Name: -Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a avaliar a suscetibilidade de vírus influenza A e B a inibidores de neuraminidase usando ensaio baseado em fluorescência. Este método robusto determina resistência ou sensibilidade antiviral por meio de valores de IC50.

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O Melbourne OMS Centro de Referência e Pesquisa sobre Influenza A colaboração é apoiada pelo Departamento de Governo Australiano de Saúde.

1. Determinar a faixa linear de Fluorescent Produto 4-MU em um Fluorometer <ol><li> Preparar 10 ml de solução 6,4 mM de estoque 4-MU por dissolução de 11,3 mg de 4-MU em 5 mL de etanol absoluto. Adiciona-se 5 mL de NaCl a 0,9% (w / v) à solução de estoque para perfazer 10 mL. Preparar uma solução de trabalho 640 uM por diluição de 1 mL de 6,4 mM de 4-MU em 9 mL de 1x tampão de ensaio (33,3 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanossulf único (MES) e 4 mM de CaCl2, pH 6,5). NOTA: Prepara-se o tampão de ensaio pela adição de 2x 13 g de MES e 8 ml de 1 M CaCl 2-992 mL de água destilada. Ajustar o pH para 6,5 ​​por meio de 10 M de NaOH. Filtra-se o tampão através de um filtro de acetato de celulose esterilizado de tamanho de poros de 0,2 um. Cuidado! O hidróxido de sódio é cáustico e pode causar queimaduras químicas na pele e olhos. Garantir que o equipamento de protecção individual completo é gasto. </li><li> Preparar 5 ml de uma gama de concentrações de 4-MU (isto é, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 &amp; #181; M e 320? M) através de uma diluição em série de duas vezes de 640 uM 4-MU utilizando tamp de ensaio 1x. </li><li> Dispensar 50? L de cada diluio em sie de 4-MU (isto é, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM e 640 uM) (dois poços por diluição) em uma solução límpida, 96- bem placa de fundo plano e 50 uL de tampão de ensaio 1x nas cavidades restantes (que servem como peças em bruto para medir sinais de fundo). NOTA: As concentrações finais de 4-MU no volume de reacção (50 ul 4-MU + 50 uL de 300 uM Muñana) é 2,5 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM e 320 uM . </li><li> Prepara-se uma solução de estoque 2,5 mM MUNANA através da reconstituição de 25 mg de Muñana em 20 ml de água destilada. Misture 0,72 mL de Muñana 2,5 mM com 5,28 mL de 1x tampão de ensaio para se obter uma solução de trabalho (volume suficiente para uma placa) 300 uM Muñana. Cobrir o tubo contendo o Muñana Trabalhando 300 uMg de solução com folha de alumínio e mantê-lo em gelo a menos que utilizado imediatamente. Descarte todos os materiais que sobraram. NOTA: A solução de estoque 2,5 mM MUNANA pode ser armazenado a -20 ° C durante 1 mês e deve ser usada dentro de um ciclo de congelamento / descongelamento. Os 4-MU soluções e Muñana são sensíveis à luz e deve ser protegido contra a exposição à luz prolongada. </li><li> Adicionar 50 uL de 300 uM Muñana a cada poço, bata levemente para misturar e incubar a 37 ° C durante 30 min. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação. NOTA: Este passo é para ter em conta a fluorescência de fundo no ensaio de inibição de NA. </li><li> Preparar a solução de paragem através da mistura de 11 mL de etanol absoluto com 2,225 mL de NaOH 0,824 M (volume suficiente para uma placa). </li><li> Adicionar 100 uL de solução de paragem a cada poço para parar a reacção e bata suavemente para misturar. </li><li> Ler a placa utilizando um fluoretro com um ajuste de comprimento de onda de excitação de 355 nm e um ajuste do comprimento de onda de emissão de 460 nm, como per as instruções do fabricante. </li><li> Calcule a média do sinal de fundo usando sinais de fluorescência a partir de todos os poços não contendo 4-MU. Subtrair este sinal média de fundo de cada uma das cavidades contendo 4-MU e calcular os sinais médios (RFU) para cada concentração de 4-MU. Traça-se a curva padrão de RFU em função da concentração de 4-MU (M), como se mostra na Figura 1a; uma secção linear estreita-se da curva é mostrado na Figura 1b. </li><li> Visualizar a trama de RFU contra 4-MU concentração (uM) para determinar a gama linear e o sinal de alvo ideal; o intervalo linear é onde o sinal de fluorescência aumenta na proporção do aumento das concentrações de o 4-MU no terreno, enquanto o sinal de alvo ideal é uma concentração arbitrária 4-MU dentro da gama linear. NOTA: O intervalo linear e o sinal de alvo ideal são específicos do fluorómetro. Por exemplo, o fluorímetro no Melbourne WHOCCRRI tem uma gama linear de dois0,5-40 uM 4-MU e um sinal de alvo óptima de ~ 30? M de 4-MU, o que corresponde a ~ 1500 RFU. </li></ol> 2. Determinação da Actividade de NA dos vírus NOTA: Os vírus da gripe são cultivadas a títulos suficientes no rim Madin-Darby Canine (MDCK) ou ovos de galinha embrionados 8. <ol><li> Dispensar 120 uL por poço de vírus influenza em cultura não diluídos em coluna 1 e 60? L de tamp de ensaio 1x contendo 0,1% de NP-40 para os restantes 11 colunas de um 96 poços, a placa de fundo em U. </li><li> Serialmente executar diluição de duas vezes dos vírus ao longo da placa (isto é, a transferência de 60 uL da coluna 1 para a coluna 2 e assim por diante, até a coluna 11) utilizando uma pipeta multicanal, deixando coluna 12 como um branco contendo tampão de ensaio única 1x. </li><li> Transferir 50 uL de cada um dos poços (vírus diluído em branco) em uma de 96 cavidades, placa clara, de fundo plano. NOTA: Não é necessário cpontas de pipeta hange se materiais são transferidos de coluna através de 12 para a coluna 1. </li><li> Adicionar 50 uL de 300 uM Muñana (preparado de acordo com o passo 1.4) por poço e bata levemente a placa para misturar. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação. </li><li> Adicionar 100 uL de solução de paragem (preparado de acordo com o passo 1.6) por poço para terminar a reacção e bata levemente a placa para misturar. </li><li> Leia a placa usando um fluorímetro. <ol><li> Usar uma configuração de comprimento de onda de excitação de 355 nm e um ajuste do comprimento de onda de emissão de 460 nm. </li></ol></li><li> Determinar o sinal de média de fundo com base nas leituras de fluorescência em coluna 12 e subtrair o sinal de média de fundo de cada poço. Traçar um gráfico da RFU contra diluições de vírus. NOTA: Os valores de fundo para 100 Muñana uM no WHOCCRRI Melbourne estão tipicamente entre 50 e 120 RFU, mas estes irão diferir dependendo da bei fluorómetrong utilizado. </li><li> Ver a trama de RFU contra diluições de vírus para determinar o ponto médio da secção linear da curva para cada vírus (Figura 2). Usar o sinal de alvo óptima (determinado no passo 1) como ponto de referência. NOTA: Este deve corresponder com a gama linear de 4-MU do fluorómetro determinado