RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

O objetivo geral deste procedimento é transfectar de forma eficiente linfócitos T humanos primários com reagentes de RNA de pequeno porte utilizando eletroporação de próxima geração. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia dos linfócitos T, como a forma como produtos gênicos específicos regulam a diferenciação e a função imunológica dos linfócitos T. A principal vantagem desta técnica é que ela representa um método altamente eficiente e confiável para transfectar linfócitos T humanos primários com sRNAs e outros reagentes sintéticos de RNA de pequeno porte.

Este método pode fornecer informações sobre a biologia de células Th17 humanas, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros linfócitos de humanos ou camundongos. No dia zero, revestir placas de cultura de tecidos de seis poços com 1,5 mililitro por poço de anti-CD3 humano e anti-CD28 humano em PBS com cálcio e magnésio por pelo menos duas horas a 37 graus Celsius. Após o isolamento e a lavagem das células mononucleares do sangue do cordão umbilical, ou CBMCs, realizar o isolamento de linfócitos T CD4 positivos por seleção negativa utilizando um kit comercial de linfócitos T CD4 positivos humanos.

Adicione o tampão de isolamento e re-suspenda as células mononucleares. Transfira as células para um novo tubo de cinco mililitros, então adicione 100 microlitros de soro bovino fetal, ou FBS, e 100 microlitros da mistura de anticorpos por tubo, e incube cada tubo a quatro graus Celsius por 20 minutos em um agitador orbital para misturar bem. Após a incubação, adicione três a quatro mililitros de tampão de isolamento para lavar as células.

Centrifugue as células a 300 vezes g durante oito minutos a quatro graus Celsius para obter o pellet celular. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Transfira as microesferas magnéticas para um novo tubo e adicione um volume igual de tampão de isolamento para lavar as microesferas.

Use uma micropipeta de um mililitro para misturar bem as esferas e, em seguida, coloque o tubo no ímã por pelo menos um minuto. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as esferas magnéticas no mesmo volume transferido inicialmente antes da lavagem. Adicione 500 microlitros do tampão de isolamento a cada tubo e re-suspenda as células, depois adicione 500 microlitros de esferas magnéticas pré-lavadas.

Incube as células com as microesferas magnéticas por 15 minutos em agitador orbital à temperatura ambiente para misturar bem. Após a incubação, utilizando uma micropipeta de um mililitro, pipete as células completamente pelo menos 10 vezes, depois adicione três a quatro mililitros de tampão de isolamento e coloque cada tubo no ímã por dois minutos. Transfira cuidadosamente as células T CD4 positivas selecionadas negativamente que estão no sobrenadante para um novo tubo.

Após a conclusão do isolamento de células T CD4 positivas, mantenha as células em gelo e conte as células utilizando um hemocitômetro. Lave as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS, em seguida adicione 1,5 mililitro da mistura 2X de meio polarizante para Th17 em cada poço. Em seguida, centrifugue as células T CD4 positivas humanas para obter o pellet celular.

Aspire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o, depois re-suspenda as células em meio básico sem soro e plaque as células de modo que o volume final seja três mililitros por poço e as citocinas polarizantes estejam agora em concentração final de 1 X; em seguida, coloque as placas em incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por dois dias. No segundo dia, recubra placas de cultura de tecidos de 48 poços com 250 microlitros por poço de anti-CD3 humano e anti-CD28 humano em PBS com cálcio e magnésio por pelo menos duas horas a 37 graus Celsius. Para preparar os pequenos RNAs para transfeção, alíquota um microlitro de uma solução estoque de cinco micromolar de siRNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada transfeção.

Mantenha todos os tubos no gelo. Em seguida, lave as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS e, depois, adicione 500 microlitros de meio polarizante Th17 1X a cada poço. Depois que as placas de cultura e os reagentes de transfeção forem preparados, re-suspenda as células com uma micropipeta de um mililitro, pipetando suavemente, mas garantindo que todas as células sejam destacadas do fundo dos poços.

Reúna as células em um tubo cônico e centrifugue os tubos a 500 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, re-suspenda as células em pelo menos um mililitro de PBS para lavagem. Conte as células Th17 viáveis com um hemocitômetro, utilizando a exclusão com azul de tripano para avaliar a viabilidade, e depois pelote as células em um tubo de microcentrífuga.

Aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as células utilizando o tampão de re-suspensão fornecido no kit. Mantenha as células à temperatura ambiente. Adicione nove microlitros de células a um microlitro de RNA de pequeno porte em cada tubo de microcentrífuga.

Pipete uma vez para misturar as células e os RNAs pequenos para transfeção, em seguida, carregue as células na ponta do eletrodo de pipeta fornecida. Para garantir uma transfeção ideal, evite introduzir bolhas de ar na ponta do eletrodo de pipeta antes da transfeção. Adicionamos 9,5 microlitros de suspensão celular para assegurar que haja quantidade suficiente de mistura e evitar a formação de bolhas na pipeta de eletroporação.

Encha a cubeta fornecida com três mililitros de tampão eletrolítico à temperatura ambiente. Coloque a cubeta dentro da estação de pipeta neon e, em seguida, posicione a pipeta dentro da cubeta. Eletropore imediatamente cada mistura de 10 microlitros de células e RNA de pequeno porte.

Após a eletroporação ser concluída, adicione diretamente a mistura celular a 500 microlitros de meio polarizante Th17 1X em poços preparados de uma placa de cultura. Por fim, coloque as placas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por mais dois dias. Trabalhe com cuidado, mas rapidamente, para evitar a morte celular.

Se houver muitas amostras para eletroporação, as células podem ser coletadas e transfectadas em lotes. Este gráfico de contorno mostra que linfócitos T cultivados em condições de polarização Th17 expressaram o receptor de quimiocina CCR6 e o fator de transcrição ROR gamma T, os quais não foram expressos quando os linfócitos T foram cultivados em condições não polarizantes. Linfócitos T cultivados em condições de polarização Th17 também produziram IL-17A após reestimulação, mas não nas condições ThN.

A diferenciação de Th17 ainda ocorre após a transfeção com pequenos RNAs, mas em alguns experimentos, observa-se uma redução na frequência de produção de IL-17A. Isso demonstra a importância de utilizar um controle de pequeno RNA com química equivalente para comparação dentro de cada experimento. A viabilidade é mantida após a transfeção com pequenos RNAs e geralmente é superior a 70%. A transfeção de células Th17 humanas no segundo dia com um pool de siRNA direcionado ao gene PTPRC, que codifica o CD45, reduziu fortemente a expressão de CD45 em comparação com um siRNA controle com química equivalente.

O deslocamento populacional unimodal na expressão de CD45, observado aqui, indica uma eficiência de transfeção próxima a 100%. A redução da expressão de ROR gamma T por RNAi teve um efeito funcional, já que essas células exibiram produção reduzida de IL-17A em comparação com células transfectadas com um siRNA controle. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar células Th17 humanas polarizadas in vitro com pequenos RNAs utilizando eletroporação de nova geração.