Name: RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a transfectar células Th17 humanas primárias com pequenos RNAs usando eletroporação de próxima geração. Este método eficiente permite estudar a diferenciação e função imunológica de linfócitos T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), um prêmio acadêmico da Sociedade de Leucemia e Linfoma (KMA) e o Programa de Treinamento de Cientistas Médicos do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) (Grant #T32GM007618) (MM).

Este protocolo segue as diretrizes da UCSF de Ética em Pesquisa humanos. 1. Preparação de Culturas de Células T, Isolamento de células T CD4 +, e Th17 Polarização <ol><li> No Dia 0, revestimento 6-se placas de cultura de tecido com 1,5 mL por po de anticorpo anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C. <ol><li> Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme. </li></ol></li><li> Preparar as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMCs) por centrifugação em gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante. CUIDADO: Trabalhar com cuidado e garantir equipamentos de proteção individual (EPI) é usado quando manusear sangue humano para evitar qualquer risco de exposição a patógenos sanguíneos. </li><li> Uma vez que as células mononucleares foram isoladas e lavadas, efectuar o isolamento de células CD4 + T humanas por sele negativocção, utilizando um kit comercial de células CD4 + T humana. NOTA: Se há contaminação de glóbulos vermelhos após o isolamento de células mononucleares, uma lise de células de sangue vermelho opcional pode ser realizado antes das etapas de isolamento de células T CD4 +. Ressuspender as células mononucleares em 1 ml de tampão de isolamento (2% de FBS em PBS). Adicionar 5 ml de solução de lise 1x. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionam-se 5 mL de tampão de isolamento e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células. <ol><li> Ressuspender as células mononucleares a uma densidade de 50 x 10 6 por 500 uL no tampão de isolamento em um novo tubo de 5 ml. </li><li> Adicionar 100 uL de SBF e 100 mL da mistura do Anticorpo por tubo, em seguida, incuba cada tubo a 4 ° C durante 20 min num agitador orbital, para misturar bem. </li><li> Após a incubação, adicionar 3-4 mL de tampão de isolamento para lavar as células. Centrifugar as células a 300 xg durante 8 min a 4 ° C para sedimentar as células. Aspirar cuidadosamente a supernatant. </li><li> Durante esta rotação, pré-lavar as esferas magnéticas. Transferir a quantidade desejada de esferas magnéticas para um novo tubo (utilizada a 1: 1 com as células) e adicionar um volume igual de tampão de isolamento para lavar as contas. Misturar bem utilizando uma micropipeta 1 ml e, em seguida, colocar o tubo no íman durante pelo menos 1 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as esferas magnéticas no mesmo volume inicialmente transferida antes da lavagem. </li><li> Ressuspender as células em cada tubo com 500 ul de tampão de isolamento e adicionar 500 uL de pérolas magnéticas pré-lavadas. </li><li> Incubar as células com as pérolas magnéticas durante 15 min num agitador orbital à temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para misturar bem. </li><li> Após a incubação, as células completamente pipeta usando uma micropipeta 1 ml, pelo menos, 10 vezes. Em seguida, adicionar 3-4 mL de tampão de isolamento e colocar cada tubo no íman durante 2 min. </li><li> Transferir cuidadosamente as células T CD4 + negativamente seleccionadas que estão emo sobrenadante para um novo tubo. </li></ol></li><li> Uma vez que o isolamento de células T CD4 + está concluída, a contagem das células com um hemocitómetro e manter as células em gelo. </li><li> Lavam-se as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 1,5 mL de 2x mistura de meios Th17-polarização a cada poço: IFNy anti-humano (20 ug / ml), anti-IL-4 humana (20 ug / mL), TGF-p humano (10 ng / mL), humano IL-1β (40 ng / mL), IL-23 (40 ng / mL), IL-6 humana (50 ng / mL) diluídos em um meio de base livre de soro (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 100? M de 2-mercaptoetanol). NOTA: Transfecção e interferência de ARN funciona em meios contendo soro. A finalidade da utilização de meios isentos de soro com este protocolo é conseguir uma melhor produção de IL-17A. </li><li> Centrifugar as células T CD4 + humanas a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células. Aspirar cuidadosamente o Supernatformiga. Em seguida, voltar a suspender as células em meios de base livre de soro e placa as células a uma densidade de 3 x 10 6 em 1,5 mL por poço, de modo que o volume final é de 3 mL por cavidade e citocinas polarizadoras estão agora a uma concentração final de 1x. <ol><li> Colocar as placas em 5% de CO2, 37 ° C incubador durante dois dias. </li></ol></li></ol> 2. Células de electroporação in vitro polarizada Th17 Humana <ol><li> No Dia 2, revestimento de 48 placas de cultura de tecidos com 250 por po de anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C. <ol><li> Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme. </li></ol></li><li> Preparar