Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

O objetivo geral desta técnica é genotipar clones mutantes de deleção de inserção induzida por CRISPR/Cas9 de maneira de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genética, como o efeito fenotípico de nocautear um gene específico em um modelo SAIL de escolha. A principal vantagem dessa técnica é que há uma triagem de rendimento mínimo a alto que é multiflexível.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a genética do câncer humano, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como humano, tronco e célula primária, ou células de origem não humana. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando realizamos repetições curtas em tandem ou ensaios de digitação STR. Para iniciar o procedimento, transfecte as células escolhidas com um plasmídeo, co-expressando um marcador fluorescente cas9 e o RNA guia único.

Tripsinize as células e selecione cerca de 3.500 clones marcados com fluorescência. Coloque os clones em porções de 500, 1.000 e 2.000 células em placas de 10 centímetros em oito mililitros de meio de crescimento suplementado com estreptomicina de penicilina. Incube as células em atmosfera de 5% de CO2 a 37 graus Celsius, substituindo o meio a cada cinco dias até que colônias de células únicas sejam visíveis a olho nu.

Em seguida, aspire colônias individuais em uma pipeta de 200 microlitros com cerca de cinco microlitros de meio de crescimento. Transfira cada colônia para um poço separado contendo 200 microlitros de meio de crescimento. Pipetar repetidamente cada mistura para cima e para baixo para ressuspender as células.

Incubar as células nas condições descritas anteriormente até que as células atinjam 50 a 90% de confluência. Remova o excesso de meio de cultura dos poços e adicione 25 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA sem vermelho de fenol em cada poço. Incube as células a 37 graus Celsius por 7 minutos.

Em seguida, pipetar repetidamente as misturas para cima e para baixo para ressuspender as células tripsinizadas. Inspecione os poços ao microscópio para verificar se as células se desprenderam das paredes do poço. Para preparar réplicas dos clones individuais, transfira cinco microlitros de cada suspensão celular para uma placa de cultura vazia de 96 poços.

Adicione 200 microlitros de meio de crescimento a cada poço. Em seguida, carregue os poços de uma placa PCR vazia de 96 poços com 10 microlitros de tampão de lise. Transfira mais cinco microlitros de cada suspensão celular para esta placa de 96 poços.

Centrifugue brevemente a placa até que o líquido se deposite no fundo dos poços. Adicione 200 microlitros de meio de crescimento aos 15 microlitros restantes de cada suspensão celular. Armazenar a suspensão original e os replicados nas condições de incubação para posterior verificação do estado nocaute dos clones.

Em seguida, use o ciclo térmico para lisar completamente as células no tampão de lise. Centrifugar brevemente os lisados. Diluir os lisados com 40 microlitros de água livre de nuclease.

Vórtice e centrifugue brevemente os lisados diluídos. Antes de realizar a PCR fluorescente, projete e teste a especificidade de vários pares de primers não marcados em células do tipo selvagem lisadas. Identifique o par de primers ideal e obtenha os primers diretos marcados com fluoróforo e o primer reverso não rotulado.

Certifique-se de testar a especificidade dos primers usando células de vórtice, lise usando o tampão de lise caseiro, pois os resultados podem variar do uso de DNA genômico purificado. Usando os primers marcados, execute reações de PCR fluorescente de 20 microlitros com três microlitros dos lisados diluídos para amplificar as regiões-alvo. Avalie o tamanho e as quantidades relativas dos amplicons de PCR resolvendo cinco microlitros dos amplicons em um gel de agarose a 1%.

Para iniciar a preparação da amostra, use água livre de nuclease para diluir amplicons de DNA direcionado ao tipo selvagem e CRISPR / Cas9 a uma concentração aproximada de 2,5 nanogramas por microlitro. Misturar volumes iguais de amostras de ADN de tipo selvagem diluído e de ADN visado. Carregue os poços de uma placa de PCR de 96 poços com nove microlitros de uma mistura de 29 para um de formamida deionizada e corante rotulado com tamanho padrão e um microlitro dos amplicons mistos.

Feche bem a placa e aqueça as amostras a 95 graus Celsius por três minutos com um termociclador de PCR. Imediatamente após o aquecimento, deixe esfriar o prato no gelo por três minutos. Realize eletroforese capilar em gel com um analisador genético.

Após a conclusão da eletroforese, importe os dados para o software de análise e plote os dados. Verifique a qualidade do padrão de tamanho revisando os dados no canal de corante apropriado. Em seguida, exporte os valores do canal de corante para os controles de tipo selvagem não direcionados e clones direcionados no formato txt.

A partir desse arquivo, importe as identidades de corante, nomes de arquivos de amostra, tamanhos de fragmentos e valores de altura de pico para o software de planilha. Calcule a diferença no tamanho do fragmento entre o clone alvo e o controle de tipo selvagem não direcionado em cada amostra. Identifique os clones com mutações indel que não são múltiplos de três pares de bases.

Expanda em série os clones selecionados das replicações armazenadas. Realize o sequenciamento de Sanger e a análise de sangue ocidental para determinar os genótipos do clone e verificar o status de nocaute dos clones. A linhagem celular de carcinoma hepatocelular HEPG2 foi direcionada com uma construção CRISPR/Cas9 contra o gene Nap1L1.

Os alelos do tipo selvagem não direcionados e os alelos direcionados CRISPR/Cas9 foram amplificados por PCR usando primers marcados com fluoróforos verdes e azuis, respectivamente. Usando um protocolo de PCR fluorescente especificamente otimizado, os amplicons dos clones alvo foram obtidos com bom rendimento. Nenhuma interferência foi observada entre os corantes fluorescentes verde e azul nas amostras de clones individuais.

A análise dos tamanhos dos fragmentos, determinados a partir da eletroforese capilar em gel, revelou a deleção de um e 10 pares de bases dos dois clones aqui mostrados. Os resultados do sequenciamento de Sanger foram consistentes com a análise da eletroforese capilar em gel. A análise de sangue ocidental confirmou que os clones selecionados não expressaram NAP1L1.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de rotular suas amostras com cuidado, pois há muitas amostras envolvidas, e também minimizar o tempo de exposição do amplicon de marcação de fluoróforo, pois eles são sensíveis à luz. Após este procedimento, outros métodos como RT PCR quantitativo, análise de sangue ocidental e o sequenciamento de Sanger podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são os genes de interesse, é completamente eliminado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como genotipar clones mutantes induzidos por CRISPR/Cas9 de maneira de alto rendimento usando PCR fluorescente acoplada a eletroforese em gel capilar.