Name: Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Aprenda a expressão e purificação do peptídeo antimicrobiano S100A12 para estudos de atividade contra H. pylori. Este protocolo otimizado fornece altos rendimentos de dímero estável para pesquisas em microbiologia.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Departamento de Veteranos Assuntos Carreira Desenvolvimento Award 1IK2BX001701, CTSA prêmio UL1TR000445 do Centro Nacional para o Avanço Translational Sciences, o National Science Foundation Award Números 1547757 e 1400969, e NIH concessão GM05551. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente visões oficiais do Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Expressão de S100A12 <ol><li> Transformar células BL21 DE3 competentes com um plasmídeo pGEMEX-S100a12 utilizando um protocolo padrão de choque térmico 18 . Adicionar 1 a 5 μL de plasmídeo a 50 μL de bactérias num tubo de microcentrífuga em gelo. Incubar durante 20 min. </li><li> Aquecer as células a 42 ° C durante 30 s. </li><li> Incubar as células em gelo durante 2 min. </li><li> Adicionar 500 μL de meio SOC às células. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm num agitador orbital durante 1 h. </li><li> Placa 150 μL da reação de transformação em meio LB-agar (suplementado com 100 μg / mL de ampicilina). Incubar durante 12-16 h a 37 ° C. </li><li> Escolha uma colônia. Inocular 2 mL de LB (suplementado com 100 μg / mL de ampicilina). </li><li> Incubar durante 4-6 h a 37 ° C num agitador orbital (300 rpm). A OD 600 deve ler entre 1-3 unidades de absorvância. </li><li> Adicionar 500 μL de cultura inicial a 50 mL de ZYM-5052 autoinduCtion 26 suplementado com 100 μg / mL de ampicilina. Para melhor arejamento e máxima expressão, use um frasco Erlenmeyer de 250 mL. Agitar (300 rpm) durante 24 h, a 37 ° C. </li><li> Transferir a suspensão bacteriana para um tubo de centrífuga. Pellet as células por centrifugação (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C. </li><li> Decantar a mídia, registrar a amostra e armazenar a pasta celular a -80 ° C. A amostra é estável por anos. </li></ol> 2. Purificação de S100A12 utilizando cromatografia de baixa pressão <ol><li> Ressuspender as células em 30 mL de Tris 20 mM, pH 8,0. </li><li> Sonicate a suspensão em gelo para lisar células. Utilize ~ 20 W de saída, 5 s ligado e 5 s fora do ciclo durante 5 min. </li><li> Transferir a solução para tubos de centrífuga de alta velocidade. Esclarecer o lisado celular por centrifugação, 20.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Decantar o sobrenadante e transferir para um copo de polipropileno limpo de 100 mL. Arrefecer a solução colocando o copo em gelo. Adicionar uma agitaçãoR e adicionar lentamente 11,20 g de sulfato de amónio. Deixar a solução agitar sobre gelo durante mais 1 h. Isto irá criar uma solução a 60% de sulfato de amónio e precipitar a maioria das proteínas endógenas de E. coli . S100A12 permanecerá solúvel. </li><li> Centrifugar a solução a 4 ° C, 20 000 xg durante 20 minutos para sedimentar a proteína precipitada. </li><li> Decantar o sobrenadante e transferir para tubos de diálise (MWCO 3.500 kDa). Dializar contra 1 L de Tris 20 mM, pH 8,0 a 4 ° C. Mude o tampão de diálise duas vezes. Permitir 4 h entre as alterações. </li><li> Cromatografia de permuta aniónica <ol><li> Realizar a cromatografia em um sistema de baixa pressão. O caudal típico é de 1 mL / min. </li><li> Equilibrar uma coluna de 5 mL de Sepharose com 10 mL de Tris 20 mM, pH 8,0. </li><li> Coloque os ~ 40 mL de solução de S100A12 usando a bomba de amostra (colete o fluxo através). </li><li> Lavar a coluna com 10 mL de Tris 20 mM, pH 8. </li><li> Desenvolver a coluna com um gradiente 0-30% (BuFfer B é Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 1 M) ao longo de 19 volumes de coluna (CV, 95 mL). Recolher fracções de 5 mL. </li><li> Tomar uma alíquota de 10 μL de cada fracção e analisar utilizando MES SDS PAGE com coloração Coomassie. Executar o gel utilizando uma tensão constante (20 V / cm) durante 30 min. </li><li> Pool fracções contendo S100A12. S100A12 corre a ~ 10 kDa de proteína num gel desnaturante. </li><li> Concentrar as fracções para 5 mL utilizando um dispositivo de ultrafiltração (MWCO 10 kDa). Centrifugar a 3000 xg durante ~ 8 min. Pegue a fração superior. </li></ol></li><li> Cromatografia de exclusão de tamanho <ol><li> Equilibrar a coluna S75 com 1 CV (120 mL) de Tris 20 mM pH 8, NaCl 100 mM. </li><li> Injectar &lt;5 mL de fracções S100A12 concentradas (a partir da cromatografia de permuta iónica). </li><li> Desenvolver a coluna a um caudal de 1 mL / m em 120 mL. Recolher fracções de 5 mL. </li><li> Tomar uma alíquota de 10 μL de cada fracção e analisar utilizando SDS PAGE com coloração com Coomassie. Validar a identidade proteica usandoWestern blot ou espectrometria de massa (massa molecular calculada da subunidade monomérica 10,575.0 Da, medida 10575,4 Da). </li></ol></li><li> Frações de pool <ol><li> Medir a absorvï¿½cia da proteï¿½a A 280 utilizando um espectrofotï¿½etro. Use o buffer SEC como um espaço em branco. O coeficiente de extinção calculado para o homodímero S100A12 é 5960 M -1 cm -1 . NOTA: Rendimentos típicos são 35-45 mg de S100A12 por 50 mL de cultura. </li><li> Alíquota S100A12 em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (1 mg / tubo), congelamento rápido em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Ensaios de actividade antimicrobiana <ol><li> Colocar a estirpe G27 de H. pylori sobre placas de ágar de soja trípticas suplementadas com sangue de ovelha a 5% (placas de ágar sangue). Crescer 2-3 dias a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono. </li><li> Inocular H. pylori em caldo de Brucella suplementado com 1x colesterol. Cultura sobreAgitação noturna (250 rpm) a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono. </li><li> Diluir H. pylori 1:10 em 50% de caldo de Brucella, 50% de tampão de calprotectina mais 1x colesterol e cultura em meio isolado ou suplementado com 100 μM de cloreto de zinco mais 0, 100 ou 1000 μg / mL de S100A12 purificado. Cultura agitação durante a noite (250 rpm) a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono. </li><li> No dia seguinte, efectuar diluições em série e placa sobre placas de agar de sangue. Deixar as colónias bacterianas crescerem durante 2-3 dias a 37 ° C em ar ambiente suplementado com 5% de dióxido de carbono. Enumerar as unidades formadoras de colónias para calcular o crescimento bacteriano na presença ou ausência de S100A12 e / ou zinco exógeno. </li></ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Immunity%3A+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li>
<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
<li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li>
<li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastric+precancerous+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dig+Dis%22%5BJournal%5D)">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
<li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense%2C+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li>
<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