pequenos RNAs para transfecção. Para cada transfecção, alíquota de 1 mL de uma solução stock de 5? M de siARN para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incluir apropriado pequena contr RNA-correspondida químicaol. Mantenha todos os tubos no gelo. </li><li> Lavam-se as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 500 mL de 1X Th17-polarizando meios de comunicação a cada poço: IFNy anti-humano (10 ug / ml), anti-IL-4 humana (10 ug / mL), TGF-p humano (5 ng / mL), IL-humano 1β (20 ng / mL), IL-23 (20 ng / mL), IL-6 humana (25 ng / mL) diluídos em um meio de base livre de soro (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 100? M de 2-mercaptoetanol). </li><li> Depois das placas de cultura e reagentes de transfecção são preparados, ressuspender as células com uma micropipeta 1 ml, pipetando suavemente, mas garantindo que todas as células são destacadas do fundo dos poços. Reunir as células num tubo cónico e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. NOTA: Para os períodos de cultura mais longos do que o protocolo de quatro dias aqui apresentado, as culas devem ser transfectadas aproximadamente a cada 3 dias usando o mesmo protocolo. Passo 20,4 deve ser modificado no entanto uma vez que as células tratadas com diferentes pequenos RNAs não devem ser recolhidas. Todas as condições a ser testada deve ser recolhidas, contadas, e transfectados separadamente. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, e, em seguida, voltar a suspender as células em pelo menos 1 ml de PBS para lavagem. Contar as células Th17 vivo (por exemplo, com um hemocitetro utilizando a exclusão de azul de tripano para avaliar a viabilidade) e, em seguida, transferir as culas para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar as células. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender as células utilizando o tampão de ressuspensão fornecida a partir do kit de sistema de transfecção de 10 mL a uma densidade de 2,5-4 x 10 7 culas por ml. Manter as células à temperatura ambiente. NOTA: Como linha de orientação, tentar preparar apenas como muitas células como pode ser transfectado em 30 min. Vários lotes podem ser comparados. </li><li> Adicionar 9 uL de células para 1 L de ARN pequeno em cada MicroCentrifuge tubo. Pipetar uma vez para misturar as células e pequenos RNAs para transfecção, em seguida, carregar para a ponta do eléctrodo da pipeta fornecida. NOTA: Tipicamente, adicionar 9,5 mL de suspensão de células para garantir que há suficiente da mistura para impedir a criação de bolhas na ponta do eléctrodo da pipeta antes da transfecção. </li><li> Encher a tina fornecida com 3 mL de temperatura ambiente electrolico de Tampão E. Coloque a cuvete dentro da estação de pipeta e, em seguida, colocar a pipeta em posição no interior da cuvete. </li><li> electroporate imediatamente cada 10 uL de mistura de células e pequenos RNA usando os seguintes parâmetros: tensão de impulso 1,500-1,550 V, largura de impulso de 10 ms, e 3 impulsos total do dispositivo de transfecção. </li><li> Após a electroporação é completa, adicionar directamente a mistura de células a 500 mL de 1X Th17-polarizando meios em recipientes preparados de uma placa de cultura. Placas lugar em um 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante mais dois dias. NOTA: Lava-se a ponta do eléctrodo da pipeta por pipetagemcima e para baixo em PBS entre cada transfecção. </li></ol> 3. Células de colheita Th17 Humana <ol><li> Ressuspender as células em meio de cultura com uma micropipeta, pipetando suavemente mas garantindo que todas as células são destacadas do fundo dos poços. Preparar as células para ensaios de expressão funcionais e / ou de genes. NOTA: Rotineiramente, células suficientes são produzidos a partir de um único poço de células Th17 transfectadas para ser utilizado para análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície e de citocina e factor de transcrição ou de coloração intracelular para a preparação de ARN para a análise da expressão do gene. </li></ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+immune+axis%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li>
<li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+origin+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li>
<li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+bioanal+chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%26gamma%3B+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li>
<li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li>
<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Na%C3%AFve+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo fornece um método melhorado para a entrega de pequenos RNAs em células Th17 humanos. Embora as células Th17 humanos foram usadas aqui, este método de electroporação com pequenos RNAs pode ser utilizado com outros subconjuntos auxiliar humano primário de T, tais como Th1, Th2, e Tregs. Não tem funcionado bem para as células T CD4 + naive então as células devem ser activadas em cultura antes da transfecção. Para este protocolo, que primeiro optimizado o sistema in vitro de cultura de uma...