na secção 1 e vai proporcionar a concentração apropriada de vírus para ser utilizado na secção 3. </li></ol> 3. avaliar a susceptibilidade do vírus para NA NA Inibidores Utilizando o Ensaio de Inibição <ol><li> Preparar stocks mestres de inibidores de NA em concentrações de 300 uM. <ol><li> Preparar 300 uM zanamivir (peso molecular, PM = 332,32 g / mol) por dissolução de 5,0 mg de zanamivir em 50 mL de 2x tampão de ensaio (MES 66,6 mM e 8 mM de CaCl2, pH 6,5). </li><li> Preparar 300 uM de oseltamivir carboxilato (D-tartarato; PM = 386,44 g / mol) por dissolução de 5,8 mg em 50 mL de tampão de ensaio 2x. </li><li> Preparar300 uM peramivir tri-hidrato de (PM = 382,45 g / mol) por dissolução de 5,7 mg em 50 mL de tampão de ensaio 2x. </li><li> Preparar 300 uM laninamivir (PM = 346,34 g / mol) por dissolução de 5,2 mg em 50 mL de tampão de ensaio 2x. NOTA: Os stocks mestres inibidor de NA podem ser armazenadas a -20 ° C durante 12 meses. Verificar o PM dos inibidores de NA para garantir os pesos e volumes correctos são utilizados na reconstituição. O carboxilato de oseltamivir é o composto activo do pró-fármaco fosfato de oseltamivir. Portanto, apenas o carboxilato de oseltamivir deve ser utilizado no ensaio de inibição de NA. </li></ol></li><li> A partir dos stocks mestres, preparar stocks de dez diluições em série de inibidores de NA em 50 tubos de centrífuga mL trabalhando em concentrações de 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM e 30.000 nM no ensaio 2x tampão MES (66,6 mM e 8 mM de CaCl2, pH 6,5); isto é para utilização em vários ensaios. NOTA: As concentrações finais dos inibidores de NA na reacção volume (50 ul de diluição de vírus + 50 uL de inibidor de NA + 50 uL de 300 uM Muñana) são de 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM e 10.000 nM, respectivamente. A concentração final não inclui os 100 pL de solução de paragem. Armazenar todos os inibidores de diluições de NA a 2-8 ° C. O prazo de validade é a mesma que a dos stocks mestre. </li><li> Preparar as diluies de vus em tamp de ensaio 1x contendo 0,1% de NP-40 surfactante num bloco de 96 poços profundos. A utilização de diluições de vírus com base nos resultados do ensaio de actividade de NA derivados da secção 2. Utilizar um volume total de 2 mL por vírus a testar quatro inibidores de NA. NOTA: Preparar duas cavidades (1 mL por poço) por vírus em um bloco de 96 poços profundos. Exemplos de diluições de vírus para o vírus 1, 2, e 3 são mostrados na Tabela 1. </li><li> Dispensar o volume necessário de inibidores de NA (preparados de acordo com o passo 3.2) em um reservatório 8 de poços profundos. A partir daí, dispensar 50? L de inibidores de NA em diluições que variaram entre 0 nM (2x ensaio bpode ser prejudicado apenas) a 30.000 nM em filas A a H em um de 96 poços, a placa de clara, de fundo plano. NOTA: A disposição da placa está ilustrado na Figura 3. </li><li> Adicionar 50 ul de vírus diluído de teste por poço para colunas 1-11 e 50 por po de tamp de ensaio 1x apenas para a coluna 12. Bater levemente a placa para misturar e incubar à temperatura ambiente durante 45 min. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação. </li><li> Adicionar 50 uL de 300 uM Muñana (preparado de acordo com o passo 1.4) por poço e bata levemente a placa para misturar. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. Cobrir a placa com um selante de placas para evitar a evaporação. </li><li> Adicionar 100 uL de solução de paragem (preparado de acordo com o passo 1.6) a cada poço e bata levemente a placa para misturar. </li><li> Leia a placa usando um fluorímetro. <ol><li> Usar um comprimento de onda de excitação de 355 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm, como descrito anteriormente. </li></ol></li></ol> 4. Cálculo doOs valores de IC50 NOTA: O v1.2 JASPR é o software de ajuste de curva, que permite o cálculo de valores de IC50. O software foi desenvolvido pela Divisão de Influenza do CDC, Atlanta, EUA. O software utiliza a equação: V = V max x (1 - ([I] / (K i + [I]))), em que Vmax é a taxa máxima de metabolismo, [I] é a concentração de inibidor, V seja a resposta a ser inibida, e Ki é a IC50 para a curva de inibição. <ol><li> Copiar e colar os dados brutos produzidos pela fluorómetro para uma folha de cálculo em um formato de placa de 12-coluna (de 96 poços), começando com a célula A1. NOTA: Raw dados de cada placa posterior deve ser escalonada por um linha vazia. Se cada um dos vírus foi testada contra os quatro inibidores de NA, colar os dados brutos em um conjunto de quatro (com uma linha vazia entre cada placa). </li><li> Abra o software de adaptação e click na guia &quot;Experiment&quot;. Escolha &quot;Alternativa 2-droga Fluoro 11 amostras.&quot; </li><li> Clique na aba &quot;Opções&quot; e marque &quot;gerar gráficos.&quot; </li><li> Clique em &quot;Opções&quot; novamente e clique na aba &quot;New Key&quot;. Salve o &quot;inhibition_key&quot; arquivo .csv na mesma pasta que o arquivo de planilha de dados brutos. </li><li> No arquivo inhibition_key, listar todos os nomes de amostra abaixo da ID. Cada nome da amostra deve ser exclusivo. </li><li> Se quatro inibidores de NA foram testados, inserir espaços para duas fileiras adicionais abaixo oseltamivir e digitar &quot;Peramivir&quot; e &quot;laninamivir.&quot; Salve as alterações feitas no arquivo inhibition_key. </li><li> Voltar ao &quot;jaspr v 1.2-A inibição ajuste de curva&quot; janela e selecione o arquivo de dados brutos como o &quot;Arquivo Experiment&quot; e inhibition_key como o &quot;Arquivo Key.&quot; Executar a análise. Salve os resultados em formatos .csv e .pdf. NOTA: O software irá traçar automaticamente uma curva de inibição (RFU açaínst NA concentrações de inibidor), como mostrado na Figura 4. O programa também calcula os valores de IC50 para cada um dos vírus contra um indivíduo NA inibidor (Figura 4). Além disso, JASPR apresenta os valores de IC 50 e o fundo de sinal-para-(S / B) proporção em formato de folha de cálculo. Os valores de fundo podem diferir de laboratório para laboratório, dependendo do fluorímetro usado. No Melbourne WHOCCRRI, o fundo valores para a gama Muñana 100 uM 50-120 RFU. Para um valor confiável IC50, é preferida uma razão de S / B de ≥10, embora uma proporção de menos do que 10 ainda é aceitável, em especial para os vírus mutantes que têm uma actividade muito baixa de NA. </li><li> Inspeccionar os valores de IC 50 e as formas de curvas geradas pelo software. Todos os pontos de dados deve cair sobre ou perto da curva; se não o fizerem, repetir o ensaio de inibição NA. NOTA: Para vírus que mostram anormalmente elevados valores de IC 50, o ensaio deve ser de repetiçãoed para confirmar o resultado. </li></ol>

