Name: Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprenda análise de molécula única de crosslinks intercadeia localizados por laser em DNA genômico. Este método permite imagens diretas de lesões de DNA induzidas por composto ativado por laser, auxiliando no estudo das respostas celulares ao dano genético.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional sobre o Envelhecimento (Z01 AG000746-08) e do Fundo de Investigação Anemia de Fanconi.

1. Preparação de Dig-TMP <ol><li> Misturar 50 mg (0,18 mmoles) de 4&#39;-clorometil-4,5&#39; , 8-trimetilpsoraleno e 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina em uma seco 25 mL redondo -bottom frasco sob azoto. Adiciona-se 10 mL de tolueno e refluxo por 12 h. Remover o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida. <ol><li> Purifica-se o resíduo por cromatografia em coluna intermitente através de gel de sílica. Elui-se a coluna com clorofórmio, metanol e solução de amoníaco a 28% (9: 1: 0,5). Evapora-se o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida, e recuperar o puro 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trimetilpsoraleno como um amarelo pálido viscoso líquido. </li><li> Misture 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trimetilpsoraleno com 5 mg (0,008 mmoles) de éster de NHS em digoxigenina um balão de fundo redondo seco, sob azoto. Adicionar 0,5 mL de dimetil formamida anidra (DMF) umad 3,4 mL de t rime ti lamina e agita-se a 50 ° C durante 18 h. </li><li> Remover o solvente em um evaporador rotativo sob pressão reduzida. </li><li> Dissolve-se o resíduo numa quantidade mínima de diclorometano. Aplicar a solução em 2 pontos uL horizontalmente através da parte inferior de uma placa de camada fina preparativa com gel de sílica como uma fase estacionária. Executar a TLC preparativa em clorofórmio: metanol: hidróxido de amónio a 28% (8: 1: 0,1). </li><li> Mascarar a placa, excepto para as bordas verticais e identificar a banda de produto com o curto comprimento de onda UV a 254 nm da lâmpada. Raspe o produto a partir da placa com uma espátula e isolar o produto puro utilizando clorofórmio: metanol: hidróxido de amónio 28% (8: 1: 0,1) mistura. </li><li> Remover os solventes num evaporador rotativo sob pressão reduzida. Dissolve-se os peletes residuais em 1 mL de 50% de EtOH: H2O, dispensam em 50 aluotas em tubos de 1,5 mL (~ 20 Alíquotas) e seco num evaporador centrífugo até que todo o solvente é evaporado (~ 3 h). </li><li>Redissolve-se cada aliquota de 200 uL de 50% de EtOH: H 2 O e seco de novo em um evaporador centrífugo. Dissolve-se cada aliquota de novo em 200 ul de 50% de EtOH: H2O, seco em um evaporador e armazenar centrífugos peletes a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol></li><li> Para utilização, dissolve-se o sedimento em 50 mL de 50% de EtOH: H2O Prepara-se uma diluição 1: 100 da dissolvido Dig-TMP em H 2 O e medir a OD a 250 nm. O coeficiente de extinção de Dig-TMP é 25.000. A solução é estável durante cerca de um mês quando armazenada a -20 ° C. Verificar a concentração medindo a OD a 250 nm antes de cada utilização. <ol><li> Calcular a concentração de estoque: Abs x 100 x10 6/25000 = concentração (em uM). Tipicamente, a solução de reserva é cerca de 3 mm. É importante estar neste intervalo, a fim de minimizar o volume de EtOH adicionado ao meio. </li></ol></li></ol> 2. Laser localizadas DIG-TMP ICLs <ol><li> PElocalização do laser rform com um microscópio confocal com um laser de azoto SRS (337 nm) bombeada através de uma célula de corante emissor de uma linha de 365 nm e disparando 3 ns pulsos a 10 Hz, com uma potência de 0,7 nW. </li><li> Adicione uma marca vertical no lado de um vidro de 35 milímetros de fundo prato de cultura de células com uma caneta de marcação. Arranhar uma cruz no centro do vidro sobre a superfície de cultura com uma caneta de diamante de tal modo que a tira preta no lado do prato está na parte superior de um braço da cruz. A cruz é marcada sobre a superfície de crescimento do vidro de modo que as células e vai estar no mesmo plano focal. </li><li> Esterilizar a placa após a marcação com uma lavagem de 70% de EtOH. A seco antes de células de galvanização. </li><li> células da placa (estirpes de laboratório padrão, tais como HeLa ou U2OS), em cruz marcada placas