preparação e In Vitro Caracterização de magnetizado miR-modificado Células Endoteliais

O objetivo geral deste procedimento é introduzir uma técnica que garanta a modificação celular com microRNA e em magnetização celular paralela. Este método pode enfrentar os principais desafios no campo da medicina regenerativa. Como a engenharia genética de células antes do transplante.

Além da modificação celular eficiente com microRNA, eles permitiram isso com óxido de ferro. Isso pode ser usado para aumentar a retenção celular no lado de interesse pela aplicação de campo magnético. A terapia celular é muito promissora para o tratamento de doenças cardíacas, retenção de hipocélulas e sobrevivência celular precisa ser aprimorada com urgência.

Inicie este procedimento com cultura de células endoteliais da veia umbilical humana em preparação de complexos de transfecção conforme descrito no protocolo de texto. 48 horas antes da transfecção, semeie os HUVECs em placas de poços de cultura de células plásticas de tamanho adequado. Com uma densidade celular inicial de aproximadamente 13.000 células por centímetro quadrado de superfície de crescimento.

Em seguida, prepare nanopartículas frescas de miR / polietileno / óxido de ferro super paramagnético. Primeiro, diluir 2,5 picomoles de microRNA por centímetro quadrado de superfície de crescimento celular e cinco por cento de solução de glicose para obter uma concentração final de 0,125 picomoles de microRNA por microlitro. Em seguida, dilua o PEI em um volume igual de solução de glicose a cinco por cento.

Adicione o PEI diluído à solução de microRNA e vortex a mistura obtida por 30 segundos. Em seguida, incube a mistura miR / PEI por 30 minutos em temperatura ambiente. Sonicar os MNPs por pelo menos 20 minutos no banho-maria sonicante em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione a quantidade apropriada de solução de MNP à mistura miR / PEI pronta. Após o vórtice por 30 segundos, incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura miR / PEI / MNP preparada gota a gota diretamente no meio de cultura nas células.

Substitua esta mistura por meio de cultura fresco seis horas após a transfecção. Após a análise da segurança do vetor conforme descrito no protocolo de texto, confirmar e caracterizar a localização intracelular dos complexos de transfecção por microscopia de iluminação estruturada confocal e de super-resolução. Para fazer isso, semeie os HUVECs em lamínulas de vidro revestidas de gelatina colocadas nos poços de placas de cultura de 24 poços como antes.

Transfecte as células com miR / PEI / MNP marcado com 3 cores e incube por 24 horas a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono. Lave as lamínulas primeiro com dois por cento de albumina de soro bovino e solução salina tamponada com fosfato e, em seguida, apenas com PBS. Fixe as células incubando em quatro por cento de paraformaldeído ou PFA a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Lave com PBS e depois core os núcleos com DAPI seguindo os protocolos padrão. Em seguida, lave as células com PBS três vezes 15 minutos no shaker para remover o excesso de corante. Coloque as lamínulas preparadas nas lâminas do microscópio usando um meio de montagem adequado e deixe as lâminas secarem por pelo menos uma hora antes de usá-las para microscopia.

Adquira imagens usando uma objetiva de imersão em óleo 63 vezes nas configurações do SIM encontradas no protocolo de texto. Para direcionamento de células e condições dinâmicas simuladas in vitro, primeiro transfecte os HUVECs em uma placa de 24 poços como antes. Depois de incubá-los por 24 horas, lave as células.

Em seguida, adicione uma x viagens em EDTA diluído em PBS e incube as células por quatro minutos a 37 graus Celsius antes de coletar as células. Centrifugue as células coletadas a 300 vezes G por 10 minutos. Misturar o sedimento celular obtido de um alvéolo com um mililitro de meio de cultura fresco.

E transfira as células para um único poço de uma placa de 12 poços. Fixe um pequeno ímã localmente usando fita adesiva. Colocar a placa de cultura no agitador e incubar a suspensão celular durante 12 horas a 150 RPM para simular condições dinâmicas.

Em seguida, lave as células e fixe-as usando quatro por cento de PFA. Corar os núcleos com DAPI. Registre a fixação da célula usando microscopia confocal de varredura a laser com lasers de excitação de 405 e 504 nanômetros no modo z-stack para obter os dados brutos.

Use o processamento de imagem de projeção de intensidade máxima para criar imagens para análise. Para análise quantitativa de células magneticamente responsivas e não responsivas, primeiro transfecte os HUVECs em uma placa de 24 poços. Incube as células por 24 horas antes de lavar e coletar as células conforme descrito anteriormente.

Ressuspenda o pellet de células obtido de cada poço com 500 microlitros de tampão de classificação de células estéreis aquecido. Aplique a suspensão da célula a uma coluna de classificação magnética fixada pelo ímã fornecido. Em seguida, lave as colunas do ímã três vezes com um novo tampão de classificação de células.

Colete o fluxo como a fração magneticamente insensível. Remova as colunas do ímã e colete imediatamente a fração de célula magneticamente responsiva empurrando o buffer de classificação de células fresco através da coluna usando um êmbolo. Centrifugar as fracções Mag- e Mag++, a 300 vezes G, durante 10 minutos.

Depois de ressuspender o pellet celular em PBS, conte as células e avalie a viabilidade celular com um ensaio de exclusão de azul de tripano. Isoladas dos cordões umbilicais, as HUVECs são caracterizadas pela expressão do marcador endotelial CD31 e pela formação de tubos em uma matriz de membrana basal. HUVECs transfectados com miR / PEI / MNP todos absorvem miR marcado.

E sua sobrevivência permanece inalterada 24 horas após a transfecção. Além disso, a microscopia de super-resolução mostra a localização paranuclear de complexos de transfecção marcados em 3 cores. A toxicidade da PEI é confirmada pela diminuição da funcionalidade das células transfectadas miR / PEI.

É importante ressaltar que o MNP restaura as propriedades celulares. As células modificadas com miR / PEI / MNP não diferem das células não tratadas em termos de formação de tubos. Além disso, essas células mantêm a comunicação intercelular da junção gap revelada pela recuperação de fluorescência após o fotobranqueamento.

Uma vez que uma suspensão de células modificadas com miR / PEI / MNP é semeada nos poços de uma placa de cultura colocada no agitador rotativo, as células tendem a migrar e se fixar na área de aplicação do ímã local. Imagens representativas mostram o crescimento celular na área com aplicação de ímã. Sem aplicação de ímã.

E no centro do poço de cultura, onde o fluxo de líquido estava concentrando as células. Uma vez dominada, a transfecção celular pode ser realizada em duas horas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma impressão muito boa sobre como modificar as células endoteliais de forma transitória, mas altamente eficiente, incluindo a magnetização.

E também como caracterizar terminalmente o produto celular. Ao tentar este procedimento, é importante seguir os números fornecidos para quantidades de componentes de semeadura celular para a preparação de complexos de transfecção, tempo de incubação e a etapa de lavagem após a transfecção. Estamos muito otimistas de que essa abordagem será bem transferível para outros tipos de células para o tratamento de outros órgãos afetados.

Após este procedimento, estudos in vivo com células magnetizadas modificadas podem ser realizados. Eles poderiam responder a perguntas adicionais se o carregamento de ferro das células é eficiente para garantir sua retenção no lado de interesse. E também para definir os limites de detecção com ressonância magnética in vivo.