É apresentado um protocolo eficiente para expressão e purificação de S100A12 humano. O sistema de expressão de E. coli é a ferramenta mais comum usada para a produção de proteínas recombinantes, particularmente quando são necessárias quantidades de mg para estudos bioquímicos e biofísicos. Um aperfeiçoamento chave do procedimento aqui descrito é o uso de meios de auto-indução 26 que aumenta o rendimento da proteína purificada por um factor de quase trinta em comparação com a expressão co...

As proteï¿½as S100 sï¿½ uma classe da famï¿½ia EF-hand de proteï¿½as de ligaï¿½o de cï¿½cio com uma diversidade de funï¿½es 1 . Eles são expressos de uma forma específica de tecidos e células, e regulam um amplo espectro de funções celulares 2 , 3 . Exclusivas para proteínas de ligação ao cálcio, as proteínas S100 exibem funções intracelulares e extracelulares 4 , 5 . Dentro da célula, a ligação de Ca2 + induz uma alteração conformacional que expõe uma superfície hidrofóbica que alveja especificamente parceiros de ligação à proteína 6 . Este mecanismo intracelular regula processos importantes como proliferação celular, diferenciação e metabolismo energético. No meio extracelular, as proteínas S100 exibem duas funções 7 . Num deles, actuam como proteínas associadas a padrões moleculares associados (DAMP) e iniciam uma pró-inflamaçãoResposta imune atórica através da interação com receptores de reconhecimento de padrão 8 , 9 . Além disso, vários membros da classe de proteínas S100 sequestam metais de transição, uma função que serve para privar patógenos microbianos em um processo denominado imunidade nutricional 10 , 11 . S100A12 (também conhecida como calgranulina C e EN-RAGE) é altamente expressa em macrófagos e neutrófilos e tem sido identificada como potencial biomarcador para doenças inflamatórias 12,13 . Além de ligar o cálcio nos seus locais EF-Hand, S100A12 tem dois locais de ligação de metais de transição de alta afinidade localizados em extremidades opostas da interface dimérica 14 , 15 . Cada sítio de ligação é constituído por três resíduos de histidina e um resíduo de ácido aspártico e pode quelar zinco ou cobre &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Recentemente, relatamos que a fome de zinco dependente de S100A12 é importante na regulação do crescimento de Helicobacter pylori e da atividade de fatores de virulência pró-inflamatórios 18 . H. pylori infecta o estômago de cerca de metade da população humana do mundo; Tornando-se sem dúvida um dos mais bem sucedidos patógenos bacterianos [ 19] . A infecção com H. pylori pode levar a resultados significativos da doença gástrica incluindo gastrite, úlcera péptica e duodenal, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT) e adenocarcinoma gástrico invasivo (câncer de estômago). O câncer de estômago é a principal causa de morte associada ao câncer de não-cardia no mundo, eo maior fator de risco associado para câncer de estômago é a infecção por H. pylori . H. pylori persiste no nicho gástrico apesar de um robuSt resposta imune ao patógeno, sublinhando a necessidade de uma melhor compreensão dos mecanismos imunes de controle desta infecção bacteriana 20 , 21 , 22 , 23 . A inflamação associada ao H. pylori é caracterizada por uma profunda infiltração de células polimorfonucleares, ou neutrófilos, que depositam um repertório de proteínas antimicrobianas, incluindo S100A12, no local da infecção 18 , 24 , 25 . Em um esforço para entender o complexo diálogo entre hospedeiro e patógeno, buscamos refinar a técnica para purificar S100A12 e usá-lo para estudar o efeito antimicrobiano que exerce sobre este patógeno clinicamente relevante. O protocolo abaixo descreve uma técnica melhorada para a purificação de S100A12 no seu estado biologicamente activo; Capazes de se ligar a metais nutrientes com altaE eliminando-os de microrganismos invasores. Além disso, os métodos abaixo destacam a utilidade desta