Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

O objetivo geral desta técnica é genotipar clones mutantes de inserção-deleção induzidos por CRISPR/Cas9 de maneira de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de genética, como o efeito fenotípico da inativação de um gene específico em um modelo SAIL de escolha. A principal vantagem desta técnica é que permite um rastreamento de baixa a alta escala com grande multiflexibilidade.

Embora este método possa fornecer informações sobre a genética do câncer humano, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como células humanas, células-tronco e células primárias, ou células de origem não humana. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando realizamos ensaios de tipagem por repetições em tandem curtas ou STR. Para iniciar o procedimento, transfete as células escolhidas com um plasmídeo que coexpresse uma etiqueta fluorescente cas9 e o RNA guia único.

Realize a tripsinização das células e selecione cerca de 3.500 clones marcados com fluorescência. Plaque os clones em porções de 500, 1.000 e 2.000 células em placas de 10 centímetros com oito mililitros de meio de crescimento suplementado com penicilina e estreptomicina. Incube as células em atmosfera de 5% CO₂ a 37 graus Celsius, substituindo o meio a cada cinco dias até que colônias derivadas de célula única sejam visíveis a olho nu.

Em seguida, aspire colônias individuais para uma pipeta de 200 microlitros com cerca de cinco microlitros de meio de crescimento. Transfira cada colônia para um poço separado contendo 200 microlitros de meio de crescimento. Pipete cada mistura para cima e para baixo repetidamente para ressuspender as células.

Incube as células sob as condições previamente descritas até que atinjam de 50 a 90% de confluência. Remova o meio de cultura em excesso dos poços e adicione 25 microlitros de tripsina-EDTA 0,05% sem vermelho de fenol a cada poço. Incube as células a 37 graus Celsius por 7 minutos.

Em seguida, pipete repetidamente as misturas para cima e para baixo para ressuspender as células tripsinizadas. Inspecione os poços ao microscópio para verificar se as células se desprendeu das paredes dos poços. Para preparar réplicas dos clones individuais, transfira cinco microlitros de cada suspensão celular para uma placa de cultura vazia de 96 poços.

Adicione 200 microlitros de meio de crescimento a cada poço. Em seguida, carregue os poços de uma placa PCR vazia de 96 poços com 10 microlitros de tampão de lise. Transfira outros cinco microlitros de cada suspensão celular para esta placa de 96 poços.

Centrifugue brevemente a placa até que o líquido se acumule no fundo dos poços. Adicione 200 microlitros de meio de crescimento aos 15 microlitros remanescentes de cada suspensão celular. Armazene a suspensão original e as réplicas nas condições de incubação para posterior verificação do status de nocaute das linhagens.

Em seguida, utilize o ciclo térmico para lisar completamente as células no tampão de lise. Centrifugue brevemente os lisados. Dilua os lisados com 40 microlitros de água livre de nucleases.

Vortex e centrifugue brevemente os lisados diluídos. Antes de realizar a PCR fluorescente, projete e teste a especificidade de vários pares de primers não marcados em células selvagens lisadas. Identifique o par de primers ideal e obtenha os primers diretos marcados com fluoróforo e o primer reverso não marcado.

Certifique-se de testar a especificidade dos iniciadores utilizando células em vórtex e lisando com o tampão de lise caseiro, pois os resultados podem variar em comparação com o uso de DNA genômico purificado. Utilizando os iniciadores marcados, realize reações de PCR fluorescente de 20 microlitros com três microlitros dos lisados diluídos para amplificar as regiões-alvo. Avalie o tamanho e as quantidades relativas dos amplicons de PCR mediante a separação de cinco microlitros dos amplicons em um gel de agarose 1%.

Para iniciar o preparo da amostra, use água livre de nucleases para diluir os amplicons de DNA selvagem e direcionado pelo CRISPR/Cas9 até uma concentração aproximada de 2,5 nanogramas por microlitro. Misture volumes iguais das amostras de DNA selvagem e direcionado diluídas. Carregue os poços de uma placa de PCR de 96 poços com nove microlitros de uma mistura de formamida desionizada e padrão de tamanho marcado com corante na proporção de 29 para 1 e um microlitro dos amplicons misturados.

Selle bem a placa e aqueça as amostras a 95 graus Celsius por três minutos em um termociclador de PCR. Imediatamente após o aquecimento, resfrie a placa em gelo por três minutos. Realize eletroforese em gel capilar com um analisador genético.

Após a conclusão da eletroforese, importe os dados para o software de análise e trace os dados. Verifique a qualidade do padrão de tamanho analisando os dados no canal de corante apropriado. Em seguida, exporte os valores do canal de corante para os controles selvagens não direcionados e clones direcionados em formato txt.

A partir deste arquivo, importe as identidades do corante, nomes dos arquivos de amostra, tamanhos dos fragmentos e valores de altura dos picos para um software de planilha eletrônica. Calcule a diferença no tamanho dos fragmentos entre o clone alvo e o controle do tipo selvagem não alvo em cada amostra. Identifique os clones com mutações de inserção/deleção que não são múltiplos de três pares de bases.

Expanda serialmente os clones selecionados a partir dos replicados armazenados. Realize sequenciamento Sanger e análise sanguínea ocidental para determinar os genótipos dos clones e verificar o status de interrupção genética dos clones. A linhagem celular de carcinoma hepatocelular HEPG2 foi alvejada com um construto CRISPR/Cas9 contra o gene Nap1L1.

Os alelos selvagens não direcionados e os alelos direcionados pelo CRISPR/Cas9 foram amplificados por PCR usando iniciadores marcados com fluoróforos verde e azul, respectivamente. Ao utilizar um protocolo de PCR fluorescente especificamente otimizado, os amplicons dos clones direcionados foram obtidos com bom rendimento. Nenhuma interferência foi observada entre os corantes fluorescentes verde e azul dentro das amostras de clones individuais.

A análise dos tamanhos dos fragmentos, determinados por eletroforese em gel capilar, revelou a deleção de um e dez pares de bases nas duas linhagens mostradas aqui. Os resultados do sequenciamento de Sanger foram consistentes com a análise de eletroforese em gel capilar. A análise de sangue periférico confirmou que as linhagens selecionadas não expressavam NAP1L1.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de rotular cuidadosamente suas amostras, pois há muitas amostras envolvidas, e também minimizar o tempo de exposição do amplicon marcado com fluoróforo, já que são sensíveis à luz. Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativa RT, análise sanguínea western e sequenciamento Sanger podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais são os genes de interesse e se foram completamente eliminados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como genotipar clones mutantes induzidos por CRISPR/Cas9 de maneira de alto rendimento, utilizando PCR fluorescente acoplada à eletroforese em gel capilar.