Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de

O objetivo geral deste procedimento é preparar proteínas recombinantes a partir de bactérias não patogênicas para facilitar estudos químicos e biofísicos, como a cristalografia de proteínas por raios X ou a cinética enzimática. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre como preparar a proteína recombinante de interesse utilizando bactérias não patogênicas para caracterização biofísica preliminar. A principal vantagem desta técnica é que a caracterização biofísica da proteína de interesse pode ser realizada em qualquer laboratório equipado com instrumentos comuns, como incubadoras de cultura celular e espectrofotômetros.

Para iniciar este procedimento, prepare a reação de ligação conforme descrito no protocolo textual. Pipete três microlitros da reação de ligação preparada em um tubo contendo 50 microlitros de células de E.coli DH5 alpha quimicamente competentes. Usando uma pipeta, misture suavemente a solução.

Coloque a solução no gelo durante 30 minutos. Em seguida, submeta-a a choque térmico por 45 segundos a 42 graus Celsius. Após isso, adicione um mililitro de meio LB e cultive as células sob agitação vigorosa a 250 rotações por minuto, a 37 graus Celsius, por 45 minutos.

Espalhe 100 microlitros de células transformadas em uma placa de ágar LB suplementada com 100 microgramas por mililitro de canamicina. Incube por 18 horas a 37 graus Celsius. Usando uma ponteira estéril, retire colônias da placa.

Cultive as células em três mililitros de meio LB suplementado com agitação vigorosa a 250 rotações por minuto a 18 graus Celsius por 18 horas. Em seguida, prepare o DNA plasmidial e confirme a sequência de nucleotídeos conforme descrito no protocolo textual. Após a retransformação da linhagem E.coli BL21, selecione uma colônia utilizando uma ponta estéril e inicie o cultivo em 10 mililitros de meio LB contendo 150 microgramas por mililitro de canamicina.

Incube a 37 graus Celsius por 18 horas com agitação vigorosa a 250 rotações por minuto. Em seguida, transfira os 10 mililitros de cultura de crescimento noturno para um litro de meio LB com canamicina. Incube a 37 graus Celsius até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja 0,7.

Em seguida, mergulhe a cultura em água gelada por 15 minutos. Adicione IPTG à cultura, de modo que a concentração final seja um milimolar. Incube a 18 graus Celsius por mais 16 a 18 horas.

Após isso, centrifugue a 5.000 × g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Re-suspenda as células em 50 microlitros de PBS contendo imidazol 10 milimolar.

Em seguida, lise as células duas vezes no gelo conforme detalhado no protocolo textual. Centrifugue a 25.000 ×g durante 30 minutos a quatro graus Celsius para clarificar o lisado celular. Em seguida, misture três mililitros de esferas de níquel e 47 mililitros de PBS contendo imidazol 10 milimolar em um tubo cônico de 50 mililitros.

Deixe escorrer por gravidade o tampão excedente para acomodar as esferas equilibradas em uma coluna de cromatografia de vidro de 2,5 por 10 centímetros. Usando uma pipeta, transfira o sobrenadante para a coluna. Incube a quatro graus Celsius por duas horas em uma roda giratória a 20 rotações por minuto.

Após isso, deixe o sobrenatante escorrer por gravidade. Lave as perolas de níquel três vezes usando 100 mililitros de PBS contendo 10 milimolares de imidazol para cada lavagem. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS contendo 250 milimolares de imidazol para eluir a proteína RBC 1531.

Analise 15 microlitros da eluição por meio de eletroforese SDS-PAGE conforme descrito no protocolo do texto. Pipete as frações coletadas em um tubo de diálise. Coloque o tubo em um béquer contendo quatro litros de tampão compatível com clivagem por trombina a quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, utilize uma pipeta para transferir as frações para um tubo cônico de 15 mililitros. Meça a absorbância em 280 nanômetros para estimar a concentração proteica conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, transfira 50 microlitros da proteína RBC 1531 para vários tubos.

Adicione uma quantidade diferente de trombina a cada tubo e incube a 20 graus Celsius por três horas. Após determinar a menor quantidade de trombina necessária, adicione 10 miligramas de proteína e 60 unidades de trombina a um tubo de 15 mililitros. Incube a 20 graus Celsius por três horas.

Em seguida, transfira a proteína digerida pela trombina para um tubo de filtro centrífugo. Centrifugue a 3.000 × g a quatro graus Celsius para reduzir o volume a menos de cinco mililitros. Após isso, aplique a proteína concentrada em uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho previamente preparada.