<ol><li>Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+inhibitors+for+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22N.Engl.J.Med%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase inhibitors for influenza.</a> N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).</li>
<li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19132915">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).</li>
<li>Meijer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).</li>
<li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).</li>
<li>Lackenby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistance+to+oseltamivir+among+influenza+A%28H1N1%29+viruses+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe.</a> Euro Surveill. 13 (5), (2008).</li>
<li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+transmission+of+oseltamivir-resistant+A%28H1N1%29pdm09+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza.</a> N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).</li>
<li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+large+cluster+of+influenza+A%28H1N1%29pdm09+viruses+cross-resistant+to+oseltamivir+and+peramivir+during+the+2013-2014+influenza+season+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).</li>
<li>Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+isolation%2C+culture+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus isolation, culture and identification.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meetings+of+the+WHO+working+group+on+surveillance+of+influenza+antiviral+susceptibility+-+Geneva%2C+November+2011+and+June+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly+Epidemiol+Rec%22%5BJournal%5D)">Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012.</a> Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).</li>
<li>A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1">http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1</a> (2016).</li>
<li>Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemiluminescent+neuraminidase+inhibition+assay%3A+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).</li>
<li>Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+neuraminidase+inhibition+assay%3A+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).</li>
<li>Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data">https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data</a> (2016).</li>
<li>Sleeman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R292K+substitution+and+drug+susceptibility+of+influenza+A%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses.</a> Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+and+framework+mutations+in+the+neuraminidase+active+site+of+influenza+viruses+that+are+resistant+to+4-guanidino-Neu5Ac2en%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en.</a> J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A vigilância global de susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA está actualmente a ser realizado por uma série de laboratórios usando ou fluorescentes ou quimioluminescentes inibição NA ensaios 11, 12. O ensaio fluorescente é mais comummente usado do que o ensaio quimioluminescente. Embora ambos os ensaios são robustos e reprodutível, os valores de IC 50 obtidos a partir do ensaio baseado em fluorescência são frequentemente mais elevados do que o ensaio baseado em quimioluminescência, fazendo uma comparação directa dos dados provenientes dos dois ensaios difíceis 13. Mesmo com o uso do mesmo protocolo, os dados gerados a partir de um laboratório pode variar a partir de uma outra. Devido a estas variações entre laboratórios, o Grupo de Trabalho OMS na vigilância da gripe Susceptibilidade Antiviral produzido um guia para auxiliar na comparações entre laboratórios. Em vez de comparar os valores absolutos de IC50, este uso orientaçãosa comparação com base na diferença de dobragem de IC 50 para a mediana de IC 50 dos vírus influenza NI testados em cada um laboratório particular. A possibilidade de comparar os dados a partir dos cinco centros colaboradores resultou na publicação anual mundial de influenza dados antivirais susceptibilidade 2, 3, 4. A disponibilidade de grande quantidade de dados influenza susceptibilidade no domínio público permite aos pesquisadores comparar IC50 dados desses estudos com que gerou em seus próprios laboratórios. Outros ensaios de inibição de NA que adoptam um conceito semelhante também estão comercialmente disponíveis. Estes kits comerciais que contêm reagentes prontos-a-usar (NA não inibidores incluídos) são igualmente reprodutível. No entanto, a casa no ensaio de inibição do NA é substancialmente mais barato do que os kits comerciais, porque a maioria dos reagentes pode ser feita em casa emquantidades maiores e o substrato Muñana, que anteriormente se fez o maior custo do ensaio, pode agora ser adquirido a partir de várias fontes, a preços competitivos. O custo de testar um isolado de influenza por droga é de aproximadamente $ 1 (USD). No Melbourne WHOCCRRI, as melhorias têm sido feitas para o ensaio de inibição in-house NA após a incorporação de uma plataforma robótica para os componentes de processamento de líquidos de ensaio. Para além da preparação manual das diluições de vírus, a maioria dos procedimentos são realizados usando o robô de manipulação de líquidos. Não só este minimizar o manuseio manual, mas também aumenta o número de ensaios que podem ser executados em um dia. Embora o ensaio de inibição do NA é muito robusto, há uma série de passos críticos que precisam ser completado com cuidado adicional. Em primeiro lugar, qualquer irregularidade nas concentrações do inibidor da NA se possam deslocar as curvas de inibição e os valores de IC 50; portanto, uma atenção especial deve serpago ao preparar as concentrações de inibidor de NA. Em segundo lugar, os períodos de incubação de pipetagem e precisos exactos são cruciais para manter resultados consistentes em ensaios; isto pode ser conseguido usando pipetas e temporizadores calibrados. A inclusão de vírus de controlo em cada ensaio também permite a monitorização do desempenho do ensaio de ensaio para ensaio e durante longos períodos de tempo. Em terceiro lugar, porque a actividade da enzima de NA do vírus da gripe sazonal é óptima a pH 6,5, o pH correcto do tampão de ensaio é importante. Alguns relatórios descobriram que a utilização de condições mais baixos de pH pode melhora a identificação de variantes de influenza, tais como a variante A (H7N9) contendo a mutação R292K 14, 15. No entanto, a modificação do pH do tampão de ensaio vai deslocar os valores de IC 50, e isto pode complicar a comparação de dados dentro de laboratórios e entre laboratórios. Outras modificações e solução de problemas que podem ser performed estão listados na Tabela 5. Os inibidores de NA são a única classe de medicamentos antivirais aprovados que são actualmente eficaz contra o vírus de influenza circulantes. Até outras classes antivirais tornam-se disponíveis para uso clínico, a vigilância da susceptibilidade antiviral de circulação de vírus da gripe será focada em inibidores de NA sozinho. Por causa da simplicidade e reprodutibilidade dos resultados, o uso do ensaio de inibição de NA para avaliar a susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA continuará.

A hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) são os dois principais glicoproteínas de superfície de vírus influenza A e B. HA liga-se ao ácido siálico-galactose de glicoproteínas da superfície celular ou glicolípidos, ao passo que o NA liberta vírus por clivagem do ácido siálico da galactose na superfície da célula 1. Os inibidores de NA são uma classe de antivirais da gripe que foram racionalmente desenhados para se ligarem firmemente ao local activo NA enzimática, impedindo assim a libertação e dispersão de descendência do vírus. Oseltamivir e zanamivir são dois inibidores de NA que tenham sido aprovados em muitos países do mundo para o tratamento e profilaxia da gripe. Nos últimos anos, dois inibidores adicionais de NA, peramivir e laninamivir, foram aprovados para uso em um número limitado de países. Triagem dos vírus da gripe para a susceptibilidade a inibidores de NA e a identificação de mutações que conferem resistência são importantes para determinar e monitorizar a effectiveness desta classe de medicamentos antivirais. Nos últimos 16 anos, o ensaio de inibição do NA-base de fluorescência foi realizada rotineiramente na OMS para Referência e Pesquisa sobre Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) para monitorar a tendência de mudança de susceptibilidade antiviral entre circulante vírus da gripe. Anualmente, mais de 2.000 vírus da gripe são testados para a susceptibilidade antiviral. Na maior parte das estações de influenza,&gt; 98% dos vírus são sensíveis a todos os quatro inibidores de NA 2, 3, 4, embora durante a temporada de gripe norte hemisfério 2007-2008, houve um aumento no número de ex vírus sazonais A (H1N1) que tinha susceptibilidade reduzida a oseltamivir 5. Este grupo de vírus, o qual continha o H275Y substituição de aminoácidos de NA, se espalhar para o resto do mundo pelo final de 2008, fazendo com que o oseltamivir inappropricomeu globalmente para o tratamento do vírus. A grande maioria dos circulando influenza B, influenza A (H3N2), e vírus influenza A (H1N1) estirpes pdm09 são susceptíveis a oseltamivir, embora aglomerados comunidade de A (H1N1) variantes pdm09 contendo o H275Y substituição de aminoácidos de NA que confere a oseltamivir reduzida e peramivir susceptibilidade, foram relatadas em várias partes do mundo, 6, 7. Devido à necessidade de um tulo suficientemente elevado de vírus, amostras clínicas (incluindo animais lavagens nasais) devem ser passadas em qualquer cultura de células ou ovos embrionados de galinha anteriores para os testes de susceptibilidade antiviral. O ensaio de inibição do NA descrito neste artigo pode ser dividida em três secções: Determinar a gama linear para o produto fluorescente 4-metilumbeliferona (4-MU), em especial um fluorómetro Devido às diferenças inerentes entre fluorómetros, tele gama linear para o produto final fluorescente, 4-MU, e a unidade de fluoresccia relativa (RFU), é necessário estabelecer. Uma vez que o intervalo linear para 4-MU está estabelecida, o sinal de alvo ideal é seleccionado, para o qual a concentração dos vírus influenza é ajustado no ensaio de actividade de NA. Depois de concluído por um fluorímetro particular, este não precisa ser repetido. A determinação da actividade de NA dos vírus O ensaio de actividade de NA é um ensaio simples que envolve a adição do 2 &#39;- (4-metil) -D- -α ácido N-acetilneuramínico (Muñana) substrato de vírus diluído em série. A quantidade de produto final fluorescente 4-MU gerado a partir da clivagem de Muñana pela AN é medido utilizando um fluorómetro. A diluição do vírus adequado para usar no ensaio de inibição do NA é seleccionado através da representação gráfica unidades de fluorescência contra a diluição de vírus. A partir da curva sigmoidal produzido, o ponto médio da secção linear deve corresponder aa gama linear de 4-MU do fluorómetro determinado na secção 1 e irá informar a concentração apropriada de vírus para ser utilizado na secção 3. Avaliar a susceptibilidade do vírus para inibidores de NA, utilizando o ensaio de inibição do NA Para avaliar a susceptibilidade do vírus a um inibidor da NA em particular, vírus na diluição determinado no ponto 2, foram incubados com uma gama de concentrações de inibidor de NA. Após uma incubação subsequente com Muñana, o 4-MU gerado por vírus não inibidas é medido em RFU pelo fluorómetro. O efeito inibidor do inibidor da NA sobre a actividade da enzima de NA de um vírus é calculado de acordo com a concentração do inibidor de NA requerida para reduzir 50% da actividade de NA, dada como um valor de IC 50.