de cultura de um ou dois dias antes. Celular deve ser dividindo ativamente e 50-70% confluentes no dia do experimento. Incubar 24 h com 1? M de 5-cloro-2-desoxiuridina (CldU) ao ADN rótulo uniformemente. </li><li> AdicionarDig-TMP em 50% de EtOH: H2O a meio de cultura celular a uma concentração final de 20 uM. Traga o meio para 37 ° C. Mudar o meio sobre as células e colocar na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 30 min para permitir a Dig-TMP-se equilibrar. </li><li> Enquanto as células são incubação, estabelecer x / y coordenadas do campo de visão, em que o laser é activo. Siga o procedimento de calibração do fabricante em que o laser é dirigido pelo software para gravar uma lâmina de vidro espelhado ao longo de uma linha horizontal e diagonal. As duas linhas definem os limites do campo em que o laser pode atingir um alvo. </li><li> Colocar a placa na câmara ambiental, a 37 ° C com CO 2 e controlado de humidade, sobre a platina do microscópio e concentrar-se com o objectivo de óleo 60X na intersecção da cruz. </li><li> Dirigir o feixe de laser de 365 nm a uma ROI, estabelecido pelo investigador com a ferramenta de forma no software, para formar uma faixa de 3 &amp;# 181; mx 0,6 m. O contorno da ROI é colocado pelo cursor em núcleos de células localizadas na proximidade imediata da intersecção da cruz. Ajustar o plano focal z para alvejar a meio caminho do laser através do núcleo. Use um laser na faixa de 350-370 nm. 405 nm lasers não pode induzir ligações cruzadas 19. NOTA: Nós localizar a ROI em áreas fora da nucleoplasmic nucléolos, que pode ser distinguido do nucleoplasma em contraste de interferência diferencial de imagem (DIC). </li><li> Verificar o foco ea atividade do laser, aumentando a potência para um nível suficiente para eliminar uma célula (a célula vai escurecer e depois desaparecem). Esta é uma importante de diagnóstico para um percurso de luz desimpedida para o laser através do microscópio e em seguida, através da lamela e para dentro das células. <ol><li> Reduza a potência para apenas o suficiente para ativar o psoraleno eo DDR induzida ICL (este deve ser determinado empiricamente para cada laser / microscope combinação). Use uma configuração intensidade do laser (1,7% aqui) que não ativar o DDR na ausência de psoraleno (monitorado pela formação de γ-H2AX). NOTA: Esta é uma determinação importante e as configurações podem necessitar de ajuste, se a fonte de laser ou um componente no caminho da luz é alterada. Seguir a acumulação de GFP proteínas marcadas de reparação, tais como XPC ou FAN1, ambos os quais são rapidamente recrutados (em segundos) para as tiras de psoraleno de laser, mas não ao ROI exposto a isoladamente o laser. Algumas proteínas da DDR aparecer dentro de segundos, enquanto vários minutos podem ser necessários para os outros. É necessário realizar determinações curso de tempo para cada proteína de interesse. Observamos também que em células que não foram expostas ao laser não há faixas de proteínas que respondem. </li></ol></li><li> Depois de todas as células em um campo ter sido alvo mover a placa para um novo campo, permanecendo perto da intersecção da cruz. </li><li> Em experimentos concebidos para determine a distribuição de distâncias inter-lesão expor as células ao laser em 20-25 campos 4-5 (células / campo) em torno da intersecção. A fim de analisar os padrões de replicação na vizinhança dos ICLs localizadas incubar as células com 10? M de 5-iodo-2-desoxiuridina (IdU), após o disparo do laser. NOTA: O tempo de incubação com IdU é um tanto arbitrária. Nós temos utilizado tão curto quanto 20 min e desde que 60 minutos (ver abaixo). pulsos mais longos (algumas horas) muitas vezes resultam em várias extensões de replicação coalescentes, perdendo assim a oportunidade de imagem o progresso de garfos individuais. Em algumas experiências ces são rotulados com CldU durante 24 h para maneira uniforme ADN etiqueta antes da exposição a Dig-TMP seguido por marcação por pulsos de tractos de replicação. </li></ol> 3. Colheita de Células e Alongamento de Fibras de DNA <ol><li> Remova a placa do palco, remover o meio, e lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remover a solução de PBS. Colocar uma gota de 10 ul de uma tripsina comercial/ Solução de EDTA na intersecção da cruz