Name: A In Vitro Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprenda a usar a diálise de equilíbrio rápida (RED) para medir a ligação de fármacos ao caseum de lesões tuberculosas. Este método prediz a penetração de antimicrobianos sem modelos animais.

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Desejamos agradecer à Johnson &amp; Johnson, à TB Alliance, à Astra Zeneca, à Rib-X e à Trius Therapeutics pela prestação de bedaquilina, PA-824 (pré-tonsanida), AZD5847, radezolid e tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner forneceram suporte com análise MALDI, métodos bioanalíticos, preparação do substituto caseu, síntese química e isolamento de caseum de coelho. Este trabalho foi realizado com financiamento da Fundação Bill e Melinda Gates, o prêmio # OPP1044966 e OPP1024050 para V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, bem como o financiamento conjunto da Fundação Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust para um Centro de Excelência Para Lead Optimization para Doenças do Mundo em Desenvolvimento a P. Wyatt.

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos os estudos envolvendo o M. tuberculosis foram realizados num laboratório com nível de segurança biológica de contenção 3 (BSL-3). Modelo Infecção 1. Coelho e Coleção caseum <ol><li> Infect de coelhos Nova Zelândia brancos com M. tuberculosis usando um sistema de exposição de aerossóis só de nariz, como descrito anteriormente. 12, 13 permitir que a infecção progride para 12-16 semanas. Sedar os coelhos com 35 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por via intramuscular, sacrificar os coelhos, com 0,22 ml / kg de pentobarbital de sódio por via intravenosa e a fenitoína de sódio e prosseguir com as necropsias. </li><li> Usando pinças e um bisturi, remove pulmões do ca peitoVidade. A partir de cada lobo pulmonar, dissecar cavidades individuais e grandes granulomas necróticos usando um bisturi. Cuidadosamente raspar fora caseu da cavidade e granuloma paredes. Pesar, gravar e armazenar amostras em tubos de 2 mL com tampa roscada a -20 ° C até que esteja pronto para uso. </li><li> Irradia-se as amostras de caseu infecciosas a 3 MegaRad em gelo seco para torná-las não infecciosas e seguras para utilização num laboratório BSL-2. </li></ol> 2. Geração In Vitro de Substituto Caseum de células THP-1 <ol><li> Crescer monócitos THP-1 em meio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino a 10%) em frascos de cultura de células T175 (80 mL / balão). Incubar os frascos numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 ° C durante 3-4 dias. </li><li> Centrifugar a cultura de um balão T175 em dois tubos cônicos de 50 mL a 150 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante e suspender o sedimento em 10 mL de meio RPMI 1640. </li><li> Pipetar 5 μL desta cultura em um tubo de 1,5 mL contendo 45 μL de tazul rypan. Mistura-se cuidadosamente por pipetagem. Transferir 10 uL para um hemocitómetro e contar o número de monócitos THP-1 viáveis ​​(sem corante), utilizando um microscópio óptico (ampliação de 10X). Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura. Diluir com meio RPMI para a densidade final de 1,25 x 10 6 culas / mL. </li><li> Carregar 40 ml da cultura em uma placa de cultura de células grandes (50 x 10 6 culas / placa). Adicionar 40 uL de 100 uM de PMA (forbol 12-myristate13-etilo preparado em etanol) e permitir que as células a aderir durante a noite na incubadora. NOTA: A concentração final de PMA é de 100 nm. </li><li> Dilui-se o ácido puro oleico (OA) (0,89 g / mL) em etanol para a concentração de 0,1 M (ou seja 31,7 mL de OA em 968,3 mL de etanol). Dilui-se esta solução em meio fresco RPMI pré-aquecido a uma concentração de 10 mM. Dilui-se esta suspensão de OA a 0,4 mM (concentração final de trabalho), em meio RPMI pré-aquecido a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia e não existentesDas células de cultura de células e adicionar suavemente 40 mL de OA 0,4 mM aos macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C na incubadora durante a noite. </li><li> Use um microscópio de luz com uma ampliação de 40x para confirmar visualmente a presença de numerosas inclusões de corpo lipídico em cada THP-M. Remover todo o meio RPMI das placas de cultura de células e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pipeta serológica de 50 mL. NOTA: Os corpos lipídicos aparecem como estruturas esféricas pequenas e claras no citoplasma do THP-M. </li><li> Adicionar 40 mL de ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA) em PBS a cada placa. Incubar durante 15 min a 37 ° C. </li><li> Desmonte os macrófagos espumosos (FM) pipetando repetidamente para cima e para baixo sobre a superfície da placa inteira usando uma pipeta serológica de 10 mL. Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e girar para baixo a 150 xg por 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 10 mL de PBS (terceira lavagem com PBS) aNd de transferência para um pré-pesados ​​15 mL mL tubos cônicos. Girar novamente para 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e descartar. </li><li> Submeter as pastilhas de FM a 3 ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células e incubá-las a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturar as proteínas na matriz. Armazenar os grânulos a -20 ° C até estar pronto para uso. </li></ol> 3. Ensaio de Diálise de Equilíbrio Rápido (RED) <ol><li> Preparar soluções-mãe 10 mM de todos os compostos de teste em dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a soluções de trabalho de 500 μM em DMSO antes de cada ensaio. </li><li> Pesar o tubo contendo a pastilha substituta de caseu. Subtrair o peso do tubo vazio para derivar o peso do grânulo sozinho. Adicionar 2-3 esferas metálicas por tubo e, utilizando um homogeneizador de tecidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, interromper o caseu ou a matriz substituta em PBS (1: 9 p / v) para se obter a suspensão diluída 10x de cada matriz. </li><li> Spike 6,5 μL dos 500ΜM do composto de teste em 643,5 μL de homogeneizado para se obter a concentração final de 5 μM (≤ 1% de DMSO) e vórtex. </li><li> Coloque as inserções VERMELHAS na placa de base. Adicionar 200 μL da matriz droga-cravada na câmara doadora (anel vermelho) de cada inserto VERMELHO e 350 μL de PBS em cada câmara receptora. Preparar 3 insertos para cada composto de teste (amostras em triplicado). Selar a placa com um vedante de placa adesiva e incubar a 37 ° C no termomixador a 200 rpm (1 xg) durante 4 h. </li><li> Após a incubação, misturar suavemente o conteúdo das câmaras doador e receptor por pipetagem para cima e para baixo 2-3 vezes. Pipetar para fora alíquotas de 20 μL de homogeneizado das câmaras de dador e adicionar 20 μL de PBS limpo num tubo de 1,5 mL (1: 1). Do mesmo modo, pipetar para fora alíquotas de 20 μL de amostras de PBS das câmaras receptoras e adicionar 20 μL de homogeneizado limpo (correspondência de matriz). 8 NOTA: A correspondência de matriz elimina aEd para 2 curvas de calibração separadas (em homogeneizado e PBS) a serem feitas para análise quantitativa. O conteúdo da câmara doadora pode sedimentar ao longo do tempo. Misture suavemente o conteúdo por pipetagem antes de remover as alíquotas. </li></ol> 4. Quantificação de LC-MS e Análise de Dados <ol><li> Adicionar 160 μL de metanol: acetonitrilo 1: 1 contendo diclofenac 500 ng / mL ou verapamil 10 ng / mL (padrão interno) a cada tubo e vortex para precipitar as proteínas. Centrifugar a 10 000 xg durante 5 min para sedimentar o precipitado e transferir os sobrenadantes para placas de poço profundo de 96 poços para análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LCMS). 7 </li><li> Construir curvas de calibração de 1-1000 nM para cada composto de teste, mantendo a mesma composição de matriz que as amostras acima. Quantificar a concentração do composto de teste em amostras das câmaras doadora e receptora utilizando um método LC-MS. </li><li> Calcular a fracção não ligada ( f u ) oF o fármaco em matriz diluída usando a equação 1. Calcule o f u em matriz não diluída usando a equação 2 ( D = fator de diluição de 10). 14 <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Verificar a recuperação (balanço de massa) de cada composto utilizando a equação 3 para identificar compostos com estabilidade / metabolismo / questões de ligação não específicas. NOTA: Recuperação normalmente cai entre 70% e 130%. 15 <img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
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</ol>

Não existem interesses financeiros concorrentes.

