Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso

O objetivo geral deste artigo é apresentar métodos de preparação e caracterização de nanopartículas que imitam lipoproteínas de alta densidade carregadas com fator de crescimento nervoso. A homogeneização simples foi utilizada para preparar nanopartículas normais que imitam lipoproteínas de alta densidade. O procedimento é simples e escalonável.

Além disso, a nanopartícula aumentou significativamente a eficiência de aprisionamento, também do NGF e da APOA1 nas nanopartículas. Vários desafios para caracterizar uma nanopartícula foram superados, incluindo a separação do NGF não carregado das nanopartículas de NGF, a realização de estudos confiáveis do raio in vitro e a biodisponibilidade das nanopartículas de NGF. Para começar, misture 10 microlitros de NGF com 10 microlitros de protamina USP em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e deixe em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente para formar o complexo.

Em seguida, adicione 59 microlitros de fosfatidilcolina e 11 microlitros de esfingomielina a um vial de vidro. Adicione também quatro microlitros de fosfatidilserina, 15 microlitros de oleato de colesterol e 45 microlitros de succinato de tocoferol polietilenoglicol. Misture e evapore o etanol sob um fluxo suave de nitrogênio por cerca de cinco minutos.

Todos os excipientes devem formar um filme fino oleoso no fundo do frasco de vidro. Adicione um mililitro de água ultrapura ao frasco e homogeneíze a 9.500 rpm durante cinco minutos à temperatura ambiente para formar as nanopartículas protótipo, ou NPs. Em seguida, adicione o complexo preparado às NPs protótipo.

Incube a suspensão a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação, utilizando um pequeno bastão de agitação no frasco de vidro. Resfrie as NPs com agitação à temperatura ambiente por mais 30 minutos. Após o resfriamento, adicione 106 microlitros de apolipoproteína A-1 e agite à temperatura ambiente durante a noite para formar as NPs finais de HDL que imitam o NGF.

Meça o tamanho das partículas e o potencial zeta utilizando um analisador de partículas conforme as instruções do fabricante. Uma coluna cromatográfica de filtração em gel reticulada é usada para separar o NGF não carregado das nanopartículas que imitam HDL contendo NGF e determinar a eficiência de aprisionamento do NGF. Para o preparo da coluna, transfira 15 mililitros da suspensão de sepharose 4B CL para um béquer de 50 mililitros.

Agite a suspensão de esferas e despeje uma parte em uma coluna. Bata suavemente na coluna para eliminar bolhas. Deixe o solvente escorrer e as esferas sedimentarem por alguns minutos.

Continue adicionando a suspensão restante. Enxágue a parede interna da coluna para limpar as esferas. Drene o solvente até que o nível do solvente esteja ligeiramente acima do topo da fase estacionária.

Em seguida, lave e equilibre a coluna com 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1X. Para medir a eficiência de aprisionamento do NGF, aplique 200 microlitros de NPs que imitam HDL contendo NGF na coluna e elua com PBS 1X. Como antes, colete um total de 12 frações de um mililitro cada.

Pré-trate oito tubos de diálise seguindo as instruções do fabricante. Adicione 30 mililitros de meio de liberação a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, aqueça até 37 graus Celsius em um agitador com velocidade de agitação de 135 rpm.

Fecher o tubo de diálise e colocá-lo no meio de liberação. Retirar rapidamente 100 microlitros do meio de liberação do lado externo do tubo de diálise como amostra para o tempo zero. Colocar imediatamente a amostra a menos 20 graus Celsius para análise posterior.

Adicione 100 microlitros de meio de liberação fresco ao tubo de centrífuga para substituir a amostra retirada. Em seguida, inicie o cronômetro. Após 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 horas, retire 100 microlitros do meio de liberação e substitua por 100 microlitros de meio fresco.

Coloque imediatamente as amostras coletadas a menos 20 graus Celsius para análise posterior. Após uma homogeneização de três minutos, obtiveram-se tamanhos de partículas consistentes para as nanopartículas protótipo. As nanopartículas finais de NGF apresentaram tamanhos de partícula de 170 nanômetros com uma distribuição de tamanho estreita e monodispersa.

NGF não carregado e nanopartículas foram completamente separados na coluna de filtração em gel. As nanopartículas foram eluídas nas frações dois a quatro. A medição por ELISA indicou que o NGF livre foi eluído da fração 7 à fração 10.

A eficiência de encapsulação calculada do NGF foi aproximadamente de 66%. A liberação in vitro de nanopartículas de NGF é mostrada aqui. Ao adicionar PBS e BSA ao meio de liberação, o NGF livre atravessou a membrana de diálise com uma recuperação superior a 85%. Em contrapartida, as nanopartículas de NGF exibiram um perfil de liberação lenta, com cerca de 10% do NGF sendo liberado das nanopartículas ao longo de 72 horas. As nanopartículas de NGF estimularam o crescimento de neuritos em células PC12 em grau semelhante ao do NGF livre.

O crescimento dos neuritos foi claramente observado ao microscópio para ambos os grupos quando administrados a 50 nanogramas por mililitro. As nanopartículas de NGF aumentaram consideravelmente a concentração plasmática e reduziram a captação de NGF no fígado, rim e baço dos camundongos. As nanopartículas que imitam HDL auxiliaram o NGF, permitindo uma meia-vida prolongada na estabilidade in vivo.

Uma vez dominado, nanopartículas monodispersas podem ser preparadas em três minutos usando um método de homogeneização, desde que seja realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar um fluxo suave de nitrogênio para evaporar o solvente e garantir que não haja resíduo lipídico aderido à parede do recipiente após a homogeneização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir nanopartículas que imitam HDL usando um método de homogeneização e de como caracterizar nanopartículas carregadas com NGF.