proteína como um reagente crítico para estudar o mecanismo pelo qual as moléculas antimicrobianas inatas restringem o crescimento de patógenos bacterianos. As proteínas da família S100A ganharam apreciação como um importante grupo de moléculas do sistema imune inatas que participam na sinalização imune bem como na defesa do hospedeiro 27 . O mais bem estudado destes é a calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . A calprotectina é uma proteína associada a neutrófilos que forma um heterodímero das subunidades S100A8 e S100A9 que liga metais de transição na interface dímero 31 . Verificou-se que a calprotectina possui dois locais de ligação de metal: o local 1 pode ligar Zn2 + , Mn2 + ou Fe2 + e o sítio 2 pode<html> Se Zn2 + 31 , 32 . Numerosos relatos demonstraram que a calprotectina tem atividades antimicrobianas contra diversos agentes patogênicos incluindo Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e que os efeitos inibitórios são devidos à atividade de quelação de metal da calprotectina 25,28 , 29 . Trabalhos anteriores demonstraram que a calprotectina exerce numerosas atividades sobre H. pylori, incluindo a alteração da estrutura do lípido A na membrana externa, reprimindo o sistema de secreção tipo IV (que é um importante fator de virulência proinflamatório dentro de H. pylori ), induzindo a formação de biofilme e reprimindo Crescimento e viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da doseClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Além disso, os ensaios genéticos e bioquímicos revelaram que a actividade antibacteriana da calprotectina contra H. pylori foi largamente derivada da sua capacidade para ligar o zinco nutriente 25 . H. pylori requer zinco, como foi determinado por pesquisas anteriores, que utilizou um meio quimicamente definido para determinar os requisitos de micronutrientes para este patógeno para crescer e proliferar [ 34] . Além disso, a calprotectina foi altamente abundante nos tecidos infectados com H. pylori e associada a infiltrados neutrófilos, indicando que o hospedeiro pode empregar calprotectina como estratégia antimicrobiana durante a infecção e subseqüente inflamação 25,35. Evidências recentes de técnicas de triagem proteômica não-direcionadas sugerem que sob condições onde espécies reativas de oxigênio são abundantes, calprotecO estanho sofre modificações pós-translacionais que alteram o local de ligação da hexa-histidina, inibindo assim a actividade de ligação do metal da proteína 36 . Como tal, nós hipotetizamos que outras proteínas da família S100A entre o vasto repertório dessas moléculas poderiam potencialmente atuar como quelantes metálicos auxiliares. Seleccionou-se S100A12 para estudo adicional porque não foi identificado no referido ecrã para modificação pós-tradução, tem a capacidade de ligar o zinco e é altamente abundante em tecidos humanos derivados de indivíduos infectados com H. pylori . O nosso trabalho indica que S100A12 pode inibir o crescimento ea viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da dose na estirpe G27 de H. pylori , e que a actividade antimicrobiana desta proteína pode ser invertida pela adição de zinco em excesso de nutrientes. Este trabalho complementa o nosso trabalho anterior indicando S100A12 exerceram atividade antimicrobiana contra PMSS1 e 7.13 de H. pylori , demonstrando sua ampla atividade antibacteriana contra numerosos isolados clínicos e linhagens de H. pylori adaptadas ao laboratório 18 . Juntos, estes resultados confirmam a importância de S100A12 como um mecanismo para controlar o crescimento bacteriano e proliferação via imunidade nutricional. Futuros estudos desta importante interacção hospedeiro-bactéria poderiam incluir explorar a actividade de S100A12 para reduzir a carga bacteriana dentro dos tecidos do hospedeiro ou determinar a contribuição desta proteína para a sinalização imune no contexto da infecção por H. pylori .