no meio da superfície de vidro. </li><li> Incuba-se durante 3-4 minutos à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, extrair a solução de tripsina com as células destacadas para a ponta da pipeta. Não há necessidade de neutralizar a tripsina. </li><li> Coloque a gota de tripsina / EDTA com as células a uma extremidade de uma lâmina de microscópio de vidro silanizado. Lisar as células e libertar o ADN por adição de 10 uL de solução de SDS a 0,5% e incuba-se durante 3-4 minutos à temperatura ambiente misturando suavemente com a ponta da pipeta, permitindo que a periferia da piscina para secar. </li><li> Inclinar a corrediça 20º e permitir que o líquido escorra para a extremidade. As fibras de ADN são estendidos / esticadas pelas forças hidrodinâmicas do líquido que se escoa. Deixe a seco lâminas de ar (~ 10 min) e fixar em 3: 1 metanol / ácido acético durante 10 min. Remova os slides da solução de correção e ar seco novamente. Neste ponto, eles podem ser armazenados indefinidamente em EtOH a 70% a -20 ° C. Na remoção do EtOH 70% deixar secar ao ar antes de a nepasso xt. </li><li> Lavagem das lâminas em PBS, e em seguida, desnaturar em HCl 2,5 M durante 1 h à TA. Este tratamento depurinates ADN tornando as nucleobases halogenados incorporadas facilmente acessíveis aos anticorpos. </li><li> Neutraliza-se as lâminas em Tris-HCl a 0,4, pH 7,4. Lavar duas vezes em PBS / 0,5% de Tween-20 (PBST), durante 5 minutos cada. </li><li> Bloco de lâminas com albumina 5% de soro de bovino (BSA) e soro de cabra a 10% em PBS. Cobrir as lâminas cuidadosamente com um parafilme para espalhar uniformemente a solução de bloqueamento sobre a lâmina e incubar durante 1 h à TA. </li><li> Pipeta de 100 uL de diluição 1: 200 em solução de rato anti-bromodesoxiuridina bloqueio (especificamente detecta CldU) anticorpo primário para cada lâmina. Cobrir as lâminas cuidadosamente com um parafilme para espalhar a diluição de forma uniforme sobre a lâmina e incubar numa câmara húmida durante 1 h à TA. Remover o parafilme e lavar as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada. </li><li> Pipetar 100 L de diluído (1: 100) de cabra anti-rato Alexa Fluor 647 em solução de cada lâmina de bloqueio. Cubra odesliza suavemente com um parafilme e incubar durante 45 min à TA. Lavam-se as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada. </li><li> Pipetar 100 L de diluída (1:40) de ratinho anti-bromodesoxiuridina (detecta LDU e CldU Esta especificidade dual requer o bloqueio de CldU pelo rato anti BrdU na incubação prévia.) Anticorpo primário e anticorpo de coelho anti-DIG (1: 200 ) em solução a cada lâmina de bloqueio. Cobrir as lâminas cuidadosamente com um parafilme e incubar numa câmara húmida durante 1 h à TA. Lavam-se as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada. </li><li> Pipetar 100 L de diluído (1: 100) de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 ANDC (1: 5000) sonda anti-coelho de cabra (por exemplo, Qdot 655) em solução de bloqueio a cada lâmina. Cobrir as lâminas cuidadosamente com parafilm e incuba-se durante 45 min à TA. Lavam-se as lâminas três vezes em PBST, durante 5 min cada. </li><li> Drenar o excesso de PBST para uma toalha de papel. Adicionar 50 uL de antifade meio de montagem para cada lâmina e cobertura com uma lamela. Imagem ou loja paranão mais do que 48 h a -20 ° C. </li></ol> 4. imagem Fibra por microscopia de fluorescência <ol><li> Realizar a aquisição de imagens por meio de uma objectiva 63X de um microscópio invertido com uma roda de filtros totalmente motorizado ligado com FITC, Cy5 e Q do ponto 655 de detecção. O filtro de excitação é de 425 nm, e o filtro de emissão é de 655 nm com 20 nm centrada no pico de emissão 20. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A tecnologia de localização de laser requer o uso de células aderentes com núcleos que são visíveis em microscopia de campo claro. Tentámos para fixar as células não aderentes, tais como linfócitos primários, ou células cultivadas fracamente aderentes, tais como AD293, para a superfície de vidro com as preparações adesivas de células, tais como polilisina ou colagénio, ou misturas mais complexas. Embora esses tratamentos podem ligar-se as células à superfície, nós achamos que eles geralmente ficam arredondadas que torna...