Lesões necróticas pulmonares e cavidades em pacientes infectados com tuberculose contêm subpopulações de bactérias que são recalcitrantes ao tratamento medicamentoso. Os núcleos caseosos destas estruturas são particularmente responsáveis ​​por abrigar estes persisters em um ambiente extracelular. Acredita-se que uma distribuição favorável de agentes anti-bacterianos nestes locais remotos seja um determinante importante da eficácia do fármaco contra a tuberculose. Antes da validação deste protocolo, não havia técnicas <e...

O tratamento da doença pulmonar tuberculosa requer distribuição eficaz de fármacos em diferentes tipos de lesões. As lesões necróticas e as cavidades contêm centros caseosos que abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a drogas ou &quot;persistentes&quot;. 1 , 2 A doença cavitária está associada a taxas de cura inferiores e mau prognóstico. 3 , 4 Estudos anteriores mostraram, usando técnicas quantitativas e de imagem, que a capacidade de penetrar o caseu varia significativamente de uma classe de droga para outra. 5 , 6 Estes métodos, no entanto, exigem o uso de modelos de infecção animal que são lentos e tediosos. Foi concebido um ensaio in vitro que mede a ligação do fármaco ao caseu ex vivo . Verificou-se que esta ligação estava inversamente correlacionada com a penetração do fármaco em granulomas caseosos e, por conseguinte, éusado como uma ferramenta de previsão. 7 Diálise de equilíbrio é considerado como o método padrão de ouro para estudos de ligação de proteína de plasma. O dispositivo rápido equilíbrio de diálise (VERMELHO) proporciona um sistema rápido, fácil de usar e fiáveis ​​para a realização de tais ensaios. 8 O dispositivo é constituído por dois componentes: de utilização única, descartáveis que consistem inserções de 2 câmaras separadas por um cilindro vertical de membrana semi-permeável; e placas de base reutilizáveis ​​que pode armazenar até 48 inserções de cada vez. A membrana de diise tem um 8 kDa de peso molecular de corte (MWCO) que é ideal para estudos de ligação a drogas macromolécula. A razão de área para volume elevada superfície do compartimento da membrana de diálise permite uma rápida e equilibração. Ambos os insertos e a placa de base foram validados para o mínimo de ligação não específica. A combinação do dispositivo VERMELHO com técnicas bioanalíticas fornece estimativas precisas sobre as fracções não ligadas de medicamentos em pLasma 8 , 9 Embora originalmente concebido para medir a ligação às proteínas plasmáticas, o dispositivo RED foi utilizado em vários estudos de ligação de tecidos utilizando homogeneizados. 10 , 11 Neste protocolo, medimos a ligação do fármaco ao caseu, os detritos necróticos excisados ​​das lesões necróticas e cavidades de coelhos infectados com tuberculose. A natureza acelular e não vascular do material caseoso facilita a homogeneização numa suspensão homogénea que é compatível com o ensaio. Dado que o caseu é tedioso para produzir e difícil de encontrar, o protocolo também foi validado para uso com uma matriz substituta que é preparada a partir de macrófagos espumosos. Os macrófagos derivados de monócitos THP-1 são induzidos com ácido oleico para acumular múltiplos corpos lipídicos que lhes conferem a sua aparência &quot;espumosa&quot;. Estas células carregadas de lípidos são colhidas eProcessado para produzir uma matriz que usamos como um substituto de caseu. Este estudo mostrou que a ligação do fármaco a esta matriz substituta se correlaciona bem com a ligação ao caseu, imitando eficazmente o processo in vivo que impede a penetração do fármaco no núcleo caseoso de granulomas e cavidades.

