Usando transmissão óptica extraordinária para quantificar biomarcadores cardíacos no soro humano
13 de dezembro de 2017
Este trabalho descreve um método de litografia de nanoimprinting para fabricar matrizes de sensoriamento de alta qualidade que funcionam no princípio de transmissão óptica extraordinária. O biosensor é de baixo custo, robusto e fácil de usar e pode detectar troponina cardíaca eu no soro em concentrações clinicamente relevantes (99th percentil corte ∼10-400 pg/mL, dependendo do ensaio).
O objetivo geral desta técnica é medir biomarcadores presentes em um fundo de fluido biológico complexo em concentrações clinicamente relevantes em um ambiente de ponto de atendimento sem a necessidade de configurações ópticas ou elétricas elaboradas. Este método pode ajudar a tornar os biossensores baseados em transmissão extraordinária uma realidade em cenários de ponto de atendimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela não precisa de configurações elétricas ou ópticas complicadas.
Em nossos experimentos, ele pode detectar biomarcadores de forma confiável em concentrações clinicamente relevantes. A fabricação do chip sensor é realizada na sala limpa e não pode ser filmada. Para fins de demonstração, o procedimento é representado aqui por uma animação.
Para a preparação do revestimento do molde de níquel, uma camada de 220 nanômetros de espessura de feixe de elétrons negativos resiste a um wafer de silício de quatro polegadas de 600 mícrons de espessura. Escreva a matriz de nano-buracos projetada neste wafer, usando um sistema de litografia por feixe de elétrons. Para acelerar a escrita do feixe de elétrons, escreva os padrões com um mapa de pontos baixo de 20.000 para cada tamanho de campo de 300 mícrons.
Desenvolva a resistência imergindo o wafer de silício de quatro polegadas na solução do revelador por 10 segundos e deixando o wafer secar ao ar. Deposite uma camada de sementes de um metal, como níquel, cobre ou alumínio no wafer de silício. Em seguida, galvanize o wafer em um sistema de revestimento dentro de um banho de sulfamato de níquel em duas etapas.
Separe o molde de níquel do substrato de silício aplicando uma força mecânica suave. Em seguida, usando uma nanoimpressão, imprima os padrões nano em um wafer de vidro de quatro polegadas que foi revestido com uma litografia de nanoimpressão fotocurável de 300 nanômetros de espessura. Transfira o molde, a fotorresistência e o wafer de vidro para um sistema de fotopolimerização por luz ultravioleta e fotopolimerização.
Se todas as etapas foram seguidas corretamente, o molde de níquel deve ser facilmente desmoldado do fotorresistente. Depois de realizar uma gravação em branco do fotorresistente na sub-reta de vidro, no wafer de vidro, em uma máquina de deposição por feixe de elétrons, deposite uma camada de cromo para adesão de metal e uma camada de ouro para o sensor plasmônico. Realize a elevação do fotorresiste por condicionamento de plasma de oxigênio por três minutos, seguido por uma etapa de sonoficação de 15 segundos em acetona.
Em seguida, corte a amostra em chips de cinco milímetros por cinco milímetros. A matriz de nano-buracos ocupará o quadrado central de dois milímetros por dois milímetros do chip. Para adquirir os dados, configure o aparelho para fazer as medições ópticas, de modo que um feixe de luz branca que sai pela extremidade da fibra óptica do transmissor seja colunado e incida sobre a superfície do sensor a 90 graus.
A luz é transmitida através de toda a matriz de nano-furos. Colete o sinal transmitido com a fibra óptica do receptor e registre-o com um espectrômetro UV-visível operando na faixa de 300 a 1.000 nanômetros. Para o teste de sensibilidade em massa do sensor, deposite o líquido padrão do índice de refração na célula líquida com os índices de refração variando de 1,31 a 1,39.
Mergulhe o chip do sensor no líquido de índice de refração padrão e alinhe-o com o feixe de luz branca. Em seguida, obtenha o espectro de transmissão. Limpe o chip do sensor após cada medição com um reagente de limpeza tensoativo e seque-o com gás nitrogênio.
Para a modificação da superfície do sensor, limpe os chips do sensor por imersão sequencial em isopropanol, acetona e água deionizada antes de qualquer modificação química. Em seguida, seque os chips do sensor em temperatura ambiente em um vapor de gás nitrogênio seco. Em seguida, incube os chips sensores em uma solução etanólica por 12 horas em temperatura ambiente.
Isso formará uma monocamada de automontagem reativa à amina. Após a incubação, use etanol para enxaguar e secar bem os cavacos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe os chips em uma mistura de sulfo n hidroxisuccinimida 75 milimolar e EDC 15 milimolar por 15 minutos.