Colete 60 frações de eluição com 0,5 mililitros por tubo. Aplique 15 microlitros de cada fração em um gel de SDS-PAGE 15%, conforme descrito no protocolo textual. Em seguida, combine as frações que contêm a proteína RBC 1531.

Para começar, transfira as frações combinadas para um tubo de filtro centrífugo. Centrifugue a 3.000 vezes G a quatro graus Celsius para concentrar a proteína a aproximadamente 18,5 miligramas por mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros de cada solução de triagem para cristalização aos poços de uma placa de cristalização de gota sentada de 96 poços.

Adicione 0,5 microlitros da solução concentrada de proteína sobre um suporte estacionário. Misture separadamente a solução de proteína com 0,5 microlitros da solução do poço. Cubra a placa com filme adesivo transparente.

Incube a 18 graus Celsius e permita a difusão de vapor. Utilizando um microscópio óptico, examine as gotas com aumento de 20 a 40 vezes para monitorar diariamente a formação de cristais durante duas a três semanas. Após preparar os substratos de NTP, adicione cada um a uma placa de 96 poços.

Adicione 20 microgramas da proteína RBC 1531 a cada poço usando uma pipeta para misturar. Cubra a placa com sua tampa e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após isso, transfira a placa para um banho-maria a 70 graus Celsius por 15 minutos para interromper as reações catalíticas mediadas pela RBC 1531.

Em seguida, adicione um microlitro de pirofosfatase inorgânica de S.cerevisiae em cada poço. Incube a 20 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 16 microlitros de solução de molibdato ácido à placa de reação para desenvolver a coloração.

Após 15 minutos, leia a densidade óptica em 690 nanômetros. Neste estudo, o produto proteico do gene B serious BC1531 é caracterizado em nível molecular. Após a purificação por cromatografia de afinidade com níquel, é realizada uma etapa de digestão com trombina.

Observa-se que 0,3 unidade de trombina é a menor quantidade necessária para remover completamente a etiqueta de afinidade do glóbulo vermelho 1531. Após a digestão, a proteína livre da etiqueta é purificada até aproximadamente 99% de pureza, utilizando cromatografia de exclusão por tamanho. Em seguida, o status oligomérico é estimado por cromatografia de exclusão por tamanho.

Como o RBC 1531 é eluído em aproximadamente 84 mililitros, seu peso molecular é estimado em 55 quilodaltons. O peso molecular calculado do monômero é de cerca de 13 quilodaltons. Portanto, o RBC 1531 se assembla como um tetrâmero.

A triagem de cristalização é então realizada utilizando o método de difusão de vapor em gota sentada. Cristais são observados após dois dias com citrato de sódio um molar e 20% de polietileno glicol 3.000, e com cacodilato de sódio 0,1 molar e citrato de sódio um molar. Após isso, a atividade de NTPase é determinada.

Nenhuma mudança visível de cor é observada após a adição de molibdato à reação de hidrólise mediada pelo CBR 1531. No entanto, quando a pirofosfatase é adicionada, observa-se que a cor muda para azul intenso. A densidade óptica em 690 nanômetros e a concentração de NTP são então analisadas utilizando regressão não linear.

Determinou-se que a enzima RBC 1531 possui uma velocidade máxima de 0,75 e uma constante de Michaelis de 10 micromolar. Ao realizar este procedimento, é importante preparar as amostras de proteína sem atraso e descartar frações que contenham impurezas que impeçam a cristalização da proteína ou introduzam erros nos ensaios enzimáticos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de enzimologia e outras ciências das proteínas caracterizarem proteínas de interesse com espectrofotômetros que estão presentes na maioria dos laboratórios.

Embora este método possa fornecer informações sobre conceitos gerais de preparação de proteínas recombinantes, ensaios de cristalização e cinética enzimática, ele também pode ser aplicado à análise química biofísica de outras proteínas de nosso interesse. Não se esqueça de ter cuidado ao trabalhar com proteínas, pois elas podem ser extremamente instáveis. Precauções, como manter as amostras sobre gelo e armazená-las a 80 graus sob refrigeração prolongada, serão desejáveis.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar proteínas recombinantes a partir de bactérias não patogênicas para obter cristais proteicos destinados à determinação de estrutura por cristalografia de raios X, bem como de como caracterizar a atividade enzimática utilizando um método colorimétrico.