<table><tbody><tr><td>Coelhos brancos da Nova Zelândia</td><td></td> Covance-HN878 <td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cetatesia (Cetamina) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xilazina) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Saúde Animal</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sódico e fenitoína sódica) Solução&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>linha celular monocítica THP-1</td><td>ATCC ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; Cantil Tratado com TC (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mídia sem glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Irradiado por Gama&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamina, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>prato Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventilado</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico&nbsp;</td><td>Placa</td> Base Reutilizável <td>do Dispositivo Fisher Scientific ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de Dispositivo Pierce RED, 50/caixa&nbsp;</td>Ferramenta de remoção de inserto <td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Vedação de placa adesiva</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Verapamil</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Sal de diclofenaco de sódio</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano, 0,4%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 provas</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Acessório de Homogeneizador de Moinho de Contas, Contas de Metal a Granel</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalto 60 Irradiador</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; Hemacitômetros descartáveis C-Chip</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz vertical</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografia líquida binária</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa</td> multicompenente <td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

a<em&gt; in vitro</em&gt; caseum ensaio de ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose lesões

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A erradicação da tuberculose requer regimes medicamentosos que possam penetrar as múltiplas camadas de lesões pulmonares complexas. A distribuição de fármacos nos núcleos caseosos de cavidades e lesões é especialmente crucial porque abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a fármacos também vulgarmente referidas como persisters. Os métodos existentes para a medição da penetração de fármaco em lesões de tuberculose envolvem costosos e demorados estudos farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas ou de imagem. A medida in vitro da ligação do fármaco às macromoléculas de caseu foi proposta como uma alternativa a essas técnicas, uma vez que esta ligação dificulta a difusão passiva de moléculas de fármaco através do caseu. A diálise de equilíbrio rápido é um sistema rápido e confiável para realizar estudos de ligação a proteínas plasmáticas e tecidos. Neste protocolo, usamos um dispositivo de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco a homogenatos de caseu que é excised das lesões e as cavidades de coelhos infectados com tuberculose. O protocolo também descreve como gerar uma matriz de substituição de lípido carregado THP-1 macrófagos para usar em lugar de caseum. Este ensaio de ligação caseum / substituto é uma ferramenta importante na descoberta de drogas tuberculose e pode ser adaptado para ajudar o estudo da distribuição de drogas em lesões ou abcessos causados ​​por outras doenças.

Usando este protocolo, testámos centenas de compostos de desenvolvimento de tuberculose para a sua eficiência previsto no penetrante caseum. A Figura 1 visualiza os conceitos básicos do ensaio VERMELHO. A membrana de diálise das inserções VERMELHOS permite para pequenas moléculas não ligadas a difundir a partir do dador bem ao receptor bem como, finalmente, atingir um equilíbrio entre os dois compartimentos. As pequenas moléculas que são ligadas a macromoléculas, tais co...

Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

O objetivo geral deste protocolo é prever a ligação de fármacos ao caseum proveniente de lesões tuberculosas. Este método pode auxiliar na determinação da eficácia com que os antimicrobianos penetram no núcleo caseoso de lesões necróticas, sem a necessidade de modelos animais ou técnicas de imagem caras. Embora este método possa fornecer informações relevantes para a descoberta direta de tratamentos contra a tuberculose, ele também pode ser aplicado a outras doenças caracterizadas pela formação de lesões ou abscessos onde a penetração do fármaco é limitada.A demonstração visual deste método é essencial, pois a consistência na execução do protocolo garantirá a reprodutibilidade dos dados entre experimentos. Hoje, demonstrarei o procedimento de cultura celular e o preparo da matriz substituta. Hsin-pin, um pesquisador associado do nosso laboratório, demonstrará o ensaio correto.Cultive monócitos THP-1 em frascos de cultura celular T-175 contendo 80 mL de meio RPMI 1640, com 2 milimolar de l-glutamina e 10 por cento de soro bovino fetal. Incube os frascos a 37 graus Celsius com cinco por cento de dióxido de carbono por três a quatro dias. Quando as células atingirem cerca de 70 por cento de confluência, divida-as em dois tubos cónicos de 50 mL e centrifugue-as a 150 vezes g durante cinco minutos.Após a centrifugação, despreze o sobrenadante e suspenda o palato em 10 mL de meio RPMI 1640. Pipete cinco microlitros dessa cultura em um tubo de 1,5 mL contendo 45 microlitros de azul de tripano. Misture bem por meio de pipetagem.Transfira 10 microlitros para um hemocitômetro. E, utilizando um microscópio óptico com aumento de 10x, conte o número de monócitos viáveis THP-1. Após determinar o número de células viáveis por mililitro do cultivo, dilua-o com meio RPMI até uma densidade final de 1,25 vezes 10 à 6ª potência de células por mililitro.Adicione 40 microlitros de PMA 100 micromolar ao tubo. Em seguida, transfira a cultura para uma placa de cultivo celular de 140 vezes 20 milímetros. Deixe as células aderirem durante a noite no incubador.Em seguida, dilua o ácido ilíaco puro em etanol até uma concentração de 0,1 molar. Aqui, 31,7 microlitros de ácido ilíaco são dissolvidos em 968,3 microlitros de etanol. Dilua a solução em meio RPMI fresco e pré-aquecido até uma concentração de 10 milimolar.Dilua a suspensão de ácido ilíaco até uma concentração final de trabalho de 0,4 milimolar em meio RPMI previamente aquecido a 37 graus Celsius. A diluição do ácido ilíaco em meio RPMI pré-aquecido é essencial para garantir a dissolução adequada do ácido graxo em solução aquosa. Usando uma pipeta, remova o meio existente e as células não aderidas da placa de cultura celular contendo macrófagos THP-1 e adicione cuidadosamente 40 mL de ácido ilíaco 0,1 milimolar.Incubar a 37 graus Celsius na estufa durante a noite. No dia seguinte, utilize um microscópio óptico com aumento de 40x para confirmar visualmente a presença de numerosas inclusões de corpúsculos lipídicos em macrófagos THP. Os corpúsculos lipídicos aparecem como estruturas pequenas, claras e esféricas no citoplasma.Remova todo o meio RPMI da placa de cultura celular e lave suavemente as células aderentes duas vezes com PBS, utilizando uma pipeta serológica de 50 mL. Adicione 40 mL de EDTA 5 milimolar em PBS à placa. Incube por 15 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, para destacar os macrófagos espumosos, utilize uma pipeta serológica de 10 mL e pipete repetidamente para cima e para baixo sobre toda a superfície da placa. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL. E centrifugue a 150 × g durante cinco minutos.Após a centrifugação, re-suspenda o pellet celular em 10 mL de PBS e transfira para um tubo cônico de 15 mL previamente pesado. Centrifugue novamente a 150 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e descarte-o.Sujeite as paletas de macrófagos espumosos a três ciclos de congelamento e descongelamento. Alterne entre gelo seco e incubação a 37 graus Celsius em um bloco térmico para lisar as células. Em seguida, incube-as a 75 graus Celsius por 20 a 30 minutos para desnaturar as proteínas na matriz.Armazene as paletas a menos 20 graus Celsius até o momento em que forem necessárias. Os dispositivos de equilíbrio rápido, ou ensaio RED mostrado nesta seção do vídeo, podem ser realizados usando ou a matriz substituta que acabamos de preparar ou o casoína proveniente de lesões de coelhos infectados com TB. Aqui, mostraremos o ensaio conforme realizado na matriz substituta.Prepare soluções estoque de 10 milimolares de todos os compostos em teste. Aqui, a moxifloxacina é preparada em DMSO. Dilua até soluções de trabalho de 500 micromolares em DMSO antes de cada ensaio.Pese o tubo contendo o queijo excisado ou a matriz substituta. Subtraia o peso do tubo vazio para obter o peso do queijo ou da matriz substituta isoladamente. Adicione de dois a três grânulos metálicos por tubo e, em seguida, adicione PBS numa proporção de um para nove, peso por volume. Usando um vórtex, desintegre o queijo ou a matriz substituta por um minuto.Adicione 6,5 microlitros do composto-teste preparado a 643,5 microlitros do homogenato. Para atingir a concentração final de cinco micromolar, agite