Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de Bacillus -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

O objetivo geral deste procedimento é preparar proteínas recombinantes a partir de bactérias não patogênicas para facilitar estudos biofísico-químicos, como a cristalografia de raios-x de proteínas ou cinética enzimática. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre como preparar proteína recombinante de interesse usando bactérias não patogênicas para caracterização biofísica preliminar. A principal vantagem dessa técnica é que a caracterização biofísica para proteínas de interesse pode ser feita em qualquer laboratório equipado com instrumentos comuns, como incubadoras de cultura de células e espectrofotômetros.

Para iniciar este procedimento, prepare a reação de ligadura conforme descrito no protocolo de texto. Pipetar três microlitros da reação de ligação preparada em um tubo contendo 50 microlitros de células alfa de E.coli DH5 quimicamente competentes. Usando uma pipeta, misture delicadamente a solução.

Coloque gelo na solução por 30 minutos. Em seguida, choque térmico por 45 segundos a 42 graus Celsius. Depois disso, adicione um mililitro de meio LB e cultive as células enquanto agita vigorosamente a 250 rotações por minuto, a 37 graus Celsius por 45 minutos.

Espalhe 100 microlitros de células transformadas em uma placa helicoidal LB suplementada com 100 microgramas por mililitro de canamicina. Incube por 18 horas a 37 graus Celsius. Usando uma ponta estéril, pegue as colônias do prato.

Cultive as células em três mililitros de meio LB suplementado com agitação vigorosa a 250 rotações por minuto a 18 graus Celsius por 18 horas. Em seguida, prepare o DNA plasmático e confirme a sequência de nucleotídeos conforme descrito no protocolo de texto. Depois de retransformar a cepa de E.coli BL21, selecione uma colônia usando uma ponta estéril e inocule 10 mililitros de meio LB contendo 150 microgramas por mililitro de canamicina.

Incube a 37 graus Celsius por 18 horas com agitação vigorosa a 250 rotações por minuto. Em seguida, transfira os 10 mililitros de cultura noturna para um litro de LB e meio de canamicina. Cresça a 37 graus Celsius até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,7.

Em seguida, mergulhe a cultura em água gelada por 15 minutos. Adicionar IPTG à cultura, de modo que a concentração final seja de um milimolar. Incube a 18 graus Celsius por mais 16 a 18 horas.

Depois disso, centrifugue a 5.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda as células em 50 microlitros de PBS contendo 10 milimolares de imidazol.

Em seguida, lise as células duas vezes no gelo, conforme detalhado no protocolo de texto. Centrifugue a 25.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius para limpar o lisado celular. Em seguida, misture três mililitros de contas de níquel e 47 mililitros de PBS contendo 10 milimolares de imidazol em um tubo cônico de 50 mililitros.

A gravidade flui o buffer extra para assentar as contas equilibradas em uma coluna de cromatografia de vidro de 2,5 por 10 centímetros. Usando uma pipeta, transfira o sobrenadante para a coluna. Incubar a quatro graus Celsius por duas horas em uma roda de fiar a 20 rotações por minuto.

Depois disso, deixe o sobrenadante drenar por gravidade. Lave as esferas de níquel três vezes usando 100 mililitros de PBS contendo 10 milimolares de imidazol para cada lavagem. Em seguida, aplique cinco mililitros de PBS contendo 250 milimolares de imidazol para eluir a proteína RBC 1531.

Analise 15 microlitros da eluição via SDS Page, conforme descrito no protocolo de texto. Pipetar as frações recolhidas para um tubo de diálise. Coloque o tubo em um béquer contendo quatro litros de tampão compatível com clivagem de trombina a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, use uma pipeta para transferir as frações para um tubo cônico de 15 mililitros. Meça a absorbância em 280 nanômetros para estimar a concentração de proteína, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, transfira 50 microlitros de proteína RBC 1531 para vários tubos.

Adicione uma quantidade diferente de trombina a cada tubo e incube a 20 graus Celsius por três horas. Depois de determinar a menor quantidade de trombina necessária, adicione 10 miligramas de proteína e 60 unidades de trombina a um tubo de 15 mililitros. Incube a 20 graus Celsius por três horas.

