Name: Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a técnica de citologia de impressão não invasiva para coletar e imunofenotipar células da superfície ocular. Este método utiliza citometria de fluxo para identificar subpopulações de células T em doenças oculares.

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Os autores agradecem a Nandini Nallappan e a Sharon Yeo por ajudar com as etapas técnicas. O estudo foi financiado por um Subsídio de Início para KGC da Escola de Medicina Lee Kong Chian, da Universidade Tecnológica de Nanyang e por um Prêmio de Cientista de Clínicos Sênior do Conselho Nacional de Pesquisa Médica do Ministério da Saúde de Singapura (NMRC) para LT (NMRC / CSA / 045/2012) e por uma doação do NMRC e administrado pelo Centro Nacional de Inovação da Saúde para KGC e LT (NHIC-12D-1409007).

Todas as amostras oculares utilizadas neste estudo foram coletadas da Dry Eye Clinic no Singapore National Eye Center, aprovado pelo SingHealth Centralized Institutional Review Board e o Nanyang Technological University Institutional Review Board, em Cingapura. NOTA: Os indivíduos foram submetidos a testes clínicos para avaliar a extensão da inflamação e a gravidade da disfunção lacrimal antes da IC. Os testes clínicos incluíram o tempo de ruptura de lágrima não-invasivo (NI-TBUT) 14 e a vermelhidão conjuntival (hiperemia) 15 , 16 avaliados com um instrumento de diagnóstico, teste de Schirmer 17 , questionário padrão de avaliação de pacientes com secura (SPEED) 18 e córnea Manchas 19 . 1. Coleta de amostras oculares por IC <ol><li> Após a determinação do estado clínico, anestesiarOs olhos do participante aplicando 1 a 2 gotas de anestesia tópica, cloridrato de proparacaina, a conjuntiva bulbar superior e fórnix inferior. Aguarde 4 a 5 minutos para que a sensação de ardência do anestésico se desgaste. </li><li> Coletar amostras de conjuntiva bulbar nasal e temporal com dois dispositivos de citologia de impressão. NOTA: Um dispositivo é usado para a coleta de duas amostras de impressão. Aqui, foram utilizados dois dispositivos para a coleta de quatro membranas de impressão. <ol><li> Posicione o dispositivo de citação de impressão tangencialmente na conjuntiva. Pressione o botão suavemente e segure por 2 a 3 s. NOTA: O dispositivo vem com a membrana. A pressão é liberada automaticamente depois de pressionar o botão. Demora apenas alguns segundos para liberar a pressão e remover o dispositivo. </li></ol></li><li> Libere a membrana para um tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de meio de cultura (meio do Instituto Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% de soro bovino fetal(FBS) + 1% de penicilina-estreptomicina (Pen Strep)) por um bisturi. </li><li> Isolar células da membrana do dispositivo por raspagem contínua durante cerca de 1 min com uma ponta de pipeta de 10 μL. NOTA: A raspagem é completada quando a superfície da membrana se torna desigual. Os números das células de cada membrana são variáveis ​​(100 a 500 células / membrana). Processe as amostras dentro de 2 a 3 horas de coleta. </li></ol> 2. Imunophenotyping Cells por Citometria de Fluxo <ol><li> Centrifugue as células a 400 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente para remover a mídia. Ressuspender o sedimento celular com 50 μL de tampão de coloração por citometria de fluxo (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 0,05% de albumina de soro bovino (BSA)). </li><li> As células manchadas com um painel de anticorpos ( p . Ex. , Violeta brilhante CD3 (BV) 510 (UCHT1), CD4 aloficocianina-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 ficoeritrina (PE) -A, CD45RO PE-cianina 7 (PE- Cy7) -A e marca de célula viva / morte 7-ADD) à temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos noSombrio. Use anticorpos diretamente do estoque de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: Para a concentração de anticorpos, use 2,5 μL de CD3-BV510, 1,25 μL de CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD e 10 μL de CCR7-PE. Use células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) para avaliar as diferentes concentrações de anticorpos. Para a titulação, tome a concentração de anticorpos mencionada no protocolo do fabricante e use metade e um quarto da concentração recomendada. Use a concentração mínima de anticorpos para evitar o derramamento em outros canais de fluoroquromo. Foram observados sinais claros com as mencionadas concentrações de anticorpos. A compensação foi realizada testando PBMC inicialmente de acordo com o protocolo mencionado em Williams et al . 