Isso ativará o grupo carboxsílico da monocamada de automontagem. Em seguida, coloque 50 microlitros de uma solução de anticorpo antitriponente de 200 microgramas por mililitro feita em um tampão de ácido Ph 4,5 na superfície do sensor. Após incubação por 30 minutos, desative os ésteres não reativos imergindo o chip sensor em uma solução molar de etanolamina HCL por 15 minutos.
Por fim, enxágue o chip com água deionizada e seque-o em uma corrente de gás nitrogênio seco em temperatura ambiente. Bloqueie qualquer ligação inespecífica detectando 100 microlitros de solução de albumina de soro bovino a 1% na superfície do chip sensor. Incube por 15 minutos.
Enxágue os chips do sensor três vezes em solução salina tamponada com fosfato. Insira o chip na célula de medição para registrar o espectro de transmissão. Este é o espectro de referência.
Em seguida, coloque 50 microlitros da troponina cardíaca em um padrão na superfície do chip. Incube o chip em um ambiente úmido por 30 minutos. Depois de enxaguar os chips do sensor três vezes em solução PBS, insira-o na célula de medição para registrar o espectro de transmissão.
Este é o espectro pós-ligação. Em seguida, mergulhe os chips em 50 milimolares de glicina HCL por um minuto e depois enxágue em solução de PBS três vezes para regenerar a superfície do chip. Meça o espectro de transmissão em PBS para verificar o sucesso da etapa de regeneração.
A mudança no espectro de transmissão do biossensor ao interagir com 30 nanogramas por mililitro de troponina cardíaca humana no soro é mostrada. O gráfico azul representa antes da interação, enquanto o gráfico vermelho representa após a interação. O círculo pontilhado indica a banda que está sendo rastreada.
Aqui é mostrada a mudança no comprimento de onda para a banda dois em concentrações de troponina de 2,5 nanogramas por mililitro, 7,5 nanogramas por mililitro, 30 nanogramas por mililitro e 75 nanogramas por mililitro. As barras de erro representam o desvio padrão. Este gráfico mostra a mudança nos comprimentos de onda das bandas observadas após a regeneração de um chip biossensor de nano-buracos.
A mudança da posição da banda dois de volta à sua posição original indica que a etapa de regeneração foi bem-sucedida. Uma vez dominada, a medição pode ser feita em uma hora se realizada corretamente. Ao medir bioanalitos neste método, é importante usar reagentes recém-preparados.
Certifique-se de retirar seus consumíveis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar biossensores que operam com base no princípio da transmissão óptica extraordinária e podem monitorar bioanalitos em um fundo complexo. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é difícil gerar matrizes de nano-furos de alta fidelidade que possibilitem a interface do chip com uma fibra óptica sem a necessidade de nenhum microscópio e optando por resinas reprodutíveis.
Essa técnica permite que você faça medições em série que são cruciais em ambientes médicos. A fabricação do chip ajuda muito a garantir a reprodutibilidade das medições. Com a plataforma básica permanecendo a mesma, outras melhorias nessa técnica virão do uso da técnica com melhor resolução, o que melhorará a sensibilidade, e do uso de métodos de processamento de sinal para obter melhores relações sinal-ruído.
A implicação dessa técnica se estende ao monitoramento de vários bioanalitos em um fundo complexo de soro em um ambiente de ponto de atendimento em tempo real.
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Visão Geral
Este trabalho descreve um método de litografia por nanoimpressão para fabricar matrizes de sensores de alta qualidade que operam com base na transmissão óptica extraordinária. O biossensor é projetado para aplicações de diagnóstico próximo ao paciente, permitindo a detecção de troponina I cardíaca em soro em concentrações clinicamente relevantes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biotecnologia
- Engenharia Biomédica
Antecedentes
- A necessidade de detecção confiável de biomarcadores em fluidos biológicos complexos.
- Desafios associados às tecnologias tradicionais de biossensores.
- O princípio da transmissão óptica extraordinária na biossensoriamento.
- Importância dos diagnósticos na assistência imediata em ambientes clínicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um biossensor de baixo custo e robusto para a detecção de troponina I cardíaca.
- Simplificar o processo de detecção sem configurações complexas.
- Demonstrar a viabilidade de biossensores baseados em transmissão extraordinária em aplicações clínicas.
Métodos Utilizados
- Litografia por nanoimpressão para fabricação de sensores.
- Teste do biossensor em amostras de soro.
- Representação em animação do processo de fabricação.
- Avaliação dos limites de detecção e métricas de desempenho.
