Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa
17 de abril de 2017
gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.
O objetivo geral do isolamento de gotículas lipídicas para espectrometria de massa quantitativa é compreender a função desses organoides, por exemplo, na replicação de patógenos como o vírus da hepatite C. Este método pode responder perguntas fundamentais na área de doenças infecciosas, como por que os patógenos se ligam às gotículas para replicação. O isolamento de gotículas lipídicas pode ser realizado em seis a sete horas.
E durante este procedimento, é importante evitar a contaminação por queratina. Para começar, retire 50 mililitros de cada frasco de meio DMEM e adicione 50 mililitros de soro bovino fetal dialisado. Em seguida, dissolva 50 miligramas de lisina marcada com carbono 13 e 50 miligramas de arginina marcada com carbono 13 em um mililitro de meio.
Misture bem e adicione os aminoácidos ao meio DMEM mais FCS. Em seguida, adicione o PenStrep e o substituto da glutamina. Filtre esterilmente o meio utilizando um filtro de 0,45 mícron e rotule o frasco como meio SILAC pesado.
Para preparar o meio leve, repita esses passos usando 50 miligramas de arginina e 50 miligramas de lisina. Rotule o frasco como meio SILAC leve. Faça a tripsinização das células e divida-as em duas poças de uma placa de cultura de seis poças.
Um poço deve conter dois mililitros do meio SILAC pesado e o outro, dois mililitros do meio SILAC leve. Cultive as células por pelo menos seis passagens. Após seis passagens, a incorporação dos aminoácidos pesados deve ser superior a 95%. Recolha um milhão de células das populações celulares marcadas com isótopos pesados e leves para analisar a eficácia de incorporação.
Após lavar as células em PBS 1X, faça a pelagem por centrifugação durante cinco minutos a 160 × g e quatro graus Celsius. Re-suspenda os pellets celulares em 150 microlitros de tampão MS. Em seguida, incube as células em gelo durante 30 minutos.
Em seguida, lise as células por sonicação a quatro graus Celsius. Remova os detritos celulares por centrifugação durante 10 minutos a 11.000 ×g e quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e determine a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína compatível com detergentes.
Em seguida, misture 75 microgramas de proteína com seis x tampão de amostra. Após fervura a 95 graus Celsius por cinco minutos, separe as proteínas por SDS-PAGE em tampão de corrida SDS a 180 volts por aproximadamente uma hora. Após a coloração com Comassie, excise a mesma faixa proteica e analise a eficácia de incorporação por análise de MS.
Infete a população leve de células com o vírus repórter da hepatite C incubando-as com estoques fibrosos por quatro horas a 37 graus Celsius. Expanda as células leves infectadas com HCV e as células pesadas não infectadas conforme descrito no protocolo textual. Se estiver usando uma linhagem de HCV que carrega um gene de resistência à blasticidina, adicione 10 microgramas por mililitro de blasticidina S ao meio leve para selecionar células positivas para HCV.
No dia anterior ao isolamento de gotículas lipídicas, lave as células com PBS, faça a tripsinização e re-suspenda-as no respectivo meio leve ou pesado. Conte as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Em seguida, semeie sete milhões de células de cada população em uma placa de cultura celular de 150 centímetros quadrados.
Prepare pelo menos cinco placas para cada população de células leves e pesadas. Incube as células em 30 mililitros de meio por placa durante a noite. No dia seguinte, remova o meio e lave as células com PBS 1X.
Destaque as células em PBS 1X utilizando uma espátula para células. Após contar ambas as populações celulares como anteriormente, retire números iguais de células em tubos cónicos de 50 mililitros. Pelotize as células por centrifugação durante cinco minutos a 160 vezes g e quatro graus Celsius.
Remova o PBS e re-suspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de sacarose. Transfira a suspensão celular para um homogeneizador Ounce de encaixe justo antes de lisar as células com 200 movimentos no gelo. Em seguida, transfira o lisado para um tubo microfuga de 1,5 mililitro e centrifugue os núcleos e os detritos celulares por 10 minutos a 1.000 × g e 4 °C.
Após a centrifugação, armazene uma alíquota de 25 microlitros da fração pós-nuclear, ou PNS, a menos 20 graus Celsius como controle de entrada. Coloque o restante da fração PNS no fundo do tubo de centrífuga e recubra com aproximadamente três mililitros do tampão de lavagem de gotículas lipídicas. Centrifugue durante duas horas a 100.000 ×g e 4 °C.