20 Para o teste, as PBMCs foram incubadas com o mesmo conjunto de anticorpos usados ​​aqui e compensados ​​pela comparação de manchas de anticorpos únicos e múltiplos. </li><li> Após a incubação periOd, adicione 1 mL de tampão de coloração ao tubo, misture bem e centrifugue a 450 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente. Ressuspender células em 200 μL de tampão de coloração. </li><li> Execute amostras em uma máquina de citometria de fluxo. <ol><li> Antes de adquirir os dados, calibre as tensões do canal do citometro de fluxo com os conjuntos de configuração e rastreamento (CS &amp; T) do citómetro para normalizar a aquisição de dados em dias diferentes de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Abra o software de coleta de dados de citometria de fluxo, clique no botão &quot;Configurar e QC&quot;, escolha o número correto do lote de notas CS &amp; T, carregue as contas e clique no botão &quot;Iniciar&quot;. </li></ol></li><li> Ressuspenda as células com um toque suave no tubo antes de colocar as amostras na máquina. Abra o software de coleta de dados e clique em &quot;Visualizar&quot;. Quando a taxa de limiar é estável, clique em &quot;Adquirir&quot;. Monitorize o nível da amostra e clique em &quot;Parar&quot; quando as amostras estiverem esgotadas. NOTA: Adquira 10.000 eventos por amostra. </lI&gt; <li> Depois de adquirir 10.000 eventos, gere um traço de pontos SSC-A e FSC-A na planilha. <ol><li> Clique no botão &quot;Polygon Gate&quot; e desenhe um gate (este é P1) em todos os eventos com um valor FSC-A&gt; 5 x 10 4 para excluir detritos. Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse no ponto, escolha &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot; e, em seguida, escolha &quot;P1&quot;. Clique no FSC-A no eixo x do gráfico de ponto P1, altere-o para CD3-BV510. Desenhe um &#39;&#39; Portão de polígono &#39;&#39; para escolher a população de CD3 + e nomeie-o &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse, selecione &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot;. Clique no FSC-A no eixo x do gráfico de pontos P2 e altere-o para 7-AAD. Desenhe um &#39;&#39; Portão de polígono &#39;&#39; para 7-AAD - população e escolha &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 aqui é CD3 +Células vivas. </li><li> Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse, selecione &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot;. Clique no CD3-BV510 no eixo x e CD4-APCH7 no eixo y do gráfico de pontos P3. Desenhe retângulo Gates nos lados superior e inferior do quadrante e escolha &#39;&#39; P4 &#39;&#39; e &#39;&#39; P5 &#39;&#39;, respectivamente. P4 é CD3 + CD4 + ao vivo e P5 são células CD4 + CD4 CD ao vivo. </li><li> Clique no botão &quot;Criar gráfico de pontos&quot; para gerar um novo gráfico de pontos, clique com o botão direito do mouse, selecione &quot;Propriedades&quot; para abrir a janela &quot;Plot Editor&quot;. Clique no CD45RO PE-Cy7 no eixo dos x e no CCR7-PE no eixo y das parcelas P4 e P5. Desenhe &#39;&#39; Quad Gate &#39;&#39; neste gráfico de pontos. NOTA: o lado superior esquerdo, o lado superior direito, o lado inferior direito e os quadrantes inferiores do lado esquerdo aqui são ingênuos, memória central (T CM ), eMemória de ffector (T EM ), células T de efetores diferenciadas (T EMRA ), respectivamente. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Esta é uma técnica fácil, rápida e menos invasiva que pode ser usada nas clínicas ambulatoriais para o perfil imune relativamente rápido, em contraste com as técnicas convencionais, como raspagem, esfregão, pipetagem ou papel filtrante absorvente 1 , 2 . Uma variante desta técnica já está sendo usada em configurações de pesquisa 22 . A aplicação futura da metodologia proposta é para a estratificação do paciente em ensaios clínicos com doenças oculares, especialmente aqueles que requerem imunofenotipagem. Um grande desafio com esta técnica é o número relativamente pequeno de células imunes recuperadas após a coleta e raspagem de impressões. O número total de células T CD3 + recuperadas de quatro impressões por indivíduo variou de ~ 500 a 1000 células. As amostras oculares foram lavadas antes da análise de citometria de fluxo por um número mínimo de vezes para evitar uma perda adicional de célulasS. Os passos críticos e os desafios que permanecem dentro do protocolo são a coleta eficiente de amostras oculares e a raspagem adequada da membrana para atingir números celulares mais elevados. No entanto, é improvável que esta limitação se incline em direção a qualquer fenótipo imune específico. A solução de problemas realizada aqui para maximizar o rendimento das células foi reduzir o número de etapas de lavagem após e antes da incubação de anticorpos. Existem outras limitações para o uso de IC. Em pacientes com superfície ocular gravemente queratinizada ou fibrosa, como na síndrome de Steven Johnson, o rendimento celular pode ser ainda menor que no presente estudo. A proporção de células imunes pode mudar se as amostras forem armazenadas em vez de analisadas no mesmo dia. É difícil prever se determinados tipos de células são mais resistentes ao armazenamento do que outros. Estudos anteriores relataram níveis elevados de expressão de HLA-DR nas células epiteliais conjuntivais 23 , por isso seria interPara avaliar a correlação entre HLA-DR e níveis de células imunes específicas. As células imunes também podem estar associadas ao nível de expressão das quimiocinas. Essas questões devem ser abordadas em estudos futuros.