<table><tbody><tr><td><forte>S100A12 Expressão</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Células de expressão</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) células competentes</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Componentes</td><td></td><td></td><td></td>médios de autoindução</tr><tr>Produtos <td>de pesquisa de extrato de</td><td>levedura</td> Internacional <td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>Produtos</td><td>de pesquisa NaCl International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr>Produtos de <td>pesquisa de</td><td>triptona</td> International <td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Produtos de Pesquisa de Glicerol</td><td>International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>Produtos de Pesquisa</td><td>de D-glicose</td> Internacional <td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>lactose Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td><forte>Agente de seleção</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Produtos de Pesquisa Internacional</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>S100A12 Purificação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Sistema de Cromatografia</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products</td><td>International T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de ágar sangue</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Brucella</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expressão, purificação e actividade antimicrobiana de s100a12

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

As proteínas de calgranulina são mediadores importantes da imunidade inata e são membros da classe S100 da família EF-mão de proteínas de ligação de cálcio. Algumas proteínas S100 têm a capacidade de se ligar a metais de transição com alta afinidade e efetivamente seqüestrar eles longe de patógenos microbianos invasores em um processo que é denominado &quot;imunidade nutricional&quot;. O S100A12 (EN-RAGE) liga tanto o zinco como o cobre e é altamente abundante em células imunes inatas tais como macrófagos e neutrófilos. Relatamos um método refinado para a expressão, enriquecimento e purificação de S100A12 na sua configuração ativa de ligação a metais. A utilização desta proteína em análises de crescimento e viabilidade bacteriana revela que S100A12 tem actividade antimicrobiana contra o patogénio bacteriano Helicobacter pylori . A actividade antimicrobiana baseia-se na actividade de ligação ao zinco de S100A12, que quela o zinco nutriente, privando assim H. pylori que requer zinco para crescimento e pRoliferation.

S100A12 expressão e purificação Uma purificação em três passos produziu ~ 40 mg de S100A12 recombinante a partir de 50 mL de cultura bacteriana. O primeiro passo foi uma precipitação com sulfato de amónio de proteínas endógenas de E. coli . Este passo foi seguido por cromatografia de permuta aniónica ( Figura 1A ). A proteína é rastreada por uma SDS-PAGE corada com Coomassie Brilliant Bl...

Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

O objetivo geral deste protocolo é facilitar o isolamento e a purificação da S100A12 em sua forma ativa, para que possa ser utilizada em ensaios antimicrobianos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de microbiologia, como qual é o papel da S100A12, um peptídeo antimicrobiano produzido em resposta à infecção por bactérias patogênicas. A principal vantagem desta técnica é que nosso protocolo otimizado fornece altos rendimentos de dímero de S100A12 puro e estável, que possui a capacidade de ligar e sequestrar metais nutrientes.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque a S100A12 forma oligômeros de tamanhos variados sob certas condições, e esses oligômeros apresentam atividade antimicrobiana reduzida in vitro. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando começamos a purificar e estudar a atividade antimicrobiana de uma proteína relacionada da família S100A chamada calprotectina. A demonstração visual deste método é essencial para o tamanho e as etapas finais de purificação em coluna.E os ensaios antimicrobianos são importantes para o sucesso deste processo. Para iniciar este procedimento, transforme células competentes BL21 DE3 conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, adicione de um a cinco microlitros de plasmídeo a 50 microlitros de bactérias em um tubo de microcentrífuga sobre gelo.Incube por 20 minutos. Após isso, submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 30 segundos. Incube em gelo por dois minutos.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio SOC. Incube a 37 graus Celsius em agitador orbital a 250 rpm por uma hora. Em seguida, plaque 150 microlitros da reação de transformação em meio ágar LB, suplementado com 100 microgramas por mililitro de ampicilina.Incubar por 12 a 16 horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, escolher uma única colônia e inocular dois mililitros de meio LB suplementado com ampicilina. Incubar a 37 graus Celsius em agitador orbital, a 300 rpm, por quatro a seis horas.Em seguida, adicione 500 microlitros de cultura inicial a 50 mililitros de meio de autoindução ZYM 5052 suplementado com ampicilina. Agite a 300 rpm por 24 horas a 37 graus Celsius. Depois, transfira a suspensão bacteriana para um tubo de centrífuga.Centrifugue a 4.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação, remova o meio, registre a amostra e armazene a pasta celular a menos 80 graus Celsius. Para iniciar, re-suspenda a pasta celular em 30 mililitros de tris 20 milimolar, pH 8,0. Em seguida, sonique a suspensão em gelo a 20 watts, utilizando um ciclo de cinco segundos ligado e cinco segundos desligado, durante cinco minutos, para lisar as células.Transfira a solução sonificada para tubos de centrífuga de alta performance. Centrifugue a 20.000 × g a quatro graus Celsius por 30 minutos para clarificar o lisado celular. Após isso, decante o sobrenadante para um béquer limpo de 100 mililitros de polipropileno.Coloque o béquer sobre gelo para resfriar a solução. Adicione uma barra de agitação e acrescente lentamente 11,20 gramas de sulfato de amônio. Agite a solução em gelo durante uma hora.Em seguida, transfira a solução para tubos de centrífuga e centrifugue a 20.000 × g a quatro graus Celsius por 20 minutos para formar o pellet da proteína precipitada. Decante o sobrenadante para tubos de diálise. Realize a diálise contra um litro de tris 20 milimolar a quatro graus Celsius e pH 8,0. Troque o tampão de diálise duas vezes, com intervalo de quatro horas entre as trocas.Após isso, equilibre uma coluna de sepharose de cinco mililitros com 10 mililitros de tris 20 milimolar. Usando a bomba de amostra, carregue aproximadamente 40 mililitros da solução de S100A12. Colete o fluxo inicial.Em seguida, lave a coluna com tris 20 milimolar. Desenvolva a coluna utilizando um gradiente de 0 a 30% ao longo de 19 volumes de coluna. Colete frações de cinco mililitros.Utilize uma página de eletroforese SDS-PAGE com coloração de coomassie para analisar uma alíquota de 10 microlitros de cada fração. Em seguida, colete as frações contendo S100A12. Usando um dispositivo de ultrafiltração, concentre as frações até cinco mililitros.Após isso, equilibre