Um modelo crônico de Rato de olho seco autoimune com aumento de células de memória E Effect no tecido do globo ocular
7 de junho de 2017
Este relatório descreve um método para induzir o olho seco autoimune experimental crônico em ratos Lewis através da imunização com uma emulsão de extrato da glândula lacrimal de rato, ovalbumina e adjuvante completo de Freund, seguido da injeção de extrato da glândula lacrimal e ovalbumina na subconjunctiva forniceal e glândulas lacrimais Seis semanas depois.
O objetivo geral deste procedimento é induzir características clínicas de disfunção lacrimal e inflamação da glândula lacrimal em ratos usando imunização subcutânea e injeção subconjuntival e intralacrimal de extratos de glândulas lacrimais para avaliação de terapias em olho seco autoimune. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no olho seco, como se os medicamentos que suprimem as células T na doença autoimune são eficazes. A principal vantagem desta técnica, ela produz sinais de doença ocular semelhantes ao olho seco humano e também quantifica as células T que se infiltram na glândula lacrimal e no olho.
As implicações desse modelo animal se estendem para a compreensão do tráfego de linfócitos porque o baço e os gânglios linfáticos podem ser estudados. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à falta de instrumentação adequada para documentar mudanças no olho de rato pequeno. A demonstração visual desse método é crítica, pois certas etapas são difíceis de aprender devido à rápida secagem do olho do rato e à falta de piscadas após a anestesia.
Depois de sacrificar uma rata Sprague Dawley fêmea de acordo com o protocolo de texto, coloque o animal deitado com uma orelha contra a mesa e a outra voltada para cima. Com uma tesoura, faça uma incisão de 10 milímetros superior-inferiormente sob a orelha exposta. Em seguida, remova a glândula lacrimal dissecando-a do tecido conjuntivo circundante e do ducto de drenagem.
Em seguida, usando uma tesoura, pique o tecido o mais finamente possível no gelo. Em seguida, adicione 150 microlitros de PBS com inibidor de protease 1X por glândula lacrimal. Com o sonicador ajustado para 10 segundos ligado, 10 segundos desligado e amplitude de 30%, sonice as amostras no gelo a 20 kilohertz por cinco minutos.
Em seguida, centrifugue as amostras sonicadas a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Em seguida, alíquota do sobrenadante para tubos de 1,5 mililitro e armazene-os a 80 graus Celsius negativos.
Transferir o adjuvante de Freund completo contendo cinco miligramas por mililitro de Mycobacterium tuberculosis H37Ra ou o adjuvante de Freund incompleto para um tubo de 50 mililitros, garantindo que o volume do adjuvante à mistura de antigénios está na proporção de um para um. Adicione a mistura de antígenos contendo dois miligramas por mililitro de ovalbumina e 10 miligramas por mililitro de extrato de glândula lacrimal gota a gota à solução adjuvante durante o vórtice com a velocidade mais alta que não resulte em derramamento. Continue o vórtice por cinco minutos depois que todo o antígeno tiver sido adicionado.
Transfira a emulsão para uma seringa de cinco mililitros e use um conector de seringa para conectá-la a outra seringa de cinco mililitros. Em seguida, empurre a emulsão de uma seringa para a outra para misturá-la. No dia zero, distribua 200 microlitros da emulsão, que contém um miligrama de extrato de glândula lacrimal e 200 microgramas de ovalbumina em adjuvante completo de Freund, em seringas Luer lock de um mililitro e equipe as seringas com agulhas de calibre 27
.Sem usar anestesia, injete subcutaneamente a emulsão na base das caudas dos ratos. Então, no dia 14, de maneira semelhante, injete 200 microlitros do mesmo antígeno no adjuvante de Freund incompleto. No mesmo dia, injetar intraperitonealmente 300 nanogramas de toxina pertussis em 100 microlitros de PBS.
No dia 48, pesar a quantidade necessária de ovalbumina e dissolvê-la em PBS. Em seguida, combine a ovalbumina com o extrato de glândula lacrimal descongelado preparado anteriormente neste vídeo, fazendo uma solução de antígeno contendo um miligrama por mililitro de ovalbumina e um miligrama por mililitro de extrato de glândula lacrimal. Depois de anestesiar o rato, injete cinco microlitros de antígeno na subconjuntiva forniceal do olho.
Em seguida, injete 20 microlitros de antígeno na glândula lacrimal. Enquanto segura um rato anestesiado de acordo com o protocolo de texto, para medir o volume lacrimal com fio vermelho de fenol, use um par de pinças para segurar o fio e outro para puxar a pálpebra inferior do rato. Coloque a linha no canto proximal do fórnice inferior por um minuto e, em seguida, remova a linha.