A citologia de impressão (IC) foi realizada pela primeira vez em 1977 por Thatcher et al . 1 . Eles usaram um disco de impressão plástica para coletar células conjuntivais de pacientes em vez de outras técnicas disponíveis naquela época, como raspagem, esfregaço ou pipetagem 1 . A técnica atual de IC usa um papel de filtro absorvente 2 para imprimir a conjuntiva bulbar e palpebral e coletar a camada mais superficial de células conjuntivais. Essas células, tendo alcançado seu estágio final de diferenciação, são continuamente lançadas em lágrimas 3 . Três grandes populações de células são encontradas em espécimes de IC: células epiteliais 4 , células de cálice 3 , 5 e tecido linfóide associado à mucosa, por exemplo, células T efectoras associadas ao epitélio ou células dendríticas 6 . Células de superfície ocular em IC samAs células podem ser analisadas por microscopia, imunocomposição e reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) 7 . A citometria de fluxo foi recentemente usada para analisar células imunes coletadas por raspagem da membrana IC 8 . Curiosamente, IC 6 , 9 tem sido usado para avaliar muitas doenças da superfície ocular, incluindo sicca de ceratoconjuntivite, deficiência de vitamina A, penfigóto cicatricial, doença atópica, ceratoconjuntivite limbica superior, ceratoconjuntivite vernal e metaplasia escamosa epitelial. O IC também tem sido utilizado para avaliar o impacto do uso de lentes de contato, a detecção de micróbios de superfície ocular e o teste de eficácia terapêutica e tolerância de intervenções terapêuticas em estudos longitudinais 10 , 11 , 12 . O dispositivo médico (EyePrim) é suportado por um tipo de poliA membrana de ethersulfona (PES) de 0,2 μm, que foi previamente validada para a técnica de citologia de impressão ocular com citometria de fluxo (fluxo de OSIC) e abre oportunidades para usar amostras longitudinais para monitorar a progressão da doença e a resposta ao tratamento ( por exemplo , a detalhada Análise de leucócitos intraepiteliais definidos como marcadores de doença putativos para fibrose conjuntival progressiva em penfigóide de mucosas) 13 . Os primeiros pesquisadores usaram filtros de PES autoclavados que exigiam impressão manual. Como resultado, o rendimento era variável e dependente do usuário. A vantagem deste dispositivo médico é a facilidade de uso, a pressão padronizada (Pa ou N / m 2 ), e permite a repetibilidade, reprodutibilidade e recuperação celular constante. Esta técnica é útil em uma clínica ambulatorial porque não é cirúrgica, fácil de executar e rápida. Este é um dispositivo médico Classe I (estéril) de acordo com a diretiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Exige apenasS anestesia tópica durante o procedimento, o que garante a manutenção da integridade da superfície ocular. Após IC, as células podem ser processadas imediatamente para citometria de fluxo. Além disso, é possível que técnicos e enfermeiros que não sejam oftalmologistas sejam treinados para provar a superfície ocular. Apesar da melhoria do IC sobre outras técnicas, ainda existem vários desafios. Por exemplo, pode haver variação devido à área da amostragem e diferenças regionais na conjuntiva bulbar dependendo da posição do IC. Outra fonte de variação é devido à aplicação de diferentes quantidades de pressão durante IC. Outras questões metodológicas envolvem a padronização do processamento celular: envolvem duração e método de fixação e as condições de armazenamento possível, o que pode afetar a estabilidade do material amostrado. O objetivo geral desta técnica é desenvolver um método de isolamento das amostras de impressão ocular queT é fácil de usar, não invasivo e pode ser aplicado à caracterização imunológica das amostras clínicas.