em vórtex. Em seguida, coloque os insertos vermelhos na placa-base.Prepare os insertos para cada teste, cada composto em triplicata. Adicione 200 microlitros da matriz com droga adicionada à câmara doadora vermelha de cada inserto vermelho. Em seguida, adicione 350 microlitros de PBS em cada câmara receptora.Cole um selo adesivo na placa e incube-a a 37 graus Celsius no misturador térmico a 200 rotações por minuto durante quatro horas. Após a incubação, misture suavemente o conteúdo das câmaras doadoras e receptoras pipetando para cima e para baixo duas a três vezes. Transfira 20 microlitros de homogenato de cada uma das câmaras doadoras para 20 microlitros de PBS novo em um tubo de 1,5 mL.Da mesma forma, transfira alíquotas de 20 microlitros de amostras de PBS das câmaras receptoras para 20 microlitros de homogeneado limpo. A correspondência de matriz elimina a necessidade de elaborar duas curvas de visão de cores separadas, uma para homogeneado e outra para PBS, a serem usadas na análise quantitativa. O conteúdo das câmaras doadoras forma sedimento ao longo do tempo.Misture suavemente o conteúdo por pipetagem antes de retirar alíquotas. Adicione 160 microlitros de uma mistura metanol em proporção um para um com acetonitrila, contendo 500 nanogramas por mililitro de diclofenaco ou 10 nanogramas por mililitro de verapamila a cada tubo como padrão interno. Vortexe para precipitar as proteínas.Centrifugue a 10000 x g durante cinco minutos para sedimentar o precipitado e, em seguida, transfira os sobrenadantes para placas de poços profundos de 96 poços para análise por espectrometria de massa com cromatografia líquida, LCMS. Construa curvas de calibração de um a 1000 nanomolares para cada composto em teste mediante diluições da solução estoque do composto, mantendo a mesma composição da matriz das amostras. Quantifique a concentração do composto em teste nas amostras das câmaras doadoras e receptoras utilizando um método de LCMS.Calcule a fração não ligada, ou fu, do fármaco e da matriz diluída, utilizando a equação um mostrada aqui. Em seguida, calcule a fu na matriz não diluída utilizando a equação dois, onde D é igual a um fator de diluição de 10. Por fim, verifique a recuperação ou balanço de massa de cada composto utilizando a equação três mostrada aqui.Para identificar compostos com problemas de estabilidade, metabolismo ou ligação inespecífica. Observe que a recuperação geralmente varia entre 70 por cento e 130 por cento. O protocolo descrito neste vídeo tem sido utilizado para testar centenas de compostos em desenvolvimento para tuberculose quanto à sua eficiência prevista na penetração no caseum.A membrana de diálise dos insertos vermelhos permite que moléculas pequenas não ligadas difundam do poço doador para o poço receptor, alcançando finalmente um equilíbrio entre ambos os compartimentos. Moléculas pequenas ligadas a macromoléculas, como proteínas ou lipídios, permanecem retidas no poço doador. A análise quantitativa das amostras de ambos os compartimentos permite o cálculo da fração não ligada, fu, de cada molécula pequena na matriz de cerume ou substituta, conforme mostrado aqui.Quanto maior a fu, mais extensamente a droga se difunde no caseoso. A espectrometria de massas com ionização por dessorção a laser assistida por matriz, ou MALDI, foi realizada para seis drogas. Mapas iônicos de lesões pulmonares representativas são mostrados aqui, onde a intensidade do sinal é indicada pela barra de escala à esquerda.A coloração com hematoxilina e ESN ou HNE de cortes adjacentes é mostrada abaixo deles. As linhas de contorno em preto e branco destacam o centro caseoso de cada lesão. Esses dados são consistentes com a hipótese de que as moléculas do fármaco difundem-se para a região externa do caseo a partir de sua interface com as camadas celulares da lesão.A ligação a macromoléculas caseosas sequestra a droga, impedindo sua difusão adicional para o interior do núcleo caseoso. Como mostrado aqui, a matriz preparada a partir de macrófagos espumosos derivados de THP-1 é um substituto eficaz do verdadeiro caseum. A ligação em ambas as matrizes apresenta forte correlação entre si.Após este procedimento, diversos compostos podem ser testados simultaneamente para economizar tempo e recursos. Chamamos isso de teste em cassete. Desde o seu desenvolvimento, este ensaio tem sido utilizado por diversos programas de otimização de compostos líderes na descoberta de fármacos contra a tuberculose.Não se esqueça de que trabalhar com microbactérias e espécimes de tecido infectado por tuberculose pode ser extremamente perigoso, e um protocolo validado de esterilização de tecidos, utilizando radiação gama, deve ser usado antes do manuseio de amostras de revestimento infectadas em um laboratório BSL2. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Sarathy, J. P. et al. Um ensaio de ligação de caseum in vitro que prevê a penetração de drogas em lesões de tuberculose. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para medir a ligação do fármaco ao caseum de lesões de tuberculose usando diálise de equilíbrio rápido. Ele descreve as etapas para preparar suspensões de caseum, realizar diálise e calcular a fração de medicamento não ligada para prever a penetração do medicamento no caseum.