<table><tbody><tr>Vírus <td></td><td>da gripe A e B</td><td>Cultivados em células MDCK ou ovos embrionados de 9 dias de idade livres de patógenos específicos (SPF)</td> Células do rim canino Madin-Darby (MDCK) ATCC PTA-6500 Ácido 2-(4-metilumbelliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MUNANA)&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosynth AG</td><td>M-5507</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MUNANA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8639</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbeliferona (4-MU)</td><td>Sigma</td><td>M1381-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-[N-morfolino]ácido etanossulfônico (hidrato MES) (ácido livre)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio (Ca Cl2)&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem&nbsp;</td><td>Surfactante 127-500G-Amps-NP-40</td><td></td></tr><tr><td>(solução a 10%)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>PIE28324</tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (NaOH)&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>482-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Absoluto&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>214-2.5L GL</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo plano transparente de 96 poços</td><td>NUNC</td><td>456537</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo em U de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;</td><td></td><td></td>4650101</tr><tr><td>bloco de poço profundo de 8 canais</td><td>Pacific Laboratory Products</td><td>RES-MW8-HP</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços profundos, poços quadrados de 2,0 mL Pacific</td><td>Laboratory Products</td><td>P-2ML-SQ-C</td><td></td></tr><tr><td>Selantes de placas</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>236366</tr><tr><td>Sistema de filtro a vácuo de garrafa (membrana de celulose (nitrato), tamanho de poro 0,2 &mu; m, área da membrana 33,2 cm2, capacidade do filtro 500 mL)</td><td>Pipetas monocanal Sigma-Aldrich</td><td>CLS430758-12EA</td><td></td></tr><tr><td>(1 &micro; L - 1.000 &micro; L)</td> <td>Variedade de fornecedores (por exemplo. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas multicanal</td><td>Variedade de fornecedores (por exemplo. Eppendorf, Sartorius)</td> <td>Pipeta eletrônica e manual de 8 ou 12 canais (5 - 1250 &micro; L)</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (1 &micro; L - 1.250 &micro; L)</td> <td>Variedade de fornecedores (por exemplo. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas descartáveis (10 mL e 25 mL)</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;</td><td>P7740-200EA e P7865-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos em rack</td><td>Scientific Specialties, Inc.</td><td>1750-00</td><td></td></tr><tr><td>Fluorômetro com ajuste de comprimento de onda de excitação de 355 nm e um ajuste de comprimento de onda de emissão de 460 nm</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>ASCENT FL 374</td><td></td></tr><tr><td>Software de ascensão</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>5185410CD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada em 37 &deg; C</td><td>Lab Supply</td><td>Biocell 1000</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Solicitação diretamente da empresa</td><td></td></tr><tr><td>Carboxilato de Oseltamivir</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peramivir (BCX-1812)</td><td>BioCryst</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laninamivir (R-125489)</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; JASPR v1.2</td><td>Divisão de Influenza no CDC Atlanta, EUA&nbsp;</td><td>Disponível gratuitamente mediante solicitação (fluantiviral@cdc.gov)</td><td></td></tr></tbody></table>

-fluorescência baseado neuraminidase ensaio de inibição para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza a de neuraminidase inibidor de classe antivirais

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Os neuraminidase (NA) inibidores são a única classe de medicamentos antivirais aprovados para o tratamento e profilaxia da gripe, que são eficazes contra estirpes circulantes. Além de sua utilização no tratamento da gripe sazonal, os inibidores de NA foram armazenadas por um número de países para uso em caso de uma pandemia. Por conseguinte, é importante controlar a susceptibilidade de circulação de vírus da gripe para esta classe de medicamentos antivirais. Existem diferentes tipos de ensaios que podem ser utilizados para avaliar a susceptibilidade dos vírus da gripe para os inibidores de NA, mas os ensaios de inibição da enzima utilizando quer um substrato fluorescente ou um substrato quimioluminescente são as mais amplamente utilizadas e recomendadas. Este protocolo descreve a utilização de um ensaio baseado em fluorescência para avaliar a susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA. O ensaio baseia-se na clivagem do enzima de NA 2 &#39;- (4-Metilumbeliferil) -α-D- ácido acetilneuramínico N (Muñana) Substrato para libertar o produto fluorescente 4-metilumbeliferona (4-MU). Por conseguinte, o efeito inibidor de um inibidor da NA do vírus da gripe NA é determinado com base na concentração do inibidor de NA, que é necessária para reduzir 50% da actividade de NA, dada como um valor de IC 50.

