Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

O objetivo geral deste procedimento é dissociar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas e colocá-los em matrizes de vários eletrodos para medir e quantificar a duração e a frequência de seu sinal elétrico típico, também chamado de potencial de campo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo, como quais são as diferenças eletrofisiológicas entre cardiomiócitos portadores de mutações e controles. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a triagem de medicamentos em cardiomiócitos humanos derivados de células de pacientes.

A demonstração visual desse método é crítica. Como as etapas de dissociação e galvanização são essenciais para o registro bem-sucedido do sinal elétrico. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a identificação de sinais elétricos de boa ou má qualidade não é trivial e a análise do potencial livre requer experiência.

Para iniciar este procedimento, coloque os cavacos limpos em uma placa de Petri estéril de plástico padrão de 10 centímetros de diâmetro. Em seguida, adicione oito mililitros de água destilada estéril à placa de Petri para formar uma câmara umidificada que evitará que o pequeno volume de meio de cultura no chip se desenhe quando colocado na incubadora. Em seguida, use anéis de politetrafluoretileno personalizados para garantir o revestimento dos cardiomiócitos no centro do chip onde o conjunto de eletrodos está localizado.

Na coifa de cultura, remova os anéis do etanol. Coloque-os em uma placa de Petri estéril sem tampa e deixe os anéis secarem no capô. Em seguida, coloque um anel seco dentro de um chip MEA usando uma pinça esterilizada por chama.

Cubra os eletrodos adicionando 50 microlitros de 40 microgramas por mililitro de fibronectina dentro do anel. Depois disso, cubra a placa de Petri com a tampa e transfira cuidadosamente a placa que contém o chip MEA para uma incubadora. Em seguida, transferir a placa que contém o chip MEA para a capa de cultura de células.

Antes de usar o chip MEA, aspire 50 microlitros de fibronectina usando uma pipeta P200 ou um sistema de vácuo no exaustor sem deslocar o anel de PTFE. Certifique-se de que nenhum objeto sólido toque nos eletrodos, mantendo a ponta inclinada. Em seguida, adicione suavemente 950 microlitros de meio LI-BPEL, garantindo que ele seja distribuído uniformemente e que o anel não flutue.

Em seguida, devolva o prato à incubadora. Esta é a cultura inicial dos cardiomiócitos batendo. Em uma capa de cultura de tecidos, aspire bem o meio da cultura de hPSC-CMs.

Adicione um a dois mililitros de PBS sem cálcio e magnésio a cada poço para lavar a cultura e aspirar o PBS. Em seguida, adicione 500 microlitros da enzima de dissociação a cada poço. Incube a amostra por 5 minutos a 37 graus Celsius.

Após cinco minutos, adicione um mililitro de LI-BPEL a cada poço para diluir a enzima. Retire a monocamada de hPSC-CMs arranhando-os suavemente com uma pipeta P1000. Em seguida, recolher a suspensão celular num tubo de 15 mililitros.

Em seguida, enxágue o poço com um mililitro de LI-BPEL para coletar todas as células restantes e aglomerados de células. Adicione mais dois a três mililitros de LI-BPEL para atingir um volume final de cerca de cinco a seis milímetros e pipete suavemente para cima e para baixo três a cinco vezes com uma pipeta de cinco mililitros para dissociar os aglomerados de células. Em seguida, centrifugue as células à temperatura ambiente por três minutos a 300 vezes g.

Depois disso, remova o sobrenadante sem desalojar o pellet celular. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 250 microlitros de LI-BPEL. Em seguida, distribua 50 microlitros de suspensão de células por MEA, canalizando a suspensão de células diretamente para o centro do anel de PTFE na parte superior do feixe de eletrodos.

Transfira cuidadosamente os MEAs para a incubadora a 37 graus Celsius e deixe as células se fixarem durante a noite. Um dia após o revestimento, remova cuidadosamente o anel em um ambiente estéril usando uma pinça estéril. Enxágue o anel com etanol a 80%.

E armazene-o em um tubo de 50 mililitros contendo 80% de etanol fresco. Em seguida, remova suavemente 500 micro litros de meio do chip MEA. E adicione 500 micro litros de LI-BPEL fresco a ele.

Estes são os cardiomiócitos batendo após a remoção do anel. Em seguida, transfira os MEAs para a incubadora a 37 graus Celsius. Em seguida, meça a atividade elétrica de hPSC-CMs em MEAs a partir de um dia após a remoção do anel e até uma semana.

Agora inicie o pacote de software vinculado à configuração MEA. Em seguida, defina a temperatura para 37 graus Celsius no TCX-Control para registrar as medições. Depois disso, retire o prato que contém o chip MEA da incubadora.

Retire o chip MEA do prato e coloque-o sobre um lenço de papel para absorver a água residual. Limpe cuidadosamente o contexto externo da placa com um lenço de papel e limpe-o usando um cotonete umedecido com 100% de etanol para remover qualquer água residual ou detritos que possam causar ruído de sinal. Em seguida, transfira a placa MEA para um estágio de registro de 37 graus Celsius para detectar atividade espontânea.

Abra o MC Rack e clique em editar para carregar o hardware MEA. Para criar um novo protocolo, use o menu suspenso editar para adicionar diferentes gravadores e janelas de exibição ao protocolo. Em seguida, inicie o protocolo no modo de reprodução clicando no botão play.

Se os sinais exibirem picos R e picos T visíveis, aguarde claramente 10 a 15 minutos para concluir a fase de adaptação. Para iniciar o experimento, clique em gravar e, em seguida, reproduza e adquira dados por 10 minutos nas condições de linha de base para determinar o estado estacionário. Anote os eletrodos que tiveram o melhor sinal para que possam ser facilmente identificados e exportados posteriormente para análise.

Para uma avaliação da resposta ao medicamento, adicione concentrações crescentes do medicamento a cada 10 minutos. Clique em parar para concluir a gravação no final do protocolo. Aqui estão os traços representativos registrados com um MEA mostrando um traço de boa qualidade com picos RQ e T claramente visíveis com alta relação sinal-ruído.

Um traço de má qualidade sem picos RQ e T claramente visíveis E um traço ruidoso com picos RQ e T claramente visíveis, mas com baixa relação sinal-ruído. E aqui estão os exemplos representativos de traços de potencial de campo de boa qualidade com diferentes morfologias que podem ser registrados durante experimentos MEA usando hPSC-CMs. A área sombreada representa o intervalo QT medido durante a análise.

Uma vez que o potencial de campo no MEA se assemelha à primeira derivada do potencial de ação, a integral dos traços de potencial de campo foi calculada como demonstrações teóricas das ondas T que estão próximas das repolarizações completas do potencial de ação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o maior número de eletrodos para garantir sinais confiáveis e consistentes. Após este procedimento, outros métodos, como quanto tibial time PCR ou single cell patch clamp, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como expressão gênica específica relacionada ao fenótipo elétrico ou densidades específicas de corrente iônica.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de células-tronco explorarem arritmias cardíacas e farmacologia in vitro usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissociar e plaquear cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas nos MEAs para medições eletrofisiológicas e triagem de drogas. Não se esqueça de que trabalhar com medicamentos pode ser extremamente perigoso e precauções como o GLP padrão devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.