Após a centrifugação, colete a fração flutuante de gotículas lipídicas do topo do tubo utilizando uma cânula romba curvada. Em seguida, coloque a fração de gotículas lipídicas em um tubo de centrífuga, recubra com tampão de lavagem de gotículas lipídicas e repita a etapa de centrifugação. A coleta das gotículas lipídicas do topo do gradiente exige experiência.
E é mais fácil quanto maior for a fração. Você pode usar células adiposas para praticar. Ou pode alimentar suas células com oleato para aumentar a quantidade de gotículas lipídicas.
Mais uma vez, colete a fração de gotículas lipídicas flutuantes utilizando uma cânula romba dobrada a partir do topo do tubo. Transfira as gotículas lipídicas para um novo tubo microcenrífugo de 1,5 mililitro e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem de gotículas lipídicas. Em seguida, centrifugue a amostra por 20 minutos a 21.000 × g e 4 graus Celsius.
Remova o tampão de lavagem subjacente utilizando uma ponta de pipeta para eletroforese e repita o passo de lavagem três vezes. Após a remoção final do tampão de lavagem, misture cinco microlitros das frações de gotículas lipídicas com 10 microlitros de tampão de lise NP-40 para determinação do teor proteico. Incube a amostra em gelo durante uma hora para inativar o vírus, caso esteja trabalhando com material infeccioso.
Neste ponto, as frações de gotículas lipídicas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Em seguida, misture o volume correspondente a pelo menos 35 microgramas de proteína com corante de carga 4x. Incube a mistura em gelo por uma hora para inativar o vírus, caso esteja trabalhando com material infeccioso.
Ferva a amostra a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, realize eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS seguida de coloração com Comassie para preparar a amostra para cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, conforme descrito no protocolo textual. Para analisar a pureza das gotículas lipídicas, dilua alíquotas das frações de gotículas lipídicas, de uma a duas, com tampão de lise NP 40.
Dilua as frações controle de entrada de um a dez com o mesmo tampão. Incube as amostras em gelo durante uma hora para inativar o vírus, caso esteja trabalhando com material infeccioso. Em seguida, determine o nível de proteína por meio de um ensaio de proteína compatível com detergentes.
Em seguida, misture quantidades iguais de proteína com tampão amostra 6x e incube as amostras no gelo durante uma hora para inativar o vírus, caso esteja trabalhando com material infeccioso. Por fim, prossiga com o SDS-PAGE e transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose por eletrotransferência em tanque a 80 volts durante 90 minutos. É mostrada aqui uma análise representativa de western blot das frações pós-nucleares e de gotículas lipídicas.
O western blot mostra claramente um enriquecimento das proteínas marcadoras de gotículas lipídicas, perilipina dois e perilipina três, nas frações de gotículas lipídicas, bem como o esgotamento de marcadores de outros compartimentos celulares. As frações pós-nucleares e de gotículas lipídicas podem ser analisadas adicionalmente por coloração com azul de Coomassie e prata. Este mapa de calor ilustra o número de peptídeos e a porcentagem de cobertura proteica das proteínas identificadas nas frações de gotículas lipídicas das células analisadas.
O mapa térmico final mostra como a infecção pelo VHC altera as gotículas lipídicas por dia. As proteínas associadas às gotículas lipídicas enriquecidas são indicadas em vermelho, e as proteínas associadas às gotículas lipídicas empobrecidas são indicadas em azul. A principal vantagem deste método é que misturamos as células antes do isolamento e antes do isolamento das gotículas lipídicas, podendo assim minimizar erros que possam ocorrer durante a lise celular e durante as etapas de isolamento.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para o isolamento de gotículas lipídicas com o objetivo de estudar seu papel na replicação de patógenos como o vírus da hepatite C (HCV). O processo de isolamento é fundamental para compreender as interações entre patógenos e gotículas lipídicas durante diversas condições.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Doenças Infecciosas
Antecedentes
- As gotículas lipídicas são organelas envolvidas na replicação de diversos patógenos.
- O Vírus da Hepatite C (HCV) depende das gotículas lipídicas para sua replicação.
- Compreender a dinâmica das gotículas lipídicas pode fornecer insights sobre os mecanismos das doenças infecciosas.
- A contaminação durante os procedimentos de isolamento deve ser evitada para obter resultados precisos.
Objetivo do Estudo
- Isolar gotículas lipídicas para análise quantitativa por espectrometria de massas.
- Investigar o papel das gotículas lipídicas na replicação de patógenos.
- Responder perguntas fundamentais na área de doenças infecciosas.
Métodos Utilizados
- O isolamento de gotículas lipídicas pode ser concluído em seis a sete horas.