ADN está sob constante ataque de agentes exógenos, tais como a radiação, luz ultravioleta, toxinas ambientais, produtos de combustão, etc. Além disso, também é atacado por espécies de radicais endógenos produzidos pelo metabolismo oxidativo. Todos estes têm o potencial de perturbar química ou fisicamente a integridade do DNA 1. Perturbações no genoma pode ativar a resposta DNA danos (DDR), um recrutamento e modificação cascata pós translacional com centenas, se não milhares, de proteínas e microRNAs envolvidos na reparação da lesão, regulação do ciclo celular, apoptose, senescência e vias inflamatórias 2. A maioria do nosso informações sobre o DDR vem de estudos com LAP. Isto é em grande parte devido à disponibilidade de tecnologias para a introdução de intervalos, incluindo a sequência de intervalos específicos, em ADN genómico em células vivas 3. Além disso, o propensity de quebras para induzir focos de proteínas DDR, que podem ser visualizados por imunofluorescência, tem sido muito útil para identificar a cinética e requisitos de proteínas que respondem. Uma das principais tecnologias para estudar a DDR foi introduzido por Bonner e seus colegas, que usou um feixe de laser para dirigir uma faixa de LAP em uma &quot;região de interesse&quot; (ROI) nos núcleos de células vivas 4. Com efeito, eles criaram um foco longa em que as proteínas do DDR puderam ser identificados por imunofluorescência. Isto foi ilustrado por sua demonstração de uma forte banda de histona H2AX fosforilada (γ-H2AX) nas células de laser exposta. Desde então, a abordagem de laser tem sido utilizada em vários estudos do DDR induzidas por LAP. Embora poderoso e popular, e da origem das imagens de imunofluorescência dramáticas, deve-se notar que na maioria dos experimentos a intensidade do laser é ajustada de modo a produzir resultados observáveis, sem preocupação com a identidade da lesão,densidade, ou espaçamento. Na verdade, pode ser difícil fazer estas estimativas. Assim, eles são largamente ignorado, apesar da multiplicidade de lesões introduzidas no ADN por lasers 5. Isso contribui para as muitas contradições na literatura 6. Em contraste com o LAP, a maioria das modificações químicas de DNA não estimulam a formação de focos discretos de proteínas DDR. Isto é importante à luz de nossa compreensão atual das frequências de lesão. Estimou-se que as células humanas em cultura incorrer em tantos como 50 LAP por ciclo celular, em grande parte formadas durante a fase S 7, 8, 9. Menos são formadas em células não proliferantes. Isto contrasta com o número de perdas de bases nucleoticas ou eventos de modificação, que são na casa das dezenas de milhares por célula / dia 1, 10. Assim, sabemos mais sobreDDR induzida por eventos que são relativamente raros, e muito menos sobre as induzidas por lesões hélice de distorção, que no seu conjunto são muito mais comuns. A fim de abordar questões sobre a resposta celular ao covalentes modificações do DNA genômico, queríamos trabalhar com uma hélice distorcendo aduto de DNA que tinham actividade de indução DDR inerente. Além disso, para facilitar a concepção experimental e interpretação estávamos interessados ​​em uma estrutura cuja introdução pode ser controlada em relação ao tempo e era passível de visualização. Nesse sentido, desenvolvemos uma estratégia baseada em psoraleno. Os psoralenos são bem caracterizado intercaladores de ADN fotoactivos que favorecem 5&#39; TA: AT locais. Ao contrário de outros agentes de reticulação, tais como mostardas de azoto e a mitomicina C (MMC) eles não são de DNA reactivo a menos expostos ao longo de onda de UV (UVA) luz. As moléculas intercalares reagir com bases de timina em cadeias opostas para produzir hélice distorcer reticulações intercadeias (ICLs) 11. Com o psoraleno trimetil usadas nas nossas experiências maior parte dos produtos são relativamente poucas, ICLs monoaductos são gerados (menos do que 10%) de 12, e ligações cruzadas entre as bases intracadeia adjacentes numa cadeia não são formados. Porque eles são blocos poderosos para a replicação e transcrição, psoraleno e outros agentes de reticulação, como cis-platina e MMC, são comumente utilizados na quimioterapia. Assim activado psoraleno estudos que se seguiram à activação da RDA por uma estrutura de distorção hélice, e também uma percepção sobre a resposta celular a um composto com importância clínica. Nós sintetizado um reagente em que psoraleno trimetil foi ligada à digoxigenina (Dig), um esterol vegetal não encontrado em células de mamíferos e frequentemente utilizado como um immunotag. O requisito para fotoactivação permite a localização por luz laser (365 nm) de ICLs psoraleno em ROI definida em núcleos em células vivas. Estes podem ser exibidos por immunofluorescence contra a tag Dig. Reparação do ADN e proteínas de DDR apareceu nas listras do laser de localizadas ICLs 13, 14. A DDR activado pelas intensidades elevadas laser usado para produzir LAP pode ser devido a danos isolado ou agrupado 15, 16. Por consequência, a relevância dos resultados destas experiências a lesões que ocorrem naturalmente, presentes em concentração muito mais baixa, é incerto. Para abordar questões semelhantes sobre a frequência aduto psoraleno e espaçamento no DNA, aproveitamos a tecnologia de fibra DNA 17 e pontos immunoquantum. Pontos quânticos são muito mais brilhantes do que corantes fluorescentes e não são branqueados pela exposição à luz. Assim, eles são frequentemente utilizadas para uma única molécula de imagem 18, um pedido para que os corantes fluorescentes não são suficientemente brilhante. ADN fibras individuais pode ser esticada em glass lâminas e pode ser apresentado por imunofluorescência contra análogos de nucleósido incorporadas durante incubações anteriores para a célula de colheita. Nós células tratadas com Dig-psoraleno e exposto a irradiação para ROI micro laser. As fibras foram preparados a partir das células e aductos de DIG-psoraleno individuais poderia ser visualizado com os pontos immunoquantum. A exposição das células a análogos de nucleósidos para períodos de tempo relativamente curto (20-60 minutos) permite a visualização de tractos de replicação na vizinhança dos ICLs a laser localizada.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenina NHS éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Cloro-psoraleno</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanodiamina</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Solução de amônio</td><td>Placas Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de vidro Flass 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de disco giratório Nikon T2000_E2, equipado com estágio automatizado e câmara de controle ambiental e suporte de placa</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>com software Volocity</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>com laser pulsado de nitrogênio</td></tr><tr><td>célula de corante</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 corante</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td>Placas de vidro botomm <td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 1.5 lamínula, diâmetro de vidro de 10 mm, lâminas</td> de microscópio <td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td>não revestidas</tr><tr><td></td><td>Novo Fornecedor</td> Parte <td># 5070</td><td>Novas Lâminas Silane</td></tr><tr><td>Anticorpo anti BrdU de rato (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 em 40</td></tr><tr><td>Anticorpo anti BrdU de rato (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 em 200& nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-escavação de coelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 em 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 cabra anti IgG de coelho</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 em 5.000</td></tr><tr><td>AF647- cabra anti rato IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 em 100</td></tr><tr><td>AF488-cabra anti camundongo IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 em 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescente microscópio A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; com software Axiovision</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filtro</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