Usando as diretrizes para relatórios padronizados do grupo de trabalho da OMS para vigilância da gripe Susceptibilidade Antiviral 9, a susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA são reportadas usando as condições inibição normal (NI), a inibição reduzida (RI), e inibição altamente reduzida (HRI) . NI vírus são aqueles com valores de IC 50 inferior a 10 vezes em comparação com a referência mediano de IC 50 para os vírus da gripe A (ou menos do que cinco vezes a presença de vírus da gripe B). RI vírus são aqueles com valores de IC50 entre 10 e 100 vezes acima da mediana de referência de IC 50 para os vírus da gripe A (ou 5- e 50-vezes superior para influenza B). HRI vírus são aqueles com valores de IC50 de 100 vezes acima da mediana de referência de IC 50 para os vírus influenza A (ou acima de 50 vezes para o vírus da gripe B); ver Tabela 2. 50 para A (H1N1) pdm09, A (H3N2) e vírus B Yamagata / B Victoria são calculados e atualizados anualmente no Melbourne WHOCCRRI para refletir pequenas alterações nos valores IC 50 de circulantes estirpes de gripe para os inibidores de NA (Tabela 3). Os valores de IC50 médios em vírus influenza A (H1N1) virus pdm09 são quase o mesmo entre os quatro inibidores de NA, mas o zanamivir mediana e laninamivir valores de IC50 para os vírus A (H3N2) são de 2 a 4 vezes mais elevada em comparação com o oseltamivir e peramivir valores de IC 50 (Tabela 3). O oseltamivir mediana valor de IC 50 para os vírus da gripe B é geralmente de 5 a 10 vezes maior do que o zanamivir, peramivir, e laninamivir valores de IC 50 (Tabela 3). O ensaio de inibição do NA é um ensaio fenotípico que não fornece informações sobre a alterações assoc genéticaciado a RI ou HRI. Portanto, é importante que a análise genética é realizada de acordo com a identificação de vírus ou com RI HRI. No Melbourne WHOCCRRI, o gene de NA de variantes é analisado utilizando sequenciação de Sanger e piro-sequenciação. Uma lista representativa de substituições de aminoácidos que podem ser encontrados no gene de NA dos vírus variantes com RI e HRI é apresentado na Tabela 4. Uma lista mais completa de substituies de aminoidos que podem alterar a susceptibilidade NAI também está disponível no website da OMS 10. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig1.jpg" /> Figura 1: RFU em função da concentração de 4-MU. (A) Curva Padrão de RFU contra 4-MU concentração (jiM). A caixa a tracejado mostra a gama linear de 4-MU para o fluorómetro. Os sinais de fluorescência acima do intervalo linear pode ser saturado, e, portanto, nenhum sas alterações na fluorescência shopping não pode ser detectado pelo fluorómetro. (B) a secção linear plano da curva padr da Figura 1a para a identificação do &quot;sinal de alvo ideal.&quot; O fluorómetro no Melbourne WHOCCRRI tem uma gama linear de 2,5-40 uM 4-MU e um sinal de alvo óptima de ~ 30? M de 4-MU, o que corresponde a ~ 1500 RFU. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig2.jpg" /> Figura 2: Exemplo das curvas de vírus da gripe de actividade de NA. O valor médio de fundo 50,61 RFU foi subtraída de cada ponto de diluição sobre as curvas de actividade de NA. As setas indicam a diluição de vírus adequado para usar no ensaio de inibição de NA para cada vírus. Para preparação mais fácilaration de diluições de vírus, pode-se escolher para efectuar uma diluição 1/100 para VÍRUS 3 em vez de uma diluição de 1/96. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig3.jpg" /> Figura 3: esquema Placa para a configuração do ensaio de inibição do NA. Cada placa inclui a última coluna, que actua como um controlo negativo que não contém vírus mas tampão de ensaio única 1x (AB), inibidor da NA, Muñana, e solução de paragem. NOTA: JASPR utiliza leituras da coluna 12 de cada uma das placas para determinar o sinal do branco média utilizados no cálculo dos valores de IC 50. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4: Exemplo de uma curva de inibição e o valor de IC 50 de um vírus pdm09 A (H1N1), A / Perth / 82/2015. O software JASPR apresenta a curva de inibição de fluorescência (RFU) contra o aumento da concentração (nM) do inibidor da NA, com cada ponto de ajuste no interior da curva. Com base na curva de inibição, o valor de IC50 é determinado como a concentração de inibidor de NA para reduzir 50% da actividade de NA do vírus. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Vírus </td><td> diluição de vírus necessária </td><td> 1x volume de tampão de ensaio (? L) </td><td> Surfactante-ampères-NP-40 (10%) (ml) </td><td> volume de vírus (mL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1/20 </td><td> 940 </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1/40 </td><td> 965 </td><td> 10 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1/100 </td><td> 890 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Preparação de diluições de vírus para o vírus 1, 2, e 3 no ensaio de inibição de NA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tipo de Vírus / subtipo / linhagem </td><td> inibição normal </td><td> inibição reduzida </td><td> inibição altamente reduzida </td></tr><tr><td> (NI) </td><td> (RI) </td><td> (HRI) </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> &lt;10 dobra </td><td> 10-100 vezes </td><td> &gt; 100 vezes </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> &amp;# 60; 10 dobra </td><td> 10-100 vezes </td><td> &gt; 100 vezes </td></tr><tr><td> B Yamagata e B Victoria </td><td> &lt;5 dobra </td><td> 5-50 dobra </td><td> &gt; 50 dobra </td></tr></tbody></table> Tabela 2: O Grupo de Trabalho Antiviral OMS recomenda orientações para a classificação de susceptibilidade do vírus