doutorado Roux-Cantarini. O PJS é suportado por uma concessão HHMI e ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito descreve a indução, localização e análise de SGs em células não infectadas e células infectadas com o patógeno citosólico S. flexneri na presença ou ausência de estresse exógeno. Com o uso de software de imagem livre, os protocolos permitem a análise qualitativa e quantitativa precisa da formação de SG para identificar e abordar de forma estatística as diferenças em determinados fenótipos. Existem vários passos críticos dentro do protocolo para a infecção, ...

A visualização das interações hospedeiro-patógeno em um nível celular é um método poderoso para obter informações sobre estratégias patogênicas e para identificar caminhos celulares chave. Na verdade, os agentes patogênicos podem ser usados ​​como ferramentas para identificar alvos ou estruturas celulares importantes, pois os agentes patogênicos evoluíram para subverter processos celulares centrais como uma estratégia para sua própria sobrevivência ou propagação. A visualização de componentes celulares pode ser conseguida por proteínas de hospedeiro marcadas fluorescentemente com expressão de forma recombinante. Embora isso permita uma análise em tempo real, a geração de linhas celulares com proteínas hospedeiras especificamente marcadas é altamente laboriosa e pode resultar em efeitos colaterais indesejáveis. Mais conveniente é a detecção de fatores celulares usando anticorpos específicos, porque vários fatores do hospedeiro podem ser analisados ​​simultaneamente e um não está limitado a um tipo de célula particular. Uma desvantagem é que apenas uma visão estática pode ser capturada à medida que a análise de imunofluorescência requer a fixação de célula hospedeiraíon. No entanto, uma vantagem importante da imagem de imunofluorescência é que se presta facilmente a análise tanto qualitativa como quantitativa. Isso, por sua vez, pode ser usado para obter diferenças estatisticamente significativas para fornecer novos conhecimentos sobre interações hospedeiro-patógeno. Os programas de análise de imagens fluorescentes são poderosas ferramentas analíticas para realizar análises 3D e 4D. No entanto, o alto custo do software e sua manutenção tornam mais atraentes os métodos baseados em software livre de código aberto. A análise cuidadosa da imagem usando o software de bioanálise é valiosa porque sustenta a análise visual e, ao atribuir significados estatísticos, aumenta a confiança na correção de um determinado fenótipo. Anteriormente, os SGs foram analisados ​​usando o software ImageJ gratuito, o que requer a identificação manual de SGs individuais 4 . Aqui fornecemos um protocolo para a indução e análise da formação de SG celular no contexto de bacInfecções teriais usando o software livre de análise de bio-imagem de código aberto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). O software de análise de bio-imagem possui um programa integrado de detectores de pontos que é altamente adequado para análise de SG. Permite o ajuste fino do processo de detecção automatizada em Regiões de Interesse (ROIs) especificadas. Isso supera a necessidade de análise manual de SGs individuais e remove o viés de amostragem. Muitos estresses ambientais induzem a formação de SGs, que são estruturas citossólicas, não membranosas densas em fase, de 0,2 a 5 μm de diâmetro 5 , 6 . Esta resposta celular é conservada evolutivamente em leveduras, plantas e mamíferos e ocorre quando a tradução global de proteínas é inibida. Envolve a agregação de complexos de iniciação de tradução estancados em SGs, que são considerados lugares de espera para mRNAs ativamente translacionais, o que permite a tradução seletiva de um subconjunto de mRNAs celulares.Após a remoção do estresse, os SGs se dissolvem e as taxas globais de resumo da síntese protéica. Os SGs são compostos de fatores de iniciação da alongamento da tradução, proteínas envolvidas no metabolismo do RNA, proteínas de ligação ao RNA, além de proteínas de andaimes e fatores envolvidos na sinalização celular do hospedeiro 2 , embora a composição exata possa variar dependendo do estresse aplicado. Os fatores ambientais que induzem a formação do SG incluem a inanição de aminoácidos, irradiação UV, choque térmico, choque osmótico, estresse do retículo endoplasmático, hipoxia e infecção viral 2 , 7 , 8 . Muitos progressos foram feitos para entender como os vírus induzem e também subverter a formação do SG, enquanto pouco se sabe sobre como outros agentes patogênicos, como patógenos bacterianos, fúngicos ou protozoários, afetam essa resposta de estresse celular 1 , 7 . ShigeLla flexneri é um patógeno citossico facultativo gram-negativo dos seres humanos e o agente causador de diarréia grave ou shigelose. A shigelose é um grande fardo para a saúde pública e leva a 28 mil mortes por ano em crianças com menos de 5 anos de idade 9 , 10 . S. flexneri infecta o epitélio colônico e se espalha de célula para célula ao seqüestrar os componentes do citoesqueleto do hospedeiro 11 , 12 . A infecção do epitélio apóia a replicação de S. flexneri no citosol, mas os macrófagos infectados morrem através de um processo inflamatório de morte celular chamado pirotecto. A infecção leva a um recrutamento maciço de neutrófilos e inflamação grave que é acompanhada por calor, estresse oxidativo e destruição tecidual. Assim, enquanto as células infectadas estão sujeitas a estresses internos induzidos por infecção, como a ruptura de Golgi, estresse genotóxico e rearranjo do citoesqueletoS, as células infectadas também são submetidas a estresses ambientais devido ao processo inflamatório. A caracterização do efeito da infecção por S. flexneri sobre a capacidade das células para responder a estresses ambientais usando uma série de marcadores de SG demonstrou que a infecção leva a diferenças qualitativas e quantitativas na composição SG 3 . No entanto, pouco se sabe sobre outros agentes patogênicos bacterianos. Aqui descrevemos uma metodologia para a infecção de células hospedeiras com o patógeno citossolo S. flexneri , o estressamento de células com diferentes estresses ambientais, a rotulagem de componentes de SG e a análise qualitativa e quantitativa da formação e composição de SG no contexto de infecção E células não infectadas. Este método é amplamente aplicável a outros agentes patogênicos bacterianos. Além disso, a análise de imagem da formação de SG pode ser usada para infecções por vírus ou outros agentes patogênicos. Pode ser usado para analisar SGFormação após a infecção ou o efeito da infecção na formação de SG em resposta a estresses exógenos.