Em seguida, coloque a linha ao lado de uma régua com marcações milimétricas e tire uma imagem do comprimento da parte molhada da linha. Para medir a suavidade do rasgo da córnea, coloque o rato sob um microscópio estéreo equipado com um iluminador de anel e uma câmera. Em seguida, aplique cinco microlitros de solução salina na córnea do rato.
Com os dedos enluvados, pisque passivamente movendo as pálpebras superior e inferior aproximadamente cinco vezes para espalhar a solução salina. Com ampliação de 1,6 vezes, concentre o iluminador do anel no meio da superfície da córnea. Em seguida, após 10 segundos, adquira imagens fotográficas.
Use a varredura de fluoresceína para medir os danos à córnea adicionando dois microlitros de 0,2% de fluoresceína à córnea do rato. Com um dedo enluvado, abra e feche passivamente as pálpebras do rato três vezes para espalhar o corante de fluoresceína na superfície do olho. Após um minuto, use uma seringa de três mililitros para extrair um mililitro de solução salina.
Em seguida, posicione a seringa cerca de dois a três milímetros antes da córnea e aplique suavemente solução salina no olho. Com a luz de fundo desligada, adquira imagens sob o filtro azul cobalto de um microscópio de imagem ocular. Após a eutanásia do rato de acordo com o protocolo de texto, use uma tesoura para remover as pálpebras superiores e inferiores.
Liberte o globo cortando os músculos extraoculares, o nervo óptico e a conjuntiva forniceal. Faça uma incisão para abrir o globo ocular. Remova a lente no vítreo.
Em seguida, coloque os globos oculares dissecados em tubos de 1,5 mililitro no gelo. Por fim, colete as glândulas lacrimais conforme descrito anteriormente neste vídeo. Esta figura mostra imagens representativas de fios vermelhos de fenol de ratos controle e DED.
O comprimento dos fios de fenol vermelho no grupo DED é menor do que no grupo controle, indicando menor volume de lágrima. A fluoresceína se liga ao epitélio da córnea danificado e, portanto, é usada para medir a extensão do dano. Neste experimento, manchas de fluoresceína na superfície da córnea de ratos DED foram classificadas de zero a dois e comparadas com ratos controle.
Ratos com DED têm mais coloração de fluoresceína do que ratos controle, sugerindo danos à córnea. Como visto aqui, se a superfície da córnea for lisa com alta estabilidade ao rasgo, a imagem do anel iluminador na superfície ocular é redonda e perfeita. A distorção da imagem indica redução da suavidade da córnea e um filme lacrimal instável, como foi observado em maior grau de distorção no grupo DED.
Esta análise de citometria de fluxo mostra que o subconjunto de células T predominante nos tecidos normais do globo ocular de ratos são as células T de memória efetora. Nos globos oculares de ratos DED, aproximadamente 70% das células T CD3-positivas são células T de memória efetora, enquanto em ratos de controle esse número é de aproximadamente 50% Os globos oculares de ratos DED têm células T de memória efetora significativamente maiores do que as de ratos controle. Após este procedimento, a coloração para outros tipos de células imunológicas pode ser realizada para responder a perguntas adicionais.
Por exemplo, você pode corar para células imunes inatas ou linfócitos B. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores entenderem a imunologia da superfície ocular e, além disso, estudarem o olho seco em humanos e a síndrome de Sjögren. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir olho seco autoimune em ratos e realizar uma documentação robusta dos resultados.
Visão Geral
Este relato descreve um método para induzir olho seco autoimune experimental crônico em ratos Lewis por meio de imunização com uma emulsão de extrato de glândula lacrimal de rato, ovalbumina e adjuvante completo de Freund. O procedimento tem como objetivo replicar características clínicas de disfunção lacrimal e inflamação da glândula lacrimal para avaliação terapêutica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oftalmologia
- Imunologia
Contexto
- A síndrome do olho seco crônico é uma condição comum que afeta a produção de lágrimas.
- Modelos animais são essenciais para o estudo de doenças autoimunes.
- Este método permite a avaliação de terapias direcionadas à supressão de células T.
- Compreender o tráfego de linfócitos é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos.
Objetivo do Estudo
- Induzir características clínicas de olho seco em ratos.
- Avaliar a eficácia de fármacos em condições autoimunes.
- Quantificar a infiltração de linfócitos T na glândula lacrimal e no olho.
Métodos Utilizados
- Imunização subcutânea com extrato da glândula lacrimal e ovalbumina.
- Injeções subconjuntival e intra-glândula lacrimal de antígeno.
- Medição do volume de lágrima e dano corneano utilizando fluoresceína.
- Dissecação e preparação das glândulas lacrimais para análise.
Resultados Principais
- Induziu sinais de doença ocular semelhantes ao olho seco humano.
- Quantificou a infiltração de linfócitos T nas glândulas lacrimais.
- Demonstrou redução no volume lacrimal no grupo experimental.
- Mostrou dano corneano utilizando coloração com fluoresceína.