Em seguida, transfira a proteína digerida pela trombina para um tubo de filtro centrífugo. Centrifugue a 3.000 vezes G a quatro graus Celsius para reduzir o volume para menos de cinco mililitros. Depois disso, aplique a proteína concentrada a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho preparada.

Colete 60 frações de eluição com 0,5 mililitros por tubo. Execute 15 microlitros de cada fração em um gel de página de 15% SDS, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, combine as frações que contêm a proteína RBC 1531.

Para começar, transfira as frações combinadas para um tubo de filtro centrífugo. Centrifugue a 3.000 vezes G a quatro graus Celsius para concentrar a proteína em aproximadamente 18,5 miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros de cada solução de peneiramento de cristalização aos poços de uma placa de cristalização de gota de 96 poços.

Adicione 0,5 microlitros da solução proteica concentrada em uma cama sentada. Misture separadamente a solução de proteína com 0,5 microlitros da solução do poço. Cubra a placa com filme adesivo transparente.

Incube a 18 graus Celsius e permita a difusão do vapor. Usando um microscópio de luz, escaneie as gotas com ampliação de 20 a 40 vezes para monitorar a formação de cristais diariamente por duas a três semanas. Depois de preparar os substratos NTP, adicione cada um a uma placa de 96 poços.

Adicione 20 microgramas de proteína RBC 1531 a cada poço usando uma pipeta para misturar. Cubra o prato com a tampa e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, transfira a placa para um banho-maria de 70 graus Celsius por 15 minutos para interromper as reações catalíticas mediadas por RBC 1531.

Em seguida, adicione um microlitro de pirofosfatase inorgânica de S. cerevisiae a cada poço. Incube a 20 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 16 microlitros de solução ácida de molibdato à placa de reação para desenvolver a cor.

Após 15 minutos, leia a densidade óptica em 690 nanômetros. Neste estudo, o produto proteico do gene BC1531 B sério é caracterizado em nível molecular. Após a purificação por cromatografia de afinidade de níquel, é efectuado um rasto de digestão da trombina.

0,3 unidades de trombina são vistas como a menor quantidade necessária para remover completamente a etiqueta de afinidade do RBC 1531. Após a digestão, a proteína livre de marca é purificada a aproximadamente 99% de pureza, usando cromatografia de exclusão de tamanho. Em seguida, o status oligomérico é estimado por cromatografia de exclusão de tamanho.

Como a RBC 1531 é eluída a aproximadamente 84 mililitros, seu peso molecular é estimado em 55 kilodaltons. O peso molecular calculado do monômero é de cerca de 13 kilodaltons. Portanto, RBC 1531 se monta como um tetrâmero.

A triagem de cristalização é então realizada utilizando um método de difusão de vapor de gota sentada. Os cristais são vistos após dois dias com um citrato de sódio molar e 20% de polietilenoglicol 3.000, e com 0,1 molares de cacodilato de sódio e um citrato de sódio molar. Depois disso, a atividade da NTPase é determinada.

Nenhuma mudança de cor visível é observada após a adição de molibdato à reação de hidrólise mediada por RBC 1531. No entanto, quando a pirofosfatase é adicionada, a cor muda para azul profundo. A densidade óptica a 690 nanômetros e a concentração de NTP são então analisadas usando regressão não linear.

Determina-se que a enzima RBC 1531 tem uma velocidade máxima de 0,75 e uma constante de Michaelis de 10 micromolares. Ao tentar este procedimento, é importante preparar amostras de proteínas sem demora e descartar frações contendo quaisquer impurezas que impeçam a cristalização de proteínas ou introduzam erros em ensaios enzimáticos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da enzimologia e outras ciências de proteínas caracterizarem proteínas de interesse com espectrofotômetros decorados na maioria dos laboratórios.

Embora esse método possa fornecer informações sobre ideias gerais de preparação de proteínas recombinantes, telas de cristalização e cinética enzimática, ele também pode ser aplicado à análise química biofísica de outras proteínas de nosso interesse. Não se esqueça de ter cuidado ao trabalhar com proteínas, pois elas podem ser extremamente instáveis. Precauções como deixar amostras sobre o gelo e refrigerar a 80 graus para armazenamento de longo prazo serão desejadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar proteína recombinante de bactérias não patogênicas para obter cristais de proteína para uma determinação da estrutura por cristalografia de raios-x e como caracterizar a atividade enzimática usando um método colorimétrico.