As células T CD4 + são orquestradoras cruciais da resposta imunitária adaptativa. As células T CD4 + naive são capazes de se desenvolver em várias células T efectoras diferentes (por exemplo, Th1, Th2, Th17, etc), cada um com o seu próprio conjunto de citocinas característicos e factores de transcrição, dependendo do microambiente local 1. As decisões da linhagem que as células T fazem são fundamentais tanto para a imunidade protetora e tolerância à auto. Culas Th17 são um subconjunto de células T conhecidos para combater bactérias extracelulares e fungos, mas as suas respostas erradas também está implicado na patogénese de várias doenças auto-imunes e inflamatórias tais como esclerose múltipla e psoríase 2, 3. Culas Th17 humanos podem ser geradas a partir de células naive T CD4 + in vitro, proporcionando-lhes um ambiente de polarização apropriado 4. Vario<html> us combinações das citocinas IL-1β, IL-23, TGF-p e IL-6 foram utilizados para o desenvolvimento de células humanas Th17. Culas Th17 humano expressar CCR6, um receptor de quimiocina que é comumente utilizada para identificar esta população de células e são definidos pela expressão do seu principal factor de transcrição, RORγt (codificado por RORC) 5, 6. culas Th17 têm a capacidade de expressar várias citocinas, mas a IL-17A é a citocina efectora definidora de linhagem produzida por estas células. Foi examinada a expressão de todos os três marcadores associados-Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) para avaliar a robustez do nosso ensaio de diferenciação humano Th17 in vitro. Além disso, foi realizada cultura de células CD4 + T humanas em condições não polarizadores, onde não há citoquinas ou anticorpos bloqueadores foram adicionados ao meio de cultura a utilizar como controlo negativo uma vez que a expressão destes marcadores Th17 deve ser muito baixa ou ausente. ve_content &quot;&gt; Uma forma de estudar o desenvolvimento normal humana de células T e biologia é manipular a expressão de genes durante o seu desenvolvimento. Curto-ARN interferente (siRNA) são pequenas moléculas de ARN sintéticos que têm como alvo ARNm de codificação de proteínas e podem ser utilizados para reduzir a expressão do gene específico . MicroRNAs (miARNs) são endógenos não codificantes pequenos RNAs conhecidos para modular a expressão do gene de pós-transcricionalmente. miARNs foram mostrados para desempenhar um papel importante em ambos murino e biologia de célula T humana, incluindo em culas Th17 7, 8, 9. É é crucial ter métodos fiáveis ​​de manipulação de actividade de RNA pequeno em células T humanas de estudar os seus efeitos sobre a expressão do gene e, finalmente, sobre a biologia de célula T humana. Aqui, descrevemos um protocolo de fácil utilização, consistente e fiável que nós desenvolvido para introduzir pequenos RNAs sintéticos e ácidos nucleicos bloqueados (LNA, quimicamente modificado ácidos nucleicos com maior estabilidade)em células imunitárias e, especificamente, em células humanas Th17. Existem vários métodos alternativos de introdução de pequenos RNAs em células de mamíferos, os quais geralmente caem em categorias químicas, biológicas, físicas ou 10. métodos químicos normalmente utilizados, incluindo transfecções à base de lípidos e transfecções de fosfato de cálcio, confiaram na criação de complexos de ADN-químicas que são mais eficientemente absorvidos pelas células. Em geral, os métodos químicos não são tão eficazes para a transfecção de células T primárias. O método biológico mais comum é a utilização de um vector virai (por exemplo, retrovus ou lentivus), que insere directamente ARN estranho num hospedeiro como uma parte do seu ciclo de replicação natural. transdução virai tipicamente leva mais tempo para completar, especialmente quando um factores em tempo para a clonagem molecular de plasmeos provirais. Além disso, os vectores de transdução viral pode ser potencialmente prejudicial para os pesquisadores humanos. A electroporação é um m físicaétodo de induzir a permeabilização da membrana, sujeitando as células de impulsos de alta tensão, permitindo que os ácidos nucleicos de introduzir transitoriamente para dentro da célula, onde podem actuar sobre o alvo. instrumentos eletroporação tradicionais não foram eficazes para a transfecção de linfócitos primários. No entanto, a electroporação optimizado próxima geração tem provado ser capaz de transfectar células T na eficiência muito elevada, especialmente quando o material a ser transfectada é ARN pequeno. O termo próxima geração é livremente utilizado para diferenciar as duas plataformas mais recentes (por exemplo, néon, Amaxa) a partir de máquinas de electroporação tradicionais. Além disso, este método é facilmente escalável para telas rendimento moderado com um máximo de cerca de 120 pequenos RNAs de uma única experiência, muitas vezes utilizando reagentes sintéticos validados. Importante, as transfeces de sucesso pode ser conseguida em menos de 16 horas após a activação de células T. A desvantagem deste método, no entanto, é que não resulta em incorpor genómico estável, e é, portanto, transitórios. Por isso, é importante o esforço extra para criar uma construção de expressão estável, que pode ser embalado num vector virai e expresso com sucesso em células T em casos em que é necessária a expressão de longo prazo de um ARN pequeno. Usámos uma próxima geração de transfecção (por exemplo, de néon) para proporcionar diversas ferramentas sintéticos simples ou de cadeia dupla de RNA ou de oligonucleidos de LNA para diferentes fins de 11, 12, 13. interferência de ARN eficiente pode ser induzida no primário do rato e células T humanas utilizando ARN curta interferente de cadeia dupla (ARNip). Este protocolo descreve condições optimizadas para a utilização desta técnica em culas Th17 humanos. Além de siRNAs, disponíveis comercialmente imita miARN sintéticos e inibidores podem ser usados ​​para estudar o ganho de miARN e perda de função. imita miARN são moléculas de cadeia dupla de RNA muito semelhantes para os siRNAs, mas designed, com a sequência de miARNs maduros endógenos. inibidores de miARN são quimicamente modificados individuais oligonucleótidos de cadeia de ARN e / ou de LNA base que se ligam a miARNs nativas e antagonizam a sua função. Descobrimos que todas estas ferramentas podem ser usadas de forma eficaz em linfócitos T primárias cultivadas, incluindo mas não limitado a células Th17 humanos.