da gripe para os inibidores de NA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tipo de Vírus / subtipo / linhagem </td><td rowspan="2"> N </td><td> zanamivir </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> laninamivir </td></tr><tr><td> Mediana (gama) IC 50 nM </td><td> Mediana (gama) IC 50 nM </td><td> Mediana (gama) IC 50 nM </td><td> Mediana (gama) IC 50 nM </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1.326 </td><td> 0,42 (0,1-3,43) </td> &lt;td&gt; 0,36 (0,01-3,48) </td><td> 0,19 (0,07-1,60) </td><td> 0,55 (0,05-2,29) </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> 1.654 </td><td> 0,9 (0,11-4,0) </td><td> 0,38 (0,01-3,65) </td><td> 0,33 (0,12-3,06) </td><td> 1,38 (0,01-9,38) </td></tr><tr><td> B Yamagata e B Victoria </td><td> 1.115 </td><td> 2.2 (1,24-10,72) </td><td> 15,12 (2,39-70,75) </td><td> 1,36 (0,57-6,67) </td><td> 2,89 (1,62-9,15) </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Mediana IC50 e IC50 gama de inibição normal (NI) vírus de 2015 derivada no CCRRI OMS, Melbourne. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> substituição de aminoácido </td><td rowspan="2"> Tipo / subtipo / linhagem </td><td colspan="4"> IC 50 dobra-co mudançampared para referenciar medianos valores de IC 50. </td></tr><tr><td> zanamivir </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> laninamivir </td></tr><tr><td> H275Y </td><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1 </td><td> 557 (HRI) </td><td> 123 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> E119V </td><td> A (H3N2) </td><td> 1 </td><td> 63 (RI) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> H134Y </td><td> B Victoria </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 76 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> N151T </td><td> B Victoria </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 42 (HRI) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> G104E </td><td> B Victoria </td><td> 1220 (HRI) </td><td> 87 (HRI) </td><td> 17724 (HRI) </td><td> 701 (HRI) </td></tr><tr><td> E105K </td><td> B Victoria </td><td> 3 </td><td> 5 (RI) </td><td> 59 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> I222T </td><td> B Victoria </td><td> 2 </td><td> 7 (RI) </td><td> 8 (RI) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> H273Y </td><td> B Yamagata </td><td> 1 </td><td> 230 (HRI) </td><td> 377 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> D197N </td><td> B Yamagata </td><td> 4 </td><td> 7 (RI) </td><td> 32 (RI) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Quadro 4: Lista representativa de substituições de aminoácidos ligados à inibição reduzida (RI) ou inibição altamente reduzida (HRI) de inibidores de NA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Razões possíveis) </td><td> Solução (s) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Não ou baixa atividade NA </td><td> Nenhum vírus estava presente ou baixo rendimento do vírus. </td><td> Amostra clínica, devem ser cultivados em linhas de células (isto é, células de rim de Madin-Darby Canine) ou em ovos de galinha embrionadospara uma carga mais elevada de vírus para utilização no ensaio de inibição de NA. </td></tr><tr><td> Alguns vírus mutantes têm extremamente baixa atividade NA apesar de alta carga de vírus. </td><td> Utilizar a concentração do vírus puro para o teste. Pode ser usado tampão de ensaio de pH mais baixo (por exemplo pH 5,3). No entanto, o cuidado deve ser tomado quando se comparam dados. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Baixa ou nenhuma actividade no ensaio de inibição de NA NA </td><td> Nenhum vírus foi adicionado. </td><td> Re-diluir o vírus. Certifique-se de que o vírus é directamente adicionada ao tamp de ensaio 1x. </td></tr><tr><td> foi usada diluição do vírus errado. </td><td> Repetir o ensaio de actividade de NA. </td></tr><tr><td> tempo de incubação insuficiente. </td><td> Assegurar o tempo de incubação é seguida. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Os pontos de dados cair fora da curva IC50 </td><td rowspan="2"> A contaminação cruzada de inibidor da NA de maior concentração. </td><td> Certifique-se de que as pontas não estão em contato com o inhibi NAtor na dispensação de vírus diluído na placa de 96 poços. </td></tr><tr><td> Se foi utilizado um reservatório de 8 poços profundos, descartar e re-administrar o inibidor da NA concentrações em um novo reservatório 8 poços profundos. </td></tr><tr><td> O volume do inibidor de NA ou Muñana ou vírus diluído não foi adicionado igualmente em cada poço. </td><td> Repetir o ensaio com uma pipeta de multi-canal calibrado. Certifique-se de igual volume de cada reagente é distribuído por cada poço. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Invulgarmente elevados valores de IC50 </td><td> Foi adicionado demasiado elevada concentração de vírus. </td><td> Repetir o ensaio de actividade de NA e de NA ensaio de inibição. </td></tr><tr><td> A amostra de teste continham misturas de gripe A e da gripe B. </td><td> Execute-PCR em tempo real para identificar a presença de misturas de vírus. </td></tr><tr><td> A contaminação bacteriana na amostra </td><td> vírus da cultura no estado esterilizado, com a presença de antibiótico. </td></tr><tr><td rowspan="2"> sinal de fluorescência de alta fundo </td><td> substrato Muñana podem degradar ao longo do tempo. </td><td> Use um novo lote de Munana subtrate. </td></tr><tr><td> Detecção de fluorescência de poços vizinhos. </td><td> Use preto placas de 96 poços de fundo plano </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Solução para potenciais problemas no ensaio de inibição do NA.