Único análise molécula do laser localizadas psoralênica adutos

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

A resposta de ADN de danos (DDR) foi extensivamente caracterizado em estudos de quebras na cadeia dupla (DSB) induzidas por irradiação com feixe de laser de micro em células vivas. A DDR de hélice distorcer modificações covalentes de ADN, incluindo ADN reticulações intercadeias (ICLs), não é bem definido. Estudamos o DDR estimulada por ICLs, localizada por fotoativação de laser de psoralenos immunotagged, nos núcleos de células vivas. A fim de abordar questões fundamentais sobre a distribuição aduto e encontros forquilha de replicação, combinamos localização laser com duas outras tecnologias. fibras de ADN são muitas vezes usadas para exibir o progresso de garfos de replicação por imunofluorescência de análogos de nucleósido incorporadas na pulsos curtos. pontos Immunoquantum têm sido amplamente empregados para uma única imagem molécula. Na nova abordagem, fibras de ADN a partir de células portadoras de laser localizada ICLs são espalhados sobre lâminas de microscópio. Os ICLs marcados são exibidos com pontos immunoquantum e the as distâncias inter-lesão determinada. colisões replicação garfo com ICLs podem ser visualizados e diferentes padrões de encontro identificados e quantificados.

ICLs laser localizadas Dig-TMP (Figura 1A) pode ser exibido através de imunofluorescência contra o Dig-tag ligada ao psoraleno. Embora o laser pode ser dirigido para atacar em qualquer uma área de contorno, listras não são formas &quot;naturais&quot; em células, e os sinais legítimos pode ser facilmente distinguido de artifícios devidos a ligação não específica por anticorpos primários ou secundários. Este recurso é útil quando se utiliza anticorpos inferiores a especifi...

Os lasers são frequentemente utilizados em estudos sobre a resposta celular a danos no ADN. No entanto, eles gerar lesões cujo espaçamento, de frequência, e colisões com garfos de replicação são raramente caracterizado. Aqui, descrevemos uma abordagem que permite a determinação destes parâmetros com a laser localizada ligações cruzadas intercadeias.