<table><tbody><tr><td>anti-humano IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-humano IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S. B3</td></tr><tr><td>anti-humano CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>camundongo anti-humano CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-humano RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-humano CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3 / Coloração do fator de transcrição Conjunto de buffer</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Para coloração de citometria de fluxo de fator de transcrição intracelular</td></tr><tr><td>Inibidor de ligação Hu FcR Purificado</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td> <td>"Mídia de base sem soro"</td></tr> <tr><td>MACS CD28 grau funcional puro, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-CD3 humano Purificado</td><td>UCSF núcleo de anticorpo monoclonal</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purificado anti-humano IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-humano IFNg, ebiociência purificada de grau funcional</td><td></td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>IL-23 humano recombinante</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 humana recombinante&beta;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>TGF humano recombinante-&beta; 1</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 humano recombinante</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Não-alvo #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Humano RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Humano PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kit de Células T CD4 Humanas Intocadas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Células T CD4+ Kit de</td></tr><tr><td>Isolamento Sistema de Tranfecção Neon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Instrumento de eletroporação de próxima geração</td></tr><tr><td>Sistema de Tranfecção Neon 10 &mu; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Ressuspensão T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Fornecido no kit (MPK1096)</td><td>"Tampão de Ressuspensão de Transfecção"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Gradiente de Densidade Médio</td></tr><tr><td>costar 6-well placas tratadas para cultura de tecidos</td><td>Placas de</td><td>fundo</td><td></td></tr> <tr><td>plano Corning 3516placas tratadas com cultura de tecidos de 48 poços costar</td><td>Placas de fundo plano</td><td>Corning</td><td>3548</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Deve fazer 1x solução com água destilada antes de usar</td></tr></tbody></table>