Descreve-se a utilização de um ensaio de inibição da neuraminidase à base de fluorescência fenotípica para avaliar a susceptibilidade de vírus influenza A e B para a classe dos inibidores da neuraminidase de medicamentos antivirais.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

O objetivo geral desta metodologia é avaliar a suscetibilidade dos vírus influenza A e B aos inibidores da neuraminidase utilizando um ensaio baseado em fluorescência. Este método pode ajudar a determinar se um vírus influenza é resistente ou sensível à classe de antivirais inibidores da neuraminidase. O princípio principal do ensaio é verificar se o antiviral inibidor da neuraminidase bloqueia a atividade da enzima neuraminidase.Antes dos testes de suscetibilidade a antivirais, o vírus deve ser cultivado até atingir uma alta titulação viral por meio de passagens em culturas celulares, como as células MDCK, ou em ovos de galinha embrionados. Nesta demonstração, utilizarei vírus influenza A vivos dos subtipos H1N1 e H3N2. Começando com uma placa de 96 poços com fundo em U, distribua 120 microlitros por poço de vírus influenza cultivados não diluídos na coluna um.E 60 microlitros de tampão de ensaio a uma vez contendo 0,1% de NP40 nas 11 colunas restantes. Usando uma pipeta multicanal, realize seriamente duas diluições completas pela placa, deixando a coluna 12 como branco contendo apenas tampão de ensaio a uma vez. Transfira 50 microlitros de cada poço para uma placa clara de 96 poços com fundo plano.Adicione 50 microlitros de MUNANA 300 micromolar por poço. E bata levemente na placa para misturar. Em seguida, use um selante para placas para cobrir a placa e prevenir evaporação.E incubar a placa a 37 graus Celsius por uma hora. Adicionar 100 microlitros de solução de parada por poço para encerrar a reação. E bater suavemente na placa para misturar.Utilize um fluorímetro para ler a placa. Em seguida, após traçar um gráfico de RFU em função das diluições do vírus de acordo com o protocolo descrito, determine a concentração apropriada de vírus para avaliar a suscetibilidade viral aos inibidores da NA, utilizando o sinal alvo ótimo como ponto de referência, a fim de selecionar o ponto médio da seção linear das curvas de atividade da NA viral. Para preparar 300 micromoles em amivir, dissolva cinco miligramas de zanamivir em 50 mililitros de tampão de ensaio duas vezes concentrado.Prepare 300 micromolar de oseltamivir carboxilato dissolvendo 5,8 miligramas de oseltamivir carboxilato em 50 mililitros de tampão de ensaio duas vezes. Dissolva 5,7 miligramas de peramivir tri-hidratado em 50 mililitros de tampão de ensaio duas vezes para obter uma concentração estoque de 300 micromolar. Em seguida, prepare 300 micromolar de laninamivir dissolvendo 5,2 miligramas em 50 mililitros de tampão de ensaio duas vezes.A partir dos estoques-mestre, prepare estoques de trabalho com diluições em dez vezes dos inibidores de NA em tubos de centrífuga de 50 mililitros com as seguintes concentrações. É necessário ter atenção ao preparar a série de concentrações dos inibidores de NA. Qualquer irregularidade nas concentrações dos inibidores de NA será evidente nas curvas de inibição.Usando diluições do vírus com base na atividade de NA determinada anteriormente neste vídeo, prepare dois mililitros de diluições do vírus em tampão de ensaio uma vez contendo o surfactante NP40 a 0,1% em um bloco de poços profundos de 96 poços. Ao diluir o vírus, certifique-se de adicioná-lo diretamente no tampão de ensaio uma vez. Isso é crucial especialmente quando o volume do vírus é muito baixo.Dispense o volume necessário de inibidores de NA em um reservatório de oito poços profundos. Em seguida, dispense 50 microlitros de inibidores de NA em diluições variando de zero a 30.000 nanomolares. Adicione 50 microlitros de vírus-teste diluídos por poço nas colunas de um a onze.E 50 microlitros por poço de tampão de ensaio na concentração de um vezes para a coluna 12. Bata suavemente na placa para misturar e cubra-a para prevenir evaporação. Em seguida, incube a placa à temperatura ambiente por 45 minutos.Após a incubação, adicione 50 microlitros de MUNANA 300 micromolar a cada poço. Em seguida, bata suavemente na placa para misturar e cubra-a. Incube a placa a 37 graus celsius por uma hora.Adicione 100 microlitros de solução de parada a cada poço. E bata suavemente na placa para misturar. Em seguida, use um fluorímetro para ler a placa.Para calcular os valores de IC50, copie e cole os dados brutos gerados pelo fluorímetro em uma planilha no formato de placa de 12 colunas, começando pela célula A1. Abra o software de ajuste e clique na aba experimento. Escolha a opção Fluoro Alternativo com 2 fármacos e 11 amostras. Clique na aba opções e marque Gerar Gráficos.Clique em opções novamente e selecione a guia Nova Chave. Em seguida, salve o arquivo SEV da chave de inibição na mesma pasta do arquivo da planilha de dados brutos. No arquivo chave_inibicao, liste todos os nomes das amostras abaixo de ID. Se quatro inibidores de NA foram testados, insira espaços para duas linhas adicionais abaixo de oseltamivir e digite peramivir e laninamivir.Salve as alterações feitas no arquivo inhibition_key. Retorne à janela de Ajuste da Curva de Inibição do jasprv1.2 e selecione o arquivo de dados brutos como o arquivo de experimento. E o inhibition_key como o arquivo de chave.Execute a análise. Em seguida, salve os resultados nos formatos CSV e PDF. Examine os valores de IS50 e as formas das curvas geradas pelo software.Todos os pontos de dados devem estar sobre ou próximos à curva. Caso contrário, repita o ensaio de inibição de NA. Como mostrado nesta curva de inibição, a fluorescência em função da concentração crescente do inibidor de NA é representada para um vírus A(H1N1)pdn09, A/Perth/82/2015.O IC50 está indicado aqui. Um resultado de inibição normal, inibição reduzida ou inibição altamente reduzida é atribuído aos vírus em teste mediante comparação do IC50 com a mediana. Os valores medianos de IC50 devem ser determinados em cada laboratório utilizando dados gerados a partir do teste de vírus com inibição normal.Exemplo de valores medianos de IC50 determinados no Centro Colaborador da OMS para Influenza em Melbourne para os respectivos tipos e subtipos. Para os vírus da influenza A, os vírus com inibição normal são aqueles com valores de IC50 inferiores a 10 vezes em comparação com a mediana de referência de IC50 para seus respectivos subtipos. Os vírus com inibição reduzida são aqueles com valores de IC50 entre 10 e 100 vezes acima da mediana de referência de IC50 para seus respectivos subtipos.Enquanto vírus com inibição altamente reduzida apresentam valores de IC50 100 vezes acima da mediana de referência de IC50. Para os vírus da gripe B, vírus com inibição normal possuem valores de IC50 inferiores a cinco vezes em comparação com a mediana de referência de IC50. Vírus com inibição reduzida situam-se entre cinco e 50 vezes, e vírus com inibição reduzida de alto nível (HRI) apresentam valores 50 vezes acima da mediana de referência de IC50.Esta tabela apresenta uma lista de substituições de aminoácidos NA que foram detectadas nos últimos cinco anos e que conferem inibição reduzida aos inibidores da neuraminidase. O ensaio de inibição de NA baseado em fluorescência mostrado neste vídeo é um ensaio altamente robusto e reprodutível. Após assistir a este vídeo e ler o protocolo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a sensibilidade dos vírus da influenza à classe de antivirais inibidores da neuraminidase.

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio sialidase é uma abordagem simples técnica que irá elucidar mecanismo molecular romance (s) de sensores de TLR de infecções microbianas e envolvimento em doenças inflamatórias ao nível do receptor na superfície celular de macrófagos ao vivo.

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A Miniaturized Glycan Microarray Ensaio para a Avaliação de avidez e especificidade do Hemaglutininas vírus da gripe A

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Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Descrevemos o ensaio de lectina enzimática (ELLA) para medir os títulos de anticorpos de inibição da neuraminidase (NA) da influenza em soros. O ensaio usa aglutinina de amendoim para quantificar os resíduos de galactose que se tornam acessíveis quando a NA remove o ácido siálico de placas de 96 poços revestidas com fetuína.

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Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Anticorpos neutralizantes gripe correlacionam com proteção de infecções de gripe. Microneutralization ensaios medem anticorpos neutralizantes em soros humanos e são frequentemente utilizados para sorologia humana da gripe. Descrevemos um ensaio de microneutralization usando células MDCK-SIAT1 para medir os anticorpos neutralizantes para contemporâneas 3C.2a e 3C.3a A(H3N2) vírus após vacinação gripe ou infecção.

Medição da gripe neutralizando Antibody Responses to A(H3N2) vírus em soros humanos por Microneutralization ensaios usando as células MDCK-SIAT1

Relatado aqui é um protocolo para a quantificação de partículas virais infecciosas usando monitoramento em tempo real da impedância elétrica de células infectadas. Uma aplicação prática deste método é apresentada quantificando a decadência do vírus influenza A sob diferentes parâmetros físico-químicos imitando condições ambientais.

Monitorando a sobrevivência do vírus da influenza fora do hospedeiro usando análise celular em tempo real

Aprenda a avaliar a suscetibilidade de vírus influenza A e B a inibidores de neuraminidase usando ensaio baseado em fluorescência. Este método robusto determina resistência ou sensibilidade antiviral por meio de valores de IC50.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais (Vídeo) | JoVE Journal

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