<table><tbody><tr><td><forte>Anticorpos Primários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), cabra de origem&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>Marcador SG robusto e amplamente utilizado. A coloração citosólica permite o delineamento celular. Diluição 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20), cabra de origem&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16378</td><td>O mesmo alvo do eIF3b (N20) e em nossas mãos era idêntico ao eIF3b (N20). Diluição 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), coelho de origem (MC: monoclonal)</td><td>Sinalização Celular</td><td>3411</td><td>Parte do complexo multiproteico eIF3 com eIF3b . Diluição 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, origem cabra</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-14211</td><td>Recomendado por (Ref # 13). Diluição 1:200</td></tr><tr><td>eIF4B, coelho de origem</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>Bom marcador de grânulos de tensão em nossas mãos. Diluição 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B, coelho de origem</td><td>Sinalização Celular</td><td>3592</td><td>Recomendado pela Ref # 13. Diluição 1:100</td></tr><tr><td>eIF4G, coelho de origem</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Marcador SG amplamente utilizado. (Ref # 13): pode não funcionar bem em linhagens de células de camundongos. Diluição 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, coelho de origem (MC: monoclonal)</td><td>BD Biosciences</td><td>611126</td><td>Marcador SG amplamente utilizado. Diluição 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1, origem caprino&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1751</td><td>Marcador SG amplamente utilizado. Também pode ser encontrado em corpos P quando SG estão presentes (Ref # 13). Diluição 1:300</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários conjugados com Alexa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A488 anti-cabra, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11055</td><td>Absorvido em cruz. Diluição 1:500</td></tr><tr><td>A568 anti-cabra, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11057</td><td>Absorvido em cruz. Diluição 1:500</td></tr><tr><td>A488 anti-rato, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>A568 anti-rato, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10037</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>A647 anti-rato, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A31571</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>A488 anti-coelho, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>A568 anti-coelho, burro de origem</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td><forte>Outros Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shigella flexneri</td><td></td><td></td><td>Disponível em vários laboratórios mediante solicitação</td></tr><tr><td>Caldo de caseína triptona de soja (TCS)</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td>Meio de crescimento padrão para Shigella, aplicação - crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>TCS BD Biosciences</td><td>236950</td><td>Ágar de crescimento padrão para Shigella, aplicação - crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>Vermelho do Congo</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>27215.01</td><td>Ferramenta de destriminação para Shigell que perderam o plasmídeo de virulência, aplicação - crescimento bacteriano</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>Útil para revestir bactérias para aumentar a infecção, aplicação - infecção</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>Morte seletiva de bactérias extracelulares, mas não citosólicas, aplicação - infecção</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td>Tampão de PH útil quando as células são incubadas em RT, aplicação - cultura de células</td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>31885</td><td>Meio de cultura padrão para células HeLa, aplicação - cultura de células</td></tr><tr><td>Soro de bezerro fetal (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>Suplementação de 5% usada para meio de cultura de células HeLa, aplicação - cultura de células</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>diluição 1:100 usada para meio de cultura de células HeLa, aplicação - cultura de células</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Diluente de reagente, aplicação - cultura de células</td></tr><tr><td>Arsenito</td> <td>de sódioSigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>Potente indutor de grânulos de estresse (Nota: altamente tóxico, manuseio e descarte especiais necessários), aplicação - indutor de estresse</td></tr><tr><td>Clotrimazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>Potente indutor de grânulos de estresse (Nota: perigo para a saúde, manuseio e descarte especiais necessários), aplicação - indutor</td></tr><tr><td>de estresse Paraformaldeído (PFA</td><td>Microscopia Eletrônica Scences</td><td>15714</td><td>4% PFA é usado para fixação padrão de células, aplicação - fixação</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Usado a 0,03% para permeabilização de células hospedeiras antes da coloração imunofluorescente, aplicação - permeabilização</td></tr><tr><td>A647-faloidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22287</td><td>A diluição é de 1:40, melhor adicionada durante a coloração secundária de anticorpos, aplicação - coloração</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Coloração de ácido nucleide usada para visualizar tanto o núcleo do hospedeiro quanto as bactérias, aplicação - coloração</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td><td>Filme de parafina útil para coloração imunofluorescente de lamínulas, aplicação - coloração</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>Meio de montagem robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Meio de montagem barato e robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem</td></tr><tr><td>de placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Placas de cultura de tecidos padrão Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td>, <td>aplicação - cultura de células</td></tr><tr><td>12 mm&nbsp; lamínulas de vidro</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>Suporte de cultura de células para aplicações imunofluorescentes, aplicação - pinça de suporte celular</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>Meio de montagem barato e robusto que funciona bem para a maioria dos fluoróforos, aplicação - montagem</td></tr><tr><td>Programas e Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Análise de dados e programa gráfico com opções robustas de teste estatístico, aplicação - análise de dados</td></tr><tr><td>Leica SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Microsope confocal, aplicação - imagem aquisição</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Professional programa de análise de imagem, aplicação - análise de dados</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Programa de análise de dados e gráficos, aplicação - análise de dados</td></tr></tbody></table>

análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

A imagem fluorescente de componentes celulares é uma ferramenta eficaz para investigar interações hospedeiro-patógeno. Os agentes patogênicos podem afetar muitas características diferentes das células infectadas, incluindo a ultraestrutura orgânica, a organização da rede do citoesqueleto, bem como processos celulares, como a formação de grânulos de estresse (SG). A caracterização de como os patógenos subvertem os processos do hospedeiro é uma parte importante e integral do campo da patogênese. Embora os fenótipos variáveis ​​possam ser facilmente visíveis, a análise precisa das diferenças qualitativas e quantitativas nas estruturas celulares induzidas pelo desafio dos patógenos é essencial para definir diferenças estatisticamente significativas entre amostras experimentais e de controle. A formação de SG é uma resposta de estresse conservada de forma evolutiva que leva a respostas antivirais e tem sido investigada por meio de infecções virais 1 . A formação de SG também afeta as cascatas de sinalização e pode ter outras conseqüências ainda desconhecidas2 . A caracterização desta resposta de estresse a agentes patogênicos que não sejam vírus, como patógenos bacterianos, é atualmente uma área de pesquisa emergente 3 . Por enquanto, a análise quantitativa e qualitativa da formação de SG ainda não é rotineiramente utilizada, mesmo nos sistemas virais. Aqui, descrevemos um método simples para induzir e caracterizar a formação de SG em células não infectadas e em células infectadas com um patógeno bacteriano citosólico, o que afeta a formação de SGs em resposta a vários estresses exógenos. A análise da formação e composição do SG é conseguida utilizando vários marcadores de SG diferentes e o plug-in do detector de pontos da ICY, uma ferramenta de análise de imagens de código aberto.

Para explicar e demonstrar o protocolo descrito neste manuscrito, caracterizamos a imagem de SGs induzidos por clotrimazol em células HeLa infectadas ou não com o patógeno citosólico S. flexneri . Um esboço do procedimento é apresentado na Figura 1 e inclui S. flexneri virulento e avirulento listado em placas de Red Congo, preparação de bactérias, infecção, adição de estresse ambiental, fixação e coloração de amostras, imagem de amostra e q...

Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.

Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

O objetivo geral deste experimento é avaliar os efeitos de uma infecção bacteriana na capacidade das células hospedeiras de formar grânulos de estresse em resposta a estresse exógeno. Este método é uma ferramenta valiosa na área de microbiologia celular para determinar se um determinado patógeno é capaz de alterar ou subverter toda a via de formação de grânulos de estresse. A principal vantagem desta técnica é que os grânulos de estresse podem ser analisados de forma qualitativa e quantitativa de maneira rigorosa e automatizada, utilizando programas gratuitos de análise de imagens.Este método fornece informações sobre a dinâmica da formação e composição de grânulos de estresse e como esses parâmetros são afetados por um patógeno específico. Obrigado. Antes de iniciar o desafio, inocular uma colônia vermelha de bactéria S.flexneri M90T de uma placa recentemente estriada de ágar tripticaseína soja com 1% de ágar vermelho Congo em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo oito mililitros de caldo tripticaseína soja.Após fechar a tampa, incubar a colônia durante a noite com agitação a 222 RPM e 30 graus Celsius. No dia seguinte, fazer uma subcultura de 150 microlitros das bactérias em

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Cayron, J., et al. Análise em várias escalas do crescimento bacteriano sob tratamentos de estresse. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra como preparar e usar uma placa microfluídica para obter imagens de células bacterianas sob condições de estresse. Ele descreve o processo de introdução de uma cultura bacteriana e um meio antibiótico indutor de estresse, seguido de carregamento celular e configuração microscópica. A imagem de lapso de tempo no modo de contraste de fase é então usada...

Análise microscópica do crescimento bacteriano sob estresse usando câmaras microfluídicas

Fonte: Vonaesch, P. et. al., Análise de Imunofluorescência da Formação de Grânulos de Estresse após Desafio Bacteriano em Células de Mamíferos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a infecção das células epiteliais pela bactéria patogênica Shigella flexneri e a resposta celular do hospedeiro resultante. Proteínas efetoras bacterianas interrompem a tradução do hospedeiro, desencadeando a formação de organelos sem membrana chamados grânulos de estresse, que refletem a resposta adaptativa da...

Formação de Grânulos de Estresse durante a infecção por Shigella em células epiteliais cancerígenas

Este vídeo demonstra um ensaio para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos, que consistem em mRNAs, proteínas de ligação a RNA (RBPs) e várias outras proteínas.

Um ensaio de imunofluorescência para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Desenvolvemos uma plataforma microfluidica para testes rápidos de suscetibilidade a antibióticos. O fluido é passado em altas velocidades sobre bactérias imobilizadas na parte inferior de um canal microfluido. Na presença de estresse e antibiótico, cepas suscetíveis de bactérias morrem rapidamente. No entanto, bactérias resistentes podem sobreviver a essas condições estressantes.

Teste de suscetibilidade de antibiótico induzido por estresse em um chip

Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Apresentamos um protocolo para o uso de microscopia STED simultaneamente estruturas da imagem actina, microtúbulos e proteínas microtubule plus-final em células B que se espalharam em lamelas revestidas com anticorpos contra o receptor de células B, um modelo para a fase inicial de formação de sinapse imunológica.

Visualizando a actina e microtúbulos citoesqueleto na célula B sinapse imune usando microscopia de depleção (STED) emissão estimulada

Nós desenvolvemos um ensaio de poliacrilamida-baseado multi bem formato para sondar o efeito da rigidez da matriz extracelular em infecção bacteriana das células aderentes. Este ensaio é compatível com citometria de fluxo, imunocoloração e microscopia de força de tração, permitindo medições quantitativas das interações biomecânicas entre células, matriz extracelular e bactérias patogênicas.

Um ensaio de poliacrilamida-baseado formato multi bem para estudar o efeito da rigidez da matriz extracelular sobre a infecção bacteriana das células aderentes

Apresentamos um fluxo de trabalho livremente disponível construído para rápida exploração e análise precisa de corpos celulares em compartimentos celulares específicos em imagens de microscopia de fluorescência. Este fluxo de trabalho fácil de usar é projetado no software de código aberto Icy e também usa funcionalidades ImageJ. O gasoduto é acessível sem conhecimento em análise de imagens.

Analisador de subestrutura: Um fluxo de trabalho fácil de usar para exploração rápida e análise precisa de corpos celulares em imagens de microscopia de fluorescência

Aprenda a analisar a formação de grânulos de estresse em células de mamífero após desafio bacteriano usando imunofluorescência. Este método automatizado permite investigar respostas celulares em interações hospedeiro-patógeno.

Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

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