uma coluna S75 com uma solução de 120 mililitros contendo tris 20 milimolar e cloreto de sódio 100 milimolar. Injete a amostra de cinco mililitros das frações concentradas. Em seguida, elua a coluna a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto ao longo de 120 mililitros.Colete frações de cinco mililitros. Utilizando SDS-PAGE com coloração por comassie, analise uma alíquota de 20 microlitros de cada amostra. Em seguida, valide a identidade da proteína e reúna as frações conforme descrito no protocolo textual.Para começar, plaque H. pylori em caldo de brucela suplementado com colesterol a 1X. Incube durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 250 rpm em atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. Dilua o H. pylori na proporção de 1 para 10 em uma mistura contendo 50% de caldo de brucela e 50% de tampão de calprotectina, acrescidos de colesterol a 1X.E adicione a proteína S100A12 e/ou metais exógenos conforme necessário. Os ensaios antimicrobianos são um ponto crítico. É importante usar o tampão de calprotectina para garantir a estabilidade dos dímeros de S100A12 e fornecer um meio mineral deficiente em metais para os ensaios de crescimento bacteriológico, de modo que a proteína não seja sobrecarregada por excesso de micronutrientes, que geralmente estão presentes em meios bacteriológicos complexos e ricos.No dia seguinte, dilua as amostras em série. Em seguida, plaque em placas de ágar sangue. Deixe as colônias bacterianas crescerem por dois a três dias a 37 graus Celsius em ar suplementado com 5% de dióxido de carbono.Após isso, calcule o crescimento bacteriano conforme descrito no protocolo textual. Neste estudo, apresenta-se um método refinado para expressar e purificar a S100A12 em sua configuração ativa de ligação a metais. O processo de purificação em três etapas começa com uma precipitação por sulfato de amônio de proteínas endógenas de E.coli, seguida por cromatografia de troca iônica aniônica.Após o rastreamento da proteína por meio de uma eletroforese SDS-PAGE com azul de comassie brilhante. As frações contendo S100A12 são coletadas para cromatografia de exclusão por tamanho. S100A12 é um homodímero com 92 aminoácidos por subunidade e possui um peso molecular total de aproximadamente 21 quilodaltons.A atividade antimicrobiana da S100A12 é então investigada por meio de técnicas quantitativas de cultivo microbiológico. A enumeração de células bacterianas revela que a exposição a 100 microgramas por mililitro de S100A12, na presença ou ausência de uma fonte exógena de zinco como nutriente, não inibiu significativamente a viabilidade bacteriana. No entanto, a exposição a 1.000 microgramas por mililitro de S100A12 em meio exclusivo resulta em uma redução de 69 vezes na viabilidade bacteriana.A adição de uma fonte exógena de zinco como nutriente reverte esse resultado, demonstrando que a atividade antimicrobiana da S100A12 depende de sua atividade de sequestro de zinco. Uma vez dominada, a expressão e purificação da proteína pode ser realizada em três a quatro dias, se for feita corretamente. Após esse procedimento, outros métodos, como espectrometria de massas com acoplamento indutivo, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais.Como o sequestro de metais restringe o crescimento microbiano? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de microbiologia explorarem a imunidade nutricional de H. pylori. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar, purificar e quantificar a atividade da proteína antimicrobiana S100A12.Não se esqueça de que trabalhar com H. pylori pode ser extremamente perigoso. E precauções, como trabalhar em um espaço certificado BS2, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. As implicações desta técnica estendem-se às doenças gástricas, incluindo úlcera, gastrite e carcinoma anexial invasivo.Ao compreendermos esses processos, estaremos melhor preparados para desenvolver moléculas antimicrobianas inovadoras que visem esses processos. Embora este método possa fornecer informações sobre a bioquímica das proteínas da família S100A, ele também pode ser aplicado ao estudo de seu papel na sinalização imunológica e em diversos processos de doenças, como câncer, artrite e doenças infecciosas.