- O preparo envolve a mistura do meio DMEM com soro de bezerro fetal dialisado.
- Lisina e arginina marcadas com carbono 13 são utilizadas no processo de isolamento.
- É necessário ter cuidado para evitar contaminação por queratina durante o procedimento.
Resultados Principais
- O método permite a análise quantitativa de proteínas associadas às gotículas lipídicas.
- Os conhecimentos obtidos podem aprimorar a compreensão dos mecanismos de replicação do HCV.
- Aplicações potenciais no estudo de outros patógenos que utilizam gotículas lipídicas.
- Estabelece um protocolo que pode ser adaptado para diversas condições experimentais.
Conclusões
- O método de isolamento é eficaz para o estudo de proteínas associadas aos corpúsculos lipídicos.
- Compreender a dinâmica dos corpúsculos lipídicos é fundamental para a pesquisa em doenças infecciosas.
- Essa abordagem pode levar a novas estratégias terapêuticas contra o VHC e patógenos semelhantes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a dinâmica do proteoma das gotículas lipídicas permite a validação de alvos na pesquisa de doenças infecciosas, identificando fatores do hospedeiro que patógenos exploram para replicação. Este método apoia a redução de riscos mecanicistas por meio de espectrometria de massa quantitativa, fornecendo confiança preditiva na seleção de alvos para estratégias antivirais. A abordagem aplica-se às fases iniciais de descoberta, nas quais a clarificação de vias e a validação biológica orientam a triagem de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação do recrutamento ou esgotamento de proteínas em gotículas lipídicas durante infecção por patógenos.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho padronizado para o isolamento de gotículas lipídicas, permitindo avaliar as interações entre hospedeiro e patógeno em condições controladas.
- Valor Estratégico: Reforça a confiança nos alvos ao identificar fatores do hospedeiro com função pró ou antiviral que modulam proteomas associados às gotículas lipídicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera dados proteômicos quantitativos a partir de frações enriquecidas de gotículas lipídicas para aplicações de triagem posterior.
- Valor Operacional: Estabelece etapas reprodutíveis de isolamento e lavagem para minimizar a variabilidade no rendimento e na pureza das proteínas.
- Valor Estratégico: Permite a padronização de ensaios para comparar a composição de gotículas lipídicas em diferentes condições experimentais, como infecção ou tratamento com fármacos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a descoberta translacional de biomarcadores ao associar alterações em proteínas ligadas às gotículas lipídicas aos mecanismos patogênicos.
- Valor Operacional: Apoia a validação de modelos pré-clínicos por meio de protocolos de isolamento consistentes, aplicáveis a diversos tipos celulares e condições de cultivo.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao identificar fatores do hospedeiro que podem ser terapeuticamente modulados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, fornecendo informações quantitativas sobre a remodelação do proteoma específica por organelas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao revelar como patógenos como o HCV alteram a composição das gotículas lipídicas.
- Triagem: Fornece frações de gotículas lipídicas prontas para ensaios e reprodutíveis, enriquecidas com proteínas associadas, por meio de etapas de ultracentrifugação e lavagem.
- Análises: Permite a comparação quantitativa da abundância de proteínas utilizando marcação SILAC e LC-ESI-MS/MS para detectar alterações específicas a determinadas condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas científicas à continuidade pré-clínica ao identificar proteínas disreguladas que podem atuar como biomarcadores ou alvos terapêuticos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo de isolamento reutilizável, adaptável a diversos patógenos, condições de estresse ou tratamentos com compostos além do HCV.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações hospedeiro-patógeno.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de procedimentos padronizados de lise, centrifugação e lavagem.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados quantitativos sobre proteínas associadas a gotículas lipídicas que influenciam a eficiência de replicação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em sua associação funcional com gotículas lipídicas durante a infecção.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em marcação com SILAC, ultracentrifugação e proteômica baseada em espectrometria de massas.
- Depende do acesso a ultracentrífugas, homogeneizadores e detergentes compatíveis para ensaios de proteínas.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de isolamento e lavagem de gotículas lipídicas para garantir consistência.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes tipos celulares ou modelos de patógenos.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de expertise técnica no isolamento de frações de gotículas lipídicas flutuantes e na prevenção de contaminação por queratina.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Preparation of Media for Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC)
1:34
SILAC-labeling and Amino Acid Incorporation Control
3:15
Lipid Droplet Isolation of SILAC-labeled Huh7.5 Cells
7:59
Analysis of Lipid Droplets Purity
8:53
Results: Qualitative and Quantitative Analysis of the Lipid Droplets
9:57
Conclusion