Medindo a ligação do medicamento ao caseum de lesões de tuberculose por meio do método de diálise de equilíbrio rápido

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia de medicamentos contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  É gerado um modelo de infecção in vitro contendo agregados de Mtb/macrófagos que mimetiza a infecção in vivo. Após a introdução de antibióticos adequados, sua eficácia é testada por meio do ensaio de resuzarina para monitorar a sobrevivência das bactérias com o aumento das concentrações de drogas.

Um ensaio para avaliar a eficácia do medicamento contra um modelo de infecção por Mycobacterium tuberculosis

Aqui, descrevemos um ensaio fenotípico aplicável às telas de alto rendimento/alto conteúdo de pequenas interfissões de RNA sintético (siRNA), composto químico e bibliotecas mutantes mycobacterium tuberculosis. Este método baseia-se na detecção de Mycobacterium tuberculosis rotulado fluorescentemente dentro de célula hospedeira fluorescente rotulada usando microscopia confocal automatizada.

Um ensaio fenotípico microscópico para quantificação de micobactérias intracelulares adaptadas para triagem de alto rendimento/alto conteúdo

O charcoal agar resazurin assay (CARA) é um método semiquantitativo de médio rendimento para avaliar a atividade de agentes de teste contra micobactérias que são replicantes, não replicantes ou ambas.  O CARA permite uma avaliação rápida da atividade dependente do tempo e da concentração e identifica os parâmetros a serem seguidos pelos ensaios de unidade formadora de colônias (UFC).

Visualização do carvão Agar resazurina Ensaio para a semi-quantitativa, médio rendimento enumeração de micobactérias

Nós desenvolvemos um sistema de rastreio de alto rendimento modular para descobrir novos compostos contra o Mycobacterium tuberculosis, direccionamento intracelular e em caldo de crescimento de bactérias, bem como a citotoxicidade contra a célula hospedeira de mamífero.

Sistema de Eficácia e citotoxicidade Rastreio de inibidores Segmentação intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Este estudo desenvolveu um ensaio para triagem de alto rendimento contra Mycobacterium abscessus com uma cepa repórter dupla recém-criada, usando fluorescência e luminescência para avaliar a viabilidade bacteriana rapidamente. Este protocolo será relevante para pesquisadores que pretendem rastrear novos medicamentos contra essa bactéria resistente a medicamentos.

Desenvolvimento de ensaio para triagem de medicamentos de alto rendimento contra micobactérias

Aqui, apresentamos um protocolo para identificar potenciais candidatos a medicamentos antituberculosos por meio de triagem fenotípica, abrangendo a síntese química de um composto de 4-aminoquinolina, a determinação de sua concentração inibitória mínima contra Mycobacterium tuberculosis e a avaliação de sua citotoxicidade em linhagens celulares de mamíferos.

Identificação de Potenciais Candidatos Anti-TB: Um Guia Passo a Passo para Síntese, Determinação de CMI e Avaliação de Citotoxicidade em Células de Mamíferos

Este artigo descreve o procedimento para a formação e visualização de um biofilme bacteriano cresceu dentro de uma câmara de corrediça de 8...

In vitro a formação de biofilme em um slide Câmara de 8 poços

Aprenda a usar a diálise de equilíbrio rápida (RED) para medir a ligação de fármacos ao caseum de lesões tuberculosas. Este método prediz a penetração de antimicrobianos sem modelos animais.

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