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos uma técnica de cromatografia de troca aniônica para purificar a proteína de ligação ao cálcio humano S100A12 com base na carga superficial líquida da proteína de uma cultura de Escherichia coli.

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de troca aniônica: uma técnica de separação para isolar uma proteína de interesse do lisado bacteriano dialisado com base na carga líquida

Este vídeo demonstra um ensaio para investigar a citotoxicidade de proteínas produzidas por Staphylococcus aureus, uma bactéria patogênica, em leucócitos polimorfonucleares humanos isolados (PMNs). As proteínas citotóxicas secretadas formam poros na membrana celular do PMN, iniciando a morte celular. Ao corar as células mortas usando iodeto de propídio, a citometria de fluxo é realizada para quantificar as células mortas e avaliar a citotoxicidade das bactérias.

Um ensaio para citotoxicidade mediada por proteínas extracelulares bacterianas em PMNs

A preparação de extractos de células de alta qualidade de levedura é um primeiro passo necessário para a análise de proteínas individuais ou proteomas inteiros. Aqui nós descrevemos um protocolo de homogeneização rápido, eficiente e confiável para as células de levedura de brotamento que foi otimizado para preservar as funções da proteína, interações e modificações pós-traducionais.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Aqui, é descrito um método que utiliza um sistema de infecção baseada inserção membrana permeável para estudar os efeitos de estreptolisina S, uma toxina segregada produzida por Streptococcus do grupo A, em queratinócitos. Este sistema pode ser facilmente aplicado ao estudo de outras proteínas bacterianas segregadas em diferentes tipos de células hospedeiras durante a infecção.

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

O protocolo apresenta o Escherichia coli-baseado pressão seletiva incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) a lactococcal peptídeo antimicrobiano nisina. Suas propriedades podem ser alteradas durante a expressão recombinantes através de substituição com ncAAs desejado em meios de crescimento definido. As alterações resultantes na Bioatividade são mapeadas por ensaios de inibição de crescimento e de microscopia de fluorescência.

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

MALT1 regula a imunidade inata, mas como isso ocorre permanece indefinida. Usamos o inibidor seletivo de paracaspase MALT1 MIT-827 para desvendar a contribuição da MALT1 para sinalização inata, a jusante dos receptores Toll-like ou tipo C do tipo lectina, demonstrando que MALT1 regula a produção de citocinas mieloides e a jusante dos receptores do tipo lectina do tipo C, seletivamente.

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

Sua marca purificação, diálise e ativação são empregadas para aumentar os rendimentos da expressão proteica de domínio catalítico de matriz solúvel-3 em bactérias. As frações proteicas são analisadas através de géis SDS-PAGE.

Expressão bacteriana e purificação da matriz humana Metaloproteinase-3 usando cromatografia de afinidade

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Aprenda a expressão e purificação do peptídeo antimicrobiano S100A12 para estudos de atividade contra H. pylori. Este protocolo otimizado fornece altos rendimentos de dímero estável para pesquisas em microbiologia.

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

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