<table><tbody><tr><td><reagentes>fortes</fortes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-humanos CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-humanos CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-humanos CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>solução 7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia local</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fluoresceína sódica</td><td>Bausch & Lomb UK Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de fenda BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSSergua de análise</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da conjuntiva

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Tradicionalmente, a citologia de superfície ocular é estudada com técnicas como tecnologia de espátula e tecnologia de escova. O problema com estas técnicas é que eles podem induzir lesões traumáticas na superfície do olho, que podem progredir para cicatrizes, deformidades das pálpebras, deficiência de células estaminais e, em alguns casos, causar grande desconforto ao sujeito. Para evitar esses problemas clínicos, a citologia de impressão (IC) foi desenvolvida para diagnosticar doença ocular seca e posterior neoplasia, doença atópica, ceratoconjuntivite vernal e ceratoconjuntivite sicca. Normalmente, os clínicos cortaram manualmente os papéis de filtro em formas necessárias e aplicam-nas na superfície ocular. Aqui, descrevemos como realizar IC usando um dispositivo médico comercialmente disponível. Esta técnica é explicada aqui seguida pela imunofenotipagem por citometria de fluxo. Esta técnica requer menos manuseio manual e causa menor prejuízo para a superfície ocular.

IC por este dispositivo clínico nos permitiu isolar células imunes superficiais oculares, mantendo a superfície ocular intacta. A Figura 1 descreve como o IC foi realizado. Os diferentes locais do olho de onde as amostras foram coletadas são marcados. A Figura 2 mostra o resultado representativo da citometria de fluxo coletada de 10 controles saudáveis. Para o bloqueio, use SSC e 7-AAD para distinguir entre células vivas e células mortas. As células 7-AAD são identificadas como células vivas. Essas células vivas são ainda caracterizadas por marcadores CD3 + e CD4 + . Além disso, as populações CD4 + e CD4 foram ainda mais caracterizadas como Naïve, T EM , T CM e T EMRA com os marcadores CCR7 e CD45RO. Entre as células T CD3 +, as células T de memória efector predominam na superfície ocular humana. No anterior eXperimentos, também foi demonstrado que as células de memória CD8 + são as principais populações nas células T epiteliais conjuntivais entre os indivíduos saudáveis 20 . A Figura 3 mostra que as células T de memória efetora CD4 + e CD8 + (T EM e T EMRA ) são o subconjunto principal na superfície ocular humana em 10 controles saudáveis ​​estudados. Cada população mencionada na figura é notificada com seu marcador fenotípico e nomes (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). Os números em vermelho indicam a porcentagem da população. Os dados nesta figura são representados como média ± SEM <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Figura 1: Recolha de amostras de IC da superfície ocular pelo dispositivo de citologia de impressão. As amostras foram coletadas da lâmpada temporalComo é mostrado. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Figura 2: Dot Plot Graph usando Citometria de Fluxo. As células Live 7-AAD foram selecionadas. As células CD3 + foram primeiro fechadas e, em seguida, esta população foi fechada em subconjuntos CD4 + e CD4. As proporções de subconjuntos naïve (CCR7 + CD45RO - ), memória central (CCR7 + CD45RO + ) e efector memory (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) foram determinadas com a ajuda dos marcadores CCR7 e CD45RO. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FFigura 3: Sub-tipos de células imunes em células T CD4 + e CD8 + de Superfície Ocular Humana Saudável. Distribuição de subconjuntos conjuntivais CD4 + e CD8 + naïve, memória central (T CM ) e efetor (T EM e T EMRA ) em controles humanos saudáveis; Cada ponto de dados representa uma média individual separada ± SEM mostrada. A porcentagem da população é marcada como vermelha abaixo do nome de cada uma das populações. A porcentagem total da população é de 98%, porque a população de CD4 + T EMRA não foi incluída no diagrama de dispersão mencionado (modificado de Bose et al., 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