Único Análise Molécula do laser localizadas psoralênica adutos

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma análise de molécula única da distribuição de ligações cruzadas intercadeias localizadas por laser no DNA genômico, a fim de estudar as respostas celulares a ligações cruzadas intercadeias no DNA. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de reparo do DNA, relativas à distribuição de lesões no DNA introduzidas pela tecnologia a laser, uma ferramenta experimental amplamente utilizada. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a visualização direta de lesões no DNA introduzidas pelo composto ativado por laser no DNA genômico.Isso não foi possível anteriormente. A demonstração do procedimento será realizada por Julia Gichimu e Hima Gali do nosso laboratório. Toda vez que o laser de direcionamento for utilizado, é importante realizar uma calibração com a lâmina espelho para verificar se o laser está atingindo as coordenadas XYZ apropriadas e para definir a área do campo capturada pela câmera onde o laser pode ser configurado para atingir.Encontre um campo na lâmina que tenha sido previamente gravado. Ajuste o tempo de exposição e a potência do laser. Em seguida, regule o foco para mover-se até um campo próximo não direcionado na lâmina espelho.Inicie o procedimento de calibração. O software disparará o laser para gravar o lâmina espelhada ao longo de uma linha horizontal e diagonal. Essas linhas definem os limites do campo no qual o laser pode atingir uma célula-alvo.Defina várias regiões de interesse, ou ROI, dentro do campo e dispare o laser para confirmar que ele está direcionado às áreas selecionadas e, portanto, atingindo as coordenadas XYZ apropriadas. Uma calibração biológica também deve ser realizada ao configurar o sistema de laser de direcionamento do microscópio. O primeiro passo é definir a potência mínima de laser necessária para fotoativar a trimetilpsoraleno, ou TMP, induzir ligações cruzadas entre filamentos e provocar o recrutamento de um fator de reparo marcado com GFP, cuja cinética pode ter sido previamente caracterizada.Neste laboratório, utiliza-se uma linhagem celular U2OS estavelmente transfectada com um plasmídeo que expressa GFP fan one. Como mostrado aqui, quando as células são expostas a seis micromolares de TMP e 1,2% de laser por 10 minutos, a visualização da sequência de imagens como um vídeo confirma o recrutamento de GFP fan one para a região de interesse (ROI) alvo. O segundo passo é verificar se essa configuração de potência não desencadeia o recrutamento na ausência do composto.Como mostrado aqui, quando as células são expostas ao laser de 1,2% por 10 minutos e a imagem é visualizada como um vídeo, não há recrutamento de GFP fan um para a região de interesse (ROI) direcionada. Em terceiro lugar, é importante definir o ajuste mínimo de potência capaz de destruir uma célula. A capacidade de destruir uma célula com esse ajuste de potência deve ser testada como uma calibração biológica de rotina todos os dias em que o laser direcionador for utilizado.Defina a ROI dentro do núcleo, evitando os nucléolos. Ajuste o foco. Defina a potência do laser para 12% e dispare.Por fim, é essencial ajustar o plano focal no centro da célula para obter um direcionamento correto. Para demonstrar isso, três células são direcionadas em três planos focais diferentes. Centro da célula.Alto demais. E baixo demais. Três minutos após o direcionamento, um conjunto de imagens abrangendo três mícrons é gerado para examinar a distribuição do leque de GFP em uma faixa ao longo do plano focal imageado.Apenas a célula direcionada ao centro da célula mostra um leque de GFP com uma faixa em todos os planos Z. Antes de realizar a localização a laser, prepare uma placa de cultura celular de 35 milímetros com fundo de vidro para o crescimento de células. Com uma caneta marcadora, faça uma marca vertical na lateral de cada placa.Use uma caneta de diamante para riscar uma cruz no centro do vidro na superfície de cultura, de modo que a faixa preta na lateral do recipiente fique na extremidade superior de um dos braços da cruz. A cruz é marcada na superfície de crescimento do vidro para que ela e as células fiquem no mesmo plano focal. Plaque as células em recipientes de cultura com a cruz esterilizada e incube por 24 horas em um micromolar de cinco cloro desoxiuridina para marcar uniformemente o DNA.No dia do experimento, adicione TMP ligado à digoxigenina ou dig TMP em etanol 50% ao meio de cultura celular para obter uma concentração final de 20 micromolar. Aqueça o meio a 37 graus Celsius. Substitua o meio nos recipientes de cultura por meio contendo dig