rna pequeno transfecção em células primárias th17 humano por next generation electroporação

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

As células T CD4+ podem se diferenciar em vários subconjuntos de células T auxiliares efetoras, dependendo do meio de citocinas circundante. As células Th17 podem ser geradas a partir de células T CD4+ virgens in vitro, ativando-as na presença das citocinas polarizadoras IL-1β, IL-6, IL-23 e TGFβ. As células Th17 orquestram imunidade contra bactérias e fungos extracelulares, mas sua atividade aberrante também tem sido associada a várias doenças autoimunes e inflamatórias. As células Th17 são identificadas pelo receptor de quimiocina CCR6 e definidas por seu fator de transcrição mestre, RORγt, e citocina efetora característica, IL-17A. As condições de cultura otimizadas para a diferenciação de células Th17 facilitam os estudos mecanísticos da biologia das células T humanas em um ambiente controlado. Eles também fornecem um cenário para estudar a importância de genes específicos e programas de expressão gênica por meio da interferência de RNA ou da introdução de imitadores ou inibidores de microRNA (miRNA). Este protocolo fornece um método fácil de usar, reprodutível e altamente eficiente para a transfecção transitória de células Th17 humanas primárias diferenciadoras com pequenos RNAs usando um dispositivo de eletroporação de última geração.

O primeiro passo para o desenvolvimento de um sistema fiável de electroporating com sucesso células Th17 humanos era robusta para gerar in vitro diferenciadas culturas de culas Th17 humanos. As células T cultivadas sob condições polarizantes Th17-expressa o receptor de quimiocina CCR6 e o factor de transcrição RORγt (figura 1A, esquerda). Estes marcadores não foram expressas quando as células T foram cultivadas sob condições não polarizadores (THN) (figu...

A eletroporação de próxima geração é um método eficiente para transfectar células Th17 humanas com pequenos RNAs para alterar a expressão gênica e o comportamento celular.