Resultados Principais
- O biossensor pode detectar troponina I cardíaca em concentrações de 10-400 pg/mL.
- Funciona eficazmente em ambientes de atendimento pontual.
- Confiabilidade comprovada na detecção de biomarcadores em fluidos complexos.
- Elimina a necessidade de configurações ópticas ou elétricas elaboradas.
Conclusões
- Este método representa um avanço significativo na tecnologia de biossensores.
- Tem o potencial de melhorar os diagnósticos na assistência médica para condições cardíacas.
- Trabalhos futuros podem focar na ampliação da gama de biomarcadores detectáveis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Esta plataforma de biossensor atende à necessidade crítica de detecção confiável e de baixo custo de biomarcadores cardíacos em fluidos biológicos complexos, como soro humano, apoiando diretamente fluxos de trabalho diagnósticos na atenção primária. Ao permitir medições reprodutíveis e quantitativas de troponina I cardíaca em concentrações clinicamente relevantes, sem a necessidade de configurações ópticas ou elétricas complexas, o método reduz as barreiras técnicas para o diagnóstico precoce e a estratificação de risco em doenças cardiovasculares. A fabricação por nanoimpressão de alta fidelidade garante variação mínima entre chips, favorecendo a produção em larga escala e desempenho consistente dos ensaios nas fases de descoberta e translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da dinâmica de liberação da troponina cardíaca como biomarcador mecanicista de lesão miocárdica em modelos pré-clínicos.
- Valor Operacional: Fornece uma leitura óptica sem marcadores, compatível com matrizes de nano-orifícios de alta fidelidade, para detecção de sinal consistente em fundos de soro.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece saídas quantitativas de deslocamento de comprimento de onda que se correlacionam com a concentração do analito, permitindo a caracterização de resposta à dose em matrizes séricas.
- Valor Operacional: Suporta uma estratégia de um chip, uma medição com baixa variância, aumentando a reprodutibilidade para padronização de ensaios e triagem de reagentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita o monitoramento da cinética de biomarcadores cardíacos em soro humano relevante para doenças, melhorando a continuidade translacional do descobrimento à validação.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de microscopia por meio de áreas sensoras grandes (1,5 mm x 1,5 mm), simplificando a integração com fontes de luz laboratoriais padrão e espectrômetros.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na continuidade entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, fornecendo uma leitura quantitativa e robusta para a detecção de biomarcadores em fluidos complexos, apoiando decisões de avançar ou interromper com base no engajamento do alvo e na modulação da via.
- Biologia da Descoberta: Permite testes de hipóteses sobre mecanismos de lesão cardíaca por meio da detecção confiável de troponina I em concentrações fisiologicamente relevantes no soro.
- Triagem: Fornece deslocamentos reprodutíveis no espectro de transmissão que permitem a comparação de níveis de biomarcadores entre diferentes condições experimentais, sem necessidade de instrumentação complexa.
- Análise: Fornece medidas de deslocamento no comprimento de onda (por exemplo, banda dois) como saída quantitativa para acompanhar a ligação do biomarcador e a eficácia da regeneração.
- Pesquisa Translacional: Utiliza soro humano como matriz de detecção, assegurando relevância para amostras clínicas e reduzindo o risco de tradução dependente de espécie.
- Reutilização Empresarial: O processo de fabricação baseado em nanoimpressão é reutilizável em múltiplas gerações de chips, favorecendo a escalabilidade da plataforma para painéis multiplexados de biomarcadores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na detecção de biomarcadores por meio de LOD clinicamente relevante (0,55 ng/mL) e variância mínima entre chips.
- Valor Operacional: Padronização por meio da litografia por nanoimpressão e compatibilidade com espectrômetros UV-Vis comuns e configurações de fibra óptica.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao permitir o monitoramento precoce e preciso de biomarcadores em ambientes simulados de atendimento pontual (POC).
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados ao coração por meio de leituras confiáveis e compatíveis com soro.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em litografia por nanoimpressão, química de superfície e espectroscopia óptica para a fabricação e funcionalização do chip.
- Depende do acesso a sala limpa para a geração do molde mestre e sistemas de cura por UV para polimerização do resist.
- Necessita de preparação padronizada da superfície (por exemplo, bloqueio com BSA, lavagens com EDTA) para minimizar a ligação inespecífica em matrizes séricas.
- A adaptação a outros biomarcadores exige a validação da eficiência de imobilização de anticorpos e da estabilidade de regeneração em fluidos complexos.
- Limitação prática: A eficiência de regeneração deve ser verificada a cada ciclo para garantir a reprodutibilidade da superfície ao longo de medições em série.