TMP e incube a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ por 30 minutos para permitir que o dig TMP atinja o equilíbrio.Enquanto as células estão em incubação, realize a calibração do espelho deslizante e 12% de expulsão de uma célula conforme demonstrado anteriormente. Coloque a placa na câmara ambiental a 37 graus Celsius com CO2 e umidade controlados sobre a platina do microscópio. Foque com o objetivo de imersão em óleo de 60X sobre a interseção da cruz.Selecione o primeiro campo para direcionar e use a ferramenta de forma para definir as áreas de interesse (ROIs) em células individuais localizadas na proximidade imediata da interseção da cruz. Selecione áreas do nucleoplasma fora dos nucléolos. Ajuste o plano focal Z para direcionar o laser na metade do caminho através dos núcleos.A seguir, ajuste a potência para o mínimo necessário para ativar a psoralena na resposta ao dano do DNA induzido por ligações cruzadas intercadeias. Utiliza-se aqui 1,2%. Dispare o laser.Após todas as células em um campo terem sido direcionadas, mova a placa para um novo campo, permanecendo próximo à interseção da cruz. Repita o procedimento recém-demonstrado em 12 a 18 campos para direcionar um total de 80 a 100 células. Para colher as células, remova a placa de cultura da platina.Remova o meio e lave as células com solução de PBS. Remova o PBS e coloque uma gota de 10 microlitros de uma solução comercial de tripsina EDTA sobre a interseção da cruz no centro da superfície de vidro. Incube por três a quatro minutos à temperatura ambiente e, em seguida, aspire a solução de tripsina com as células destacadas para dentro da ponteira de uma pipeta.Coloque a gota de tripsina EDTA com as células em uma extremidade da lâmina de microscópio de vidro silanizada. Para lisar as células e liberar o DNA, adicione 10 microlitros de solução de SDS a 5% e incube por três a quatro minutos à temperatura ambiente, misturando suavemente com a ponta da pipeta, permitindo que a periferia da gota seque. Incline a lâmina em 20 graus e permita que o líquido escorra até a extremidade.As forças hidrodinâmicas do líquido em fluxo irão estender e alongar as fibras de DNA. Deixe a lâmina secar ao ar por 10 minutos. Mergulhe a lâmina em uma solução de três para um de metanol para ácido acético e fixe por 10 minutos.Em seguida, remova a lâmina da solução fixadora e seque ao ar novamente. Neste ponto, a lâmina pode ser armazenada indefinidamente em etanol 70% a 20 graus Celsius. Para processar a lâmina para a detecção de sinais de dig em fibras de DNA por microscopia de fluorescência, remova a lâmina com o DNA esticado da solução de etanol 70% e deixe secar ao ar.Posteriormente, desnature os filamentos de DNA em ácido clorídrico e, em seguida, transfira-os para um recipiente contendo tris hidroclorídrico em pH 8 para neutralização. A seguir, lave as amostras em PBS. E, finalmente, cora-as com os anticorpos apropriados seguindo um procedimento previamente publicado.A estrutura do trimetilpsoraleno com uma marcação de dioxigenina é mostrada. As ligações cruzadas intercadeias de DNA, ou ICLs, podem ser exibidas por imunofluorescência contra dig TMP. Este exemplo mostra células com acúmulo de um marcador bem conhecido da resposta ao dano no DNA, a gama H2AX, visualizada em verde, em regiões de interesse (ROIs) contendo ICLs localizadas por laser, visualizadas em vermelho.O núcleo corado com DAPI está em azul. O campo claro mostra uma célula parcialmente sobre a marca feita pela caneta de diamante. Observe que as ROI estão posicionadas fora dos nucléolos.Para determinar a frequência e o espaçamento dos adutos, as células foram incubadas em cinco clorodesoxiuridina por 24 horas antes da introdução das ICLs. Após a coleta das células e a extensão das fibras de DNA, os sinais dig foram detectados com um ponto quântico amino, visualizado em vermelho na cinco clorodesoxiuridina, por meio de fluorescência amino visualizada em verde. A análise dos sinais dig nas fibras revela que as distâncias inter-ICL variam de menos de 10 KB a mais de 160 KB. Não houve evidência de adutos agrupados.Seguindo estas diretrizes, deve ser possível estender esta abordagem a outros adutos de DNA, como lesões oxidativas que podem ser localizadas por lasers de comprimento de onda apropriado.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo demonstra imagens de ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula. Usando uma configuração microfluídica e um chip de nanoestrutura plasmônica ligado a peptídeos, as mudanças na intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância revelam interações com proteínas secretadas de uma única célula.

Ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula

Relatamos uma alteração no processo de HF tratado in situ de Si (001) para um estado de superfície hidrófilo ou hidrófobo por irradiação de amostras em câmaras de microfluidos cheios com H 2 O 2 / H 2 O solução (0,01% -0,5%) ou soluções de metanol usando laser UV pulsado de baixa fluência de pulso relativa.

Seletiva Área Modificação de Superfície Wettability Silicon por Pulsed Laser irradiação UV em meio líquido

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Estudar a cinética de reparação de danos de DNA requer um sistema para induzir lesões em regiões definidas do sub nucleares. Nós descrevemos um método para criar quebras de dupla-hélice localizadas usando um microscópio confocal de varredura a laser equipado com laser 405 nm e fornecer procedimentos automatizados para quantificar a dinâmica dos fatores de reparação para essas lesões.

Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Nós descrevemos aqui métodos para a quantificação sensível e exata das lesões 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosine (1,n6-dAdo) e 1,n2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-DGUO) no ADN. Os métodos foram aplicados na avaliação dos efeitos da matéria particulada fina ambiente (PM2,5) nos tecidos (pulmão, fígado e rim) de camundongos a/J expostos.

Quantificação de três lesões de DNA por espectrometria de massas e avaliação de seus níveis em tecidos de camundongos expostos a material particulado fino ambiente

Este protocolo apresenta um método para usar a dosimetria radical inline e uma fonte de luz plasmática para realizar a pegada de proteína de oxidação flash. Este método substitui o perigoso laser UV para simplificar e melhorar a reprodutibilidade da oxidação fotoquímica rápida de estudos proteicos.

Pegada de proteína radical de hidroxíl sem laser para realizar análises estruturais de proteínas de ordem superior

Este protocolo descreve um método não invasivo para identificar eficientemente células da fase S para estudos de microscopia a jusante, como medir o recrutamento de proteínas de reparação de DNA por micro-irradiação a laser.

Micro-irradiação a laser para estudar recrutamento de DNA durante a fase S

Um protocolo robusto é apresentado aqui para isolar grânulos de neuromelanina de tecido humano post-mortem substantia nigra pars compacta via microdissecção a laser. Este protocolo revisado e otimizado minimiza massivamente o tempo necessário para a coleta de amostras, reduz a quantidade de amostra necessária e melhora a identificação e quantificação de proteínas pela análise LC-MS/MS.

Protocolo Baseado em Microdissecção a Laser para a Análise LC-MS/MS do Perfil Proteômico de Grânulos de Neuromelanina

Aprenda análise de molécula única de crosslinks intercadeia localizados por laser em DNA genômico. Este método permite imagens diretas de lesões de DNA induzidas por composto ativado por laser, auxiliando no estudo das respostas celulares ao dano genético.

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