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

O objetivo geral deste procedimento é transfectar de forma eficiente linfócitos T humanos primários com reagentes de RNA de pequeno porte utilizando eletroporação de próxima geração. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais na biologia dos linfócitos T, como a forma como produtos gênicos específicos regulam a diferenciação e a função imunológica dos linfócitos T. A principal vantagem desta técnica é que ela representa um método altamente eficiente e confiável para transfectar linfócitos T humanos primários com sRNAs e outros reagentes sintéticos de RNA de pequeno porte.Este método pode fornecer informações sobre a biologia de células Th17 humanas, mas também pode ser aplicado a outros sistemas, como outros linfócitos de humanos ou camundongos. No dia zero, revestir placas de cultura de tecidos de seis poços com 1,5 mililitro por poço de anti-CD3 humano e anti-CD28 humano em PBS com cálcio e magnésio por pelo menos duas horas a 37 graus Celsius. Após o isolamento e a lavagem das células mononucleares do sangue do cordão umbilical, ou CBMCs, realizar o isolamento de linfócitos T CD4 positivos por seleção negativa utilizando um kit comercial de linfócitos T CD4 positivos humanos.Adicione o tampão de isolamento e re-suspenda as células mononucleares. Transfira as células para um novo tubo de cinco mililitros, então adicione 100 microlitros de soro bovino fetal, ou FBS, e 100 microlitros da mistura de anticorpos por tubo, e incube cada tubo a quatro graus Celsius por 20 minutos em um agitador orbital para misturar bem. Após a incubação, adicione três a quatro mililitros de tampão de isolamento para lavar as células.Centrifugue as células a 300 vezes g durante oito minutos a quatro graus Celsius para obter o pellet celular. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Transfira as microesferas magnéticas para um novo tubo e adicione um volume igual de tampão de isolamento para lavar as microesferas.Use uma micropipeta de um mililitro para misturar bem as esferas e, em seguida, coloque o tubo no ímã por pelo menos um minuto. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as esferas magnéticas no mesmo volume transferido inicialmente antes da lavagem. Adicione 500 microlitros do tampão de isolamento a cada tubo e re-suspenda as células, depois adicione 500 microlitros de esferas magnéticas pré-lavadas.Incube as células com as microesferas magnéticas por 15 minutos em agitador orbital à temperatura ambiente para misturar bem. Após a incubação, utilizando uma micropipeta de um mililitro, pipete as células completamente pelo menos 10 vezes, depois adicione três a quatro mililitros de tampão de isolamento e coloque cada tubo no ímã por dois minutos. Transfira cuidadosamente as células T CD4 positivas selecionadas negativamente que estão no sobrenadante para um novo tubo.Após a conclusão do isolamento de células T CD4 positivas, mantenha as células em gelo e conte as células utilizando um hemocitômetro. Lave as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS, em seguida adicione 1,5 mililitro da mistura 2X de meio polarizante para Th17 em cada poço. Em seguida, centrifugue as células T CD4 positivas humanas para obter o pellet celular.Aspire cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o, depois re-suspenda as células em meio básico sem soro e plaque as células de modo que o volume final seja três mililitros por poço e as citocinas polarizantes estejam agora em concentração final de 1 X; em seguida, coloque as placas em incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por dois dias. No segundo dia, recubra placas de cultura de tecidos de 48 poços com 250 microlitros por poço de anti-CD3 humano e anti-CD28 humano em PBS com cálcio e magnésio por pelo menos duas horas a 37 graus Celsius. Para preparar os pequenos RNAs para transfeção, alíquota um microlitro de uma solução estoque de cinco micromolar de siRNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada transfeção.Mantenha todos os tubos no gelo. Em seguida, lave as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS e, depois, adicione 500 microlitros de meio polarizante Th17 1X a cada poço. Depois que as placas de cultura e os reagentes de transfeção forem preparados, re-suspenda as células com uma micropipeta de um mililitro, pipetando suavemente, mas garantindo que todas as células sejam destacadas do fundo dos poços.Reúna as células em um tubo cônico e centrifugue os tubos a 500 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, re-suspenda as células em pelo menos um mililitro de PBS para lavagem. Conte as células Th17 viáveis com um hemocitômetro, utilizando a exclusão com azul de tripano para avaliar a viabilidade, e depois pelote as células em um tubo de microcentrífuga.Aspire cuidadosamente o sobrenadante e re-suspenda as células utilizando o tampão de re-suspensão fornecido no kit. Mantenha as células à temperatura ambiente. Adicione nove microlitros de células a um microlitro de RNA de pequeno porte em cada tubo de microcentrífuga.Pipete uma vez para misturar as células e os RNAs pequenos para transfeção, em seguida, carregue as células na ponta do eletrodo de pipeta fornecida. Para garantir uma transfeção ideal, evite introduzir bolhas de ar na ponta do eletrodo de pipeta antes da transfeção. Adicionamos 9,5 microlitros de suspensão celular para assegurar que haja quantidade suficiente de mistura e evitar a formação de bolhas na pipeta de eletroporação.Encha a cubeta fornecida com três mililitros de tampão eletrolítico à temperatura ambiente. Coloque a cubeta dentro da estação de pipeta neon e, em seguida, posicione a pipeta dentro da cubeta. Eletropore imediatamente cada mistura de 10 microlitros de células e RNA de pequeno porte.Após a eletroporação ser concluída, adicione diretamente a mistura celular a 500 microlitros de meio polarizante Th17 1X em poços preparados de uma placa de cultura. Por fim, coloque as placas em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por mais dois dias. Trabalhe com cuidado, mas rapidamente, para evitar a morte celular.Se houver muitas amostras para eletroporação, as células podem ser coletadas e transfectadas em lotes. Este gráfico de contorno mostra que linfócitos T cultivados em condições de polarização Th17 expressaram o receptor de quimiocina CCR6 e o fator de transcrição ROR gamma T, os quais não foram expressos quando os linfócitos T foram cultivados em condições não polarizantes. Linfócitos T cultivados em condições de polarização Th17 também produziram IL-17A após reestimulação, mas não nas condições ThN.A diferenciação de Th17 ainda ocorre após a transfeção com pequenos RNAs, mas em alguns experimentos, observa-se uma redução na frequência de produção de IL-17A. Isso demonstra a importância de utilizar um controle de pequeno RNA com química equivalente para comparação dentro de cada experimento. A viabilidade é mantida após a transfeção com pequenos RNAs e geralmente é superior a 70%. A transfeção de células Th17 humanas no segundo dia com um pool de siRNA direcionado ao gene PTPRC, que codifica o CD45, reduziu fortemente a expressão de CD45 em comparação com um siRNA controle com química equivalente.O deslocamento populacional unimodal na expressão de CD45, observado aqui, indica uma eficiência de transfeção próxima a 100%. A redução da expressão de ROR gamma T por RNAi teve um efeito funcional, já que essas células exibiram produção reduzida de IL-17A em comparação com células transfectadas com um siRNA controle. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transfectar células Th17 humanas polarizadas in vitro com pequenos RNAs utilizando eletroporação de nova geração.

