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O objetivo geral deste procedimento é apresentar uma técnica que garanta a modificação celular com microRNA e, paralelamente, a magnetização celular. Este método pode abordar desafios fundamentais no campo da medicina regenerativa, como a engenharia genética de células antes do transplante.

Além da modificação eficiente das células com microRNA, eles permitiram também com óxido de ferro. Isso pode ser utilizado para aumentar a retenção celular no local de interesse mediante aplicação de campo magnético. A terapia celular é muito promissora para o tratamento de doenças cardíacas, porém a baixa retenção celular e a sobrevivência das células precisam urgentemente ser aprimoradas.

Inicie este procedimento com o cultivo de células endoteliais de veia umbilical humana em preparação para os complexos de transfeção, conforme descrito no protocolo textual. 48 horas antes da transfeção, semeie as HUVECs em placas de poços de cultura celular de plástico de tamanho apropriado. Com uma densidade inicial de aproximadamente 13.000 células por centímetro quadrado de superfície de crescimento.

Em seguida, prepare nanopartículas frescas de microRNA/polietilenimina/óxido de ferro superparamagnético. Primeiro, dilua 2,5 picomoles de microRNA por centímetro quadrado de superfície de crescimento celular e solução de glicose a cinco por cento para obter uma concentração final de 0,125 picomoles de microRNA por microlitro. Em seguida, dilua a PEI em volume igual de solução de glicose a cinco por cento.

Adicione o PEI diluído à solução de microRNA e vortexe a mistura obtida por 30 segundos. Incube, então, a mistura de miR/PEI por 30 minutos à temperatura ambiente. Sonique as MNP's por pelo menos 20 minutos no banho ultrassônico à temperatura ambiente.

Em seguida, adicione a quantidade apropriada de solução de MNP à mistura pronta de miR/PEI. Após agitar em vórtex por 30 segundos, incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione gota a gota a mistura preparada de miR/PEI/MNP diretamente ao meio de cultura sobre as células.

Substitua essa mistura por meio de cultura fresco seis horas após a transfeção. Após a análise da segurança do vetor conforme descrito no protocolo do texto, confirme e caracterize a localização intracelular dos complexos de transfeção por microscopia confocal e microscopia de iluminação estruturada de super-resolução. Para tanto, semeie as HUVECs em lamínulas de vidro recobertas com gelatina colocadas nos poços de placas de cultura de 24 poços, como anteriormente.

Transfete as células com miR/PEI/MNP marcado com três cores e incube por 24 horas a 37 graus Celsius em atmosfera umidificada contendo cinco por cento de dióxido de carbono. Lave as lamínulas primeiro com albumina sérica bovina a dois por cento e solução salina tamponada com fosfato, e depois apenas com PBS. Fixe as células incubando em paraformaldeído a quatro por cento ou PFA a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Lave com PBS e, em seguida, cora os núcleos com DAPI seguindo protocolos padrão. Depois, lave as células com PBS três vezes por 15 minutos em agitador para remover o corante em excesso. Coloque as lamínulas preparadas sobre lâminas de microscopia utilizando um meio de montagem apropriado e deixe as lâminas secarem por pelo menos uma hora antes de utilizá-las para microscopia.

Adquira imagens utilizando um objetivo de imersão a óleo de 63 vezes nas configurações de SIM descritas no protocolo textual. Para direcionamento celular e condições dinâmicas simuladas in vitro, transfete primeiro as HUVECs em uma placa de 24 poços como anteriormente. Após incubá-las por 24 horas, lave as células.

Em seguida, adicione uma lavagem com tripsina em EDTA diluída em PBS e incube as células por quatro minutos a 37 graus Celsius antes de coletá-las. Centrifugue as células coletadas a 300 × g por 10 minutos. Misture o pellet celular obtido de um poço com um mililitro de meio de cultura fresco.

E transfira as células para um único poço de uma placa de 12 poços. Fixe um ímã pequeno localmente usando fita adesiva. Coloque a placa de cultura sobre o agitador e incube a suspensão celular por 12 horas a 150 RPM para simular condições dinâmicas.

Em seguida, lave as células e fixe-as usando PFA a quatro por cento. Incube os núcleos com DAPI. Registre a adesão celular utilizando microscopia confocal de varredura a laser com lasers de excitação de 405 e 504 nanômetros no modo z-stack para obter os dados brutos.

Utilize o processamento de imagens por projeção de intensidade máxima para criar imagens para análise. Para análise quantitativa de células magneticamente responsivas e não responsivas, primeiro transfete as HUVECs em uma placa de 24 poços. Incube as células por 24 horas antes de lavar e coletar as células conforme descrito anteriormente.

Re-suspenda o pellet celular obtido de cada poço com 500 microlitros de tampão estéril aquecido para separação celular. Aplique a suspensão celular em uma coluna de separação magnética fixada pelo ímã fornecido. Em seguida, lave as colunas no ímã três vezes com tampão fresco para separação celular.

Colete o fluxo inicial como a fração magneticamente não responsiva. Remova as colunas do ímã e colete imediatamente a fração de células magneticamente responsiva, empurrando novo tampão de separação celular pela coluna usando um êmbolo. Centrifugue ambas as frações Mag– e Mag+ a 300 vezes G durante 10 minutos.

Após a re-suspensão do pellet celular em PBS, conte as células e avalie a viabilidade celular por meio do ensaio de exclusão de azul de tripano. Isoladas de cordões umbilicais, as HUVECs são caracterizadas pela expressão do marcador endotelial CD31 e pela formação de tubos em uma matriz de membrana basal. As HUVECs transfectadas com miR/PEI/MNP incorporam todas o miR marcado.

E sua sobrevivência permanece inalterada 24 horas após a transfeção. Além disso, a microscopia de super-resolução mostra a localização paranuclear de complexos de transfeção marcados com três cores. A toxicidade da PEI é confirmada pela funcionalidade reduzida das células transfectadas com miR/PEI.

É importante destacar que o MNP restaura as propriedades celulares. Células modificadas com miR/PEI/MNP não diferem de células não tratadas em termos de formação de tubos. Além disso, essas células mantêm a comunicação por junções gap intercelulares, conforme revelado pela recuperação da fluorescência após foto-branqueamento.

Uma vez que uma suspensão de células modificadas com miR/PEI/MNP é semada nos poços de uma placa de cultura colocada sobre o agitador rotativo, as células tendem a migrar e aderir à área de aplicação local do ímã. Imagens representativas mostram o crescimento celular na região com aplicação do ímã. Sem aplicação do ímã.

E no centro do poço de cultura, onde o fluxo do líquido estava concentrando as células. Uma vez dominada, a transfeção celular pode ser realizada em duas horas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa noção de como modificar de forma transitória, mas altamente eficiente, células endoteliais, incluindo a magnetização.

E também como caracterizar terminalmente o produto celular. Ao tentar este procedimento, é importante seguir os valores indicados para as quantidades de células e componentes na preparação dos complexos de transfeção, tempo de incubação e etapa de lavagem após a transfeção. Temos grande otimismo de que esta abordagem possa ser facilmente transferida para outros tipos celulares para o tratamento de outros órgãos afetados.

Após este procedimento, podem ser realizados estudos in vivo com células magnetizadas modificadas. Eles poderiam responder a questões adicionais sobre se o carregamento de ferro nas células é eficiente para garantir sua retenção no lado de interesse. E também para definir os limites de detecção com ressonância magnética in vivo.