A superfície ocular normal exposta consiste em córnea e conjuntiva. As células epiteliais, as células caliciformes e as células imunes estão presentes na conjuntiva. Aqui, uma técnica não invasiva de citologia de impressão é descrita usando um dispositivo de citação de impressão e citometria de fluxo para analisar células imunes na conjuntiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

O objetivo geral desta técnica de citologia por impressão é obter um número suficiente de células para determinar imunologicamente o fenótipo das células envolvidas em doenças da superfície ocular. Este método pode ajudar a responder perguntas na área da superfície ocular, como quais células imunes são importantes para a inflamação da superfície ocular. As principais vantagens desta técnica são seu caráter relativamente não invasivo e a simplicidade para realização na clínica e no laboratório.As implicações desta técnica estendem-se à terapia de distúrbios inflamatórios da superfície ocular, pois permitem a identificação de populações específicas de células imunes. Este método pode fornecer informações sobre a população de células imunes da superfície ocular. Também pode ser aplicado à investigação da toxicologia ocular e da fibrose ocular.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à falta de experiência no manuseio do pequeno número de células coletadas do olho. Após determinar o estado clínico do participante, aplique uma a duas gotas de anestésico tópico na conjuntiva bulbar superior e no fórnice inferior dos olhos do participante. Aguarde quatro a cinco minutos para que a sensação de ardência do anestésico desapareça.Em seguida, posicione um dispositivo de citologia por impressão tangencialmente sobre a conjuntiva no lado bulbar temporal e pressione suavemente o botão de pressão, mantendo-o por dois a três segundos. Usando pinça, libere a membrana ocular colhida em um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de meio de cultura, seguido por um minuto de raspagem contínua da membrana com uma ponteira de pipeta de 10 microlitros para recuperar o restante das células do dispositivo. Tenha cuidado ao raspar a membrana, pois uma raspagem excessiva resultará em uma combinação de detritos, enquanto uma raspagem insuficiente pode resultar em baixo aproveitamento celular.Quando a superfície da membrana ficar irregular, repita uma segunda coleta do mesmo olho no lado nasal do olho, conforme acabou de ser demonstrado. Puxe as células com a suspensão da primeira amostra ocular e colete duas amostras do outro olho do participante. Dentro de duas a três horas após a coleta, centrifugue as células oculares e re-suspenda o pellet em 50 microlitros de tampão de marcação para citometria de fluxo, contendo solução salina tamponada com fosfato suplementada com 0,05% de albúmina sérica bovina.Em seguida, marque as células com um painel dos anticorpos de interesse por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz. Ao final da incubação, lave as células com um mililitro de tampão de marcação e re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de marcação fresco. Calibre as voltagens dos canais do citômetro de fluxo no painel de configuração do citômetro e prepare um tubo com microesferas de rastreamento para normalizar a aquisição de dados de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, no software de coleta de dados de citometria de fluxo, clique em Configurar QC e selecione o lote correto de microesferas para configuração e rastreamento do citômetro. Carregue as microesferas e clique no botão Iniciar. Agora, re-suspenda a suspensão celular com batidas suaves e coloque o tubo na máquina.Abra o software de coleta de dados e clique em Visualizar. Quando a Taxa de Limiar estiver estável, clique em Adquirir. Monitore o nível da amostra, clicando em Parar quando a amostra acabar.Após adquirir 10.000 eventos, gere um gráfico de dispersão de área de dispersão para a frente versus dispersão lateral e use a ferramenta de seleção poligonal para desenhar uma porta populacional sobre todos os eventos com um valor de área de dispersão para a frente maior que cinco vezes 10 elevado à quarta potência, a fim de excluir os detritos. Clique em Criar Gráfico de Dispersão para gerar um novo gráfico de dispersão. Clique com o botão direito no gráfico e escolha Propriedades para abrir a janela do Editor de Gráficos.Selecione P1 e clique na área de dispersão para a frente no eixo x para alterar o eixo exibido para CD3. Abra um novo gráfico de pontos para a população P2 e altere o eixo x para 7-AAD. Desenhe um quadrante ao redor da população negativa para 7-AAD para selecionar as células viáveis positivas para CD3.Nomeie este gate de P3 e abra um novo gráfico de dispersão. Na janela do Editor de Gráficos, selecione CD3 para o eixo x e CD4 para o eixo y. Agora, utilize as populações P4 e P5 para abrir dois novos gráficos de dispersão e configure os eixos x para exibir células positivas para CD45RO e os eixos y para exibir células positivas para CCR7 em cada gráfico.Em seguida, crie uma porta P6 ao redor das células positivas para CD3, positivas para CD4, positivas para CCR7 e positivas para CD45RO, e as portas P7, P8 e P9 ao redor das células positivas para CD3, negativas para CD4, positivas para CCR7, positivas para CD45RO; negativas para CD45RO, negativas para CCR7, negativas para CD4, positivas para CD3; e positivas para CD45RO, negativas para CCR7, negativas para CD4, positivas para CD3, respectivamente. As populações positivas para CD4 e negativas para CD4 podem ser caracterizadas como células T de memória central positivas para CD45RO e positivas para CCR7, e células T de memória efetora positivas para CD45RO e negativas para CCR7.E CD45RO negativo, CCR7 negativo, T de memória efetora diferenciado terminalmente de acordo com a expressão dos marcadores CCR7 e CD45RO. Desses subconjuntos, os linfócitos T de memória efetora positivos para CD4 e positivos para CD8 são a principal subpopulação de linfócitos T normalmente observada na superfície ocular de humanos saudáveis. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em até duas horas, se realizada corretamente.Ao realizar isso, outros procedimentos, como ELISA, Western blot e outros estudos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre as citocinas e os genes envolvidos na via de sinalização. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de estudos da superfície ocular avaliar os diferentes tipos de células imunes dentro de uma população específica de pacientes de interesse. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a citologia por impressão e como isolar e processar células imunes da superfície ocular.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve uma técnica baseada em swab para isolar bactérias comensais viáveis da conjuntiva ocular. A técnica pode ser usada para traçar o perfil do microbioma bacteriano comensal da conjuntiva, que desempenha um papel defensivo contra patógenos.