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Apresentamos nosso protocolo nucleofection high-throughput otimizado como uma forma eficiente de transfecting humanos primários derivados de monócitos com células dendríticas ou DNA plasmídeo ou siRNA sem causar maturação das células. Nós ainda fornecer provas para silenciar siRNA sucesso do gene alvo RIG-I em ambos os mRNA e os níveis de proteína.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Este protocolo apresenta um método eficaz e fiável para transfectar humanos THP-1, macrófagos com siRNA ou de ADN de plasmídeo por electroporação com alta eficiência de transfecção elevada, mantendo a vitalidade celular e capacidade total de diferenciação de macrófagos e de polarização.

A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

Utilizando um Cas9 preassembled ribonucleoprotein complexo (RNP) é um método poderoso para edição de genoma preciso e eficiente. Aqui, destacamos a sua utilidade em uma ampla variedade de células e organismos, incluindo células humanas primárias e os dois clássicos e emergentes organismos modelo.

Maior genoma edição com Cas9 Ribonucleoprotein em diversas células e organismos

Desenvolvemos um protocolo para transfectar células epiteliais primárias de pigmento humano por eletroporação com o gene que codifica o fator derivado do epitélio pigmentar (PEDF) usando o sistema de transposon da Bela Adormecida (SB). A transfecção bem-sucedida foi demonstrada pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR), immunoblotting e ensaio imunoenzimático (ELISA).

Modificação Genética Baseada em Eletroporação de Células Epiteliais de Pigmento Humano Primário usando o Sistema Transposon da Bela Adormecida

Apresentamos um método de cultura e edição gênica de células B primárias de macaco rhesus usando CRISPR/Cas9 e vírus adenoassociado recombinante sorotipo 6 para o estudo de terapias com células B.

Edição Gênica de Células B Primárias de Macaco Rhesus

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

A entrega de editores genômicos como RNAs é um meio particularmente potente de modificar os genomas das células primárias e linhagens celulares de mamíferos. O objetivo desse protocolo é entregar editores genômicos como mRNA em células e linhagens celulares primárias de mamíferos, seguido por sequenciamento e análise direcionados da Illumina para quantificar os resultados da edição.

Edição do Genoma em Células Primárias de Mamíferos por Eletroporação do RNA Editor

Aprenda a transfectar células Th17 humanas primárias com pequenos RNAs usando eletroporação de próxima geração. Este método eficiente permite estudar a diferenciação e função imunológica de linfócitos T.

RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

Explorar mais vídeos