Conclusões
- Este modelo é eficaz para o estudo do olho seco autoimune.
- Ele fornece informações sobre os mecanismos do tráfego de linfócitos.
- A documentação visual é fundamental para a implementação bem-sucedida.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo crônico de olho seco autoimune em ratos permite a redução de riscos mecanicistas de terapêuticas direcionadas a linfócitos T, por meio da replicação da inflamação da superfície ocular semelhante à humana e da quantificação da infiltração de linfócitos T de memória efetora no tecido do globo ocular. Ele auxilia na validação de alvos e no desenvolvimento de modelos pré-clínicos para o olho seco autoimune e a síndrome de Sjögren, fornecendo um sistema relevante à doença para avaliar compostos imunomoduladores antes da transição clínica. A capacidade do modelo de medir o tráfego de células imunes e os danos à córnea oferece confiança preditiva na identificação de fármacos líderes e na triagem de portfólios para imunoterapias oftálmicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da modelagem de olho seco autoimune mediante imunização com extrato de glândula lacrimal, permitindo a validação funcional da patologia mediada por linfócitos T.
- Valor Operacional: Fornece um sistema reprodutível para quantificar linfócitos T CD3+ de memória efetora em tecido do globo ocular por citometria de fluxo, apoiando estudos de engajamento de alvo e mecanismo de ação.
- Biomarcador Traduzível: O acúmulo de linfócitos T de memória efetora atua como uma leitura farmacodinâmica para avaliar a eficácia de fármacos imunomoduladores em ambientes pré-clínicos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Leituras padronizadas, incluindo a medição do volume lacrimal com fio de fenol vermelho e pontuação de danos corneanos baseada em fluoresceína, permitem triagem quantitativa de compostos.
- Reprodutibilidade: Um cronograma definido de imunização e reforço garante indução consistente da doença entre coortes, apoiando a padronização do ensaio para avaliação terapêutica.
- Escalabilidade: O uso de seringas, sonicação e protocolos de centrifugação permite o processamento em lote de extratos de glândula lacrimal, facilitando a replicação do modelo em campanhas de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para a Doença: O modelo reproduz características clínicas essenciais do olho seco humano—redução da produção lacrimal, instabilidade do filme lacrimal e dano corneano—o que sustenta a continuidade translacional.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação do tráfego de linfócitos e da infiltração de células imunes oculares, reduzindo riscos em alvos envolvidos na patogênese autoimune.
- Avanço Ajustado ao Risco: Dados de perfil imunológico orientam decisões de avançar ou não ao associar a modulação do alvo à redução de células T de memória efetora e à melhora dos sintomas clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para imunomoduladores e biológicos que visam a inflamação da superfície ocular.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos autoimunes ao induzir inflamação da glândula lacrimal e infiltração de linfócitos T por meio de imunização específica para antígeno.
- Triagem: Permite avaliação quantitativa do volume lacrimal e da integridade corneana, fornecendo desfechos escalonáveis para triagem de bibliotecas de compostos.
- Análises: A citometria de fluxo e a coloração com fluoresceína fornecem leituras quantitativas da resposta imune e de danos teciduais, apoiando análises comparativas entre grupos tratados.
- Pesquisa Translacional: Relaciona respostas imunes oculares à patologia humana do olho seco, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a validação pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Protocolos padronizados de preparação de antígenos, imunização e processamento de tecidos permitem reutilização em múltiplos programas terapêuticos nas áreas de imunologia e oftalmologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da quantificação de linfócitos T de memória efetora e fenótipos clínicos de olho seco.
- Valor Operacional: Imunização padronizada, processamento de tecidos e mensuração de desfechos garantem reprodutibilidade entre diferentes locais e estudos.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais precisas de avançar/não avançar ao associar o mecanismo imunomodulador à redução de linfócitos T patogênicos e à melhora dos sintomas clínicos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de candidatos com base na eficácia da modulação imunológica e nos perfis de proteção corneana.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia de roedores, manipulação ocular e citometria de fluxo para análise de células imunes.
- Depende da sonicação, centrifugação e preparação estéril de seringas para a geração da emulsão antigênica.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao tempo de imunização, dosagem de antígeno e coleta de tecidos para garantir a consistência do modelo.
- As considerações para adaptação incluem a seleção de linhagem (ratos Lewis), obtenção de antígenos e protocolos de anestesia para injeções e medições oculares.
- As limitações práticas incluem a dificuldade técnica das medições oculares devido à rápida desidratação do olho e à ausência de piscar após a anestesia, exigindo treinamento visual e imagens padronizadas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
8:57
Conclusion
7:19
Results
1:18
Preparation of Lacrimal Gland Extract
2:32
Preparation of Emulsion
3:30
Immunization of Lewis Rats and Injection of Antigen Mixture into the Forniceal Subconjunctiva and Lacrimal Gland
4:53
Assessment of Dry Eye Features