Isolamento de bactérias comensais conjuntivais à base de swab: uma técnica para isolar bactérias comensais da conjuntiva do modelo murino

Neste vídeo, mostramos um procedimento para obter células epiteliais pigmentares oculares de um modelo de coelho. As células são úteis no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças degenerativas da retina.

Isolando células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentares oculares do olho de coelho

Coletamos, coramos e fotografamos células da conjuntiva da margem interna da pálpebra de seres humanos. Ao caracterizar a morfologia celular e a atividade metabólica, este método pode aprofundar nossa compreensão do olho seco e do papel que o atrito entre as superfícies oculares pode desempenhar na percepção do desconforto ocular.

A citologia de impressão da Área Wiper a tampa

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

Este protocolo descreve um método para o isolamento do globo ocular do rato com pálpebra, superfície ocular, segmentos anterior e posterior em posição relativamente intacta.

Isolação do globo ocular intacto para obter o tecido integral da superfície da ocular para a examinação histológica e immunohistochemistry

Apresentada aqui é uma plataforma microscópica multifotípica para imagens de superfície ocular de rato vivo. O camundongo transgênico fluorescente permite a visualização de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nervosas e capilares dentro da superfície ocular. Sinais de segunda geração harmônica não lineares derivados de estruturas colágenas fornecem imagens sem rótulos para arquiteturas estromais.

Uma plataforma personalizada de microscopia multifotn para imagens ao vivo de córnea de rato e conjuntiva

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

O meio livre de vermelho fenol/soro fetal bovino é uma opção melhor do que o RPMI avançado para eliminar hormônios exógenos sem alterar a função normal das células caliciformes da conjuntiva no estudo de diferenças baseadas no sexo.

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Aprenda a técnica de citologia de impressão não invasiva para coletar e imunofenotipar células da superfície ocular. Este método utiliza citometria de fluxo para identificar subpopulações de células T em doenças oculares.

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