Braçadeira de tensão Fluorometria em Xenopus Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

O objetivo geral deste procedimento é introduzir um aminoácido não natural fluorescente em uma proteína de membrana expressa em oócitos de Xenopus e determinar a função e o rearranjo estrutural da proteína simultaneamente, usando fluorometria de grampo de voltagem. Esta técnica ajudará a responder a questões-chave no campo das relações estrutura-função das proteínas de membrana. Usando fluorometria de grampo de voltagem, podemos correlacionar diretamente os rearranjos estruturais com a função da proteína.

Adicionar marcação de aminoácidos não naturais fluorescentes a ele ajuda a superar as limitações anteriores na rotulagem. Esta já foi a acessibilidade dos locais de rotulagem, bem como a rotulagem de fundo devido aos locais de ligação endógenos. A implicação dessa técnica se estende a uma melhor compreensão biofísica das proteínas de membrana, porque agora você pode sondar domínios, que anteriormente eram inacessíveis com a fluorometria tradicional de grampo de voltagem.

Após a remoção cirúrgica dos oócitos de Xenopus, lave os oócitos três vezes com solução SOS. Selecione oócitos grandes e saudáveis individualmente e incuba-os a 18 graus Celsius por pelo menos quatro horas em solução de Barth suplementada com antibióticos e soro de cavalo a 5% antes da injeção. Para injeção nuclear de DNA, prepare uma ponta de injeção longa e fina para atingir o núcleo sem danificar os oócitos.

Em seguida, encha a ponta de injeção com óleo e monte a ponta de injeção no dispositivo nanoinjetor. Em seguida, instale o nanoinjetor sob um microscópio estéreo e quebre a ponta da ponta com uma pinça. Depois disso, ejete o óleo até que não haja nenhuma bolha de ar presa dentro da extremidade da ponta.

Em seguida, coloque um microlitro de 0,1 micrograma por microlitro pAnap em água livre de nuclease em um pedaço de Parafilm sob o estereoscópio e encha a ponta de injeção com DNA. Em seguida, transfira os oócitos para uma placa de injeção contendo malha contendo a solução de Barth suplementada com antibióticos. Como o núcleo do oócito está localizado no pólo animal, aponte a ponta de injeção para o centro do pólo animal e empale de forma que a ponta chegue perto do centro do hemisfério animal.

Em seguida, injete 9,2 nanolitros da solução de pAnap no núcleo de cada oócito. Posteriormente, incubar os oócitos em dois mililitros de solução de Barth suplementada com antibióticos e soro de cavalo a 5% a 18 graus Celsius por seis a 24 horas para permitir a expressão robusta de tRNAs específicos de Anap e tRNA sintetases. Agora, prepare o nanoinjetor novamente, mas desta vez, a ponta de injeção não precisa ser tão fina quanto a da injeção de DNA.

Trabalhe apenas com luz vermelha a partir deste ponto para evitar o fotobranqueamento do Anap. Misture um microlitro de Anap milimolar com um microlitro de um a dois microgramas por mRNA de microlitro diretamente em um pedaço de Parafilm e encha a ponta de injeção com a solução de mistura. Empale a ponta no pólo vegetal logo abaixo da membrana e injete 46 nanolitros da solução de mistura em cada oócito injetado com pAnap.

Em seguida, proteja os oócitos da luz colocando-os em uma caixa hermética ou embrulhando o frasco em papel alumínio. Incube-os na solução de Barth suplementada com antibióticos e soro de cavalo a 5% a 18 graus Celsius por dois a três dias. Substitua-o por solução fresca de Barth todos os dias e remova os oócitos mortos para evitar contaminação.

Nesta configuração, o equipamento de grampo de tensão de abertura é integrado a uma configuração de microscopia de fluorescência. A câmara de gravação é instalada em um controle deslizante que permite que ela se mova entre o estereoscópio padrão para colocar o oócito e o microscópio para realizar medições de fluorescência. Um sistema de detecção de fotodiodo é conectado à porta de saída de montagem em C do microscópio de fluorescência e a leitura de fotocorrente é conectada a um segundo canal de entrada no processador de sinal digital.

Uma lâmpada halógena de 100 watts e 12 volts é usada como fonte de luz para a excitação de fluorescência. A excitação é controlada por um obturador mecânico entre a fonte de luz de excitação e o microscópio. A ativação é acionada por meio de um pulso TTL proveniente do processador de sinal digital que é cronometrado no software de gravação, de modo que o obturador abra cerca de 100 milissegundos antes do início da gravação, e um cubo de filtro apropriado seja necessário na torre do cubo de filtro.

Para VCF de duas cores, incube os oócitos preparados em maleimida TMR de cinco micromolares em solução de marcação por 15 minutos imediatamente antes da gravação. Em seguida, lave os oócitos com a solução de marcação três vezes para remover o excesso de corante antes de gravar. Neste ponto, a proteína é especificamente marcada com dois fluoróforos diferentes.

Após a montagem do oócito, com o poste do animal voltado para cima e permeabilizado, deslize a câmara para o microscópio e concentre-se no oócito usando uma objetiva 4X. Em seguida, empale o oócito com um eletrodo V1 com sensor de voltagem. Em seguida, mude para a objetiva de imersão em água 40X.

Concentre-se no poste do animal, que está voltado para cima. Depois disso, desligue a luz vermelha. Selecione o cubo de filtro Anap girando a torre do cubo de filtro e a porta de saída óptica conectada ao fotodiodo.

Em seguida, ligue a lâmpada halógena na intensidade mais alta e abra o obturador por dois a cinco segundos para ler a intensidade da fluorescência de fundo originada do oócito. Depois, ligue o clamp, gire o interruptor de banho/proteção para ativo e ajuste o potencial da membrana para o potencial de comando girando o botão no headstage. Em seguida, selecione o potencial de retenção, o protocolo de passo, o número e a duração dos pulsos no software de gravação.

Em seguida, registre as correntes dependentes de tensão e as intensidades de fluorescência Anap. Para VCF de duas cores, selecione o cubo de filtro TMR girando a torre do cubo. Leia a fluorescência de fundo para TMR, conforme descrito para Anap, e registre as correntes dependentes de tensão e a intensidade de fluorescência TMR simultaneamente.

Esta figura exibe sinais de fluorescência Anap e TMR usando protocolos de etapas obtidos do mesmo oócito expressando um mutante Shaker. Ao adicionar uma cisteína, acessível a partir da solução externa, ao fundo L382 stop W434F e rotulá-la com maleimida TMR, é possível sondar movimentos em tempo real em diferentes regiões da mesma proteína simultaneamente. A relação de tensão de fluorescência é obtida plotando a intensidade de fluorescência em estado estacionário em relação à tensão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como expressar aminoácidos não naturais fluorescentes em oócitos Xenopus e como realizar a fluorometria de grampo de voltagem de uma ou duas cores. Depois de dominar a técnica, deve levar aproximadamente a mesma quantidade de tempo que os experimentos tradicionais de eletrofisiologia, você só tem a etapa extra de injetar DNA no núcleo do oócito. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar a expressão de vazamento na ausência do aminoácido não natural.

Isso deve ser feito para cada mutação, pois a quantidade de expressão de vazamento depende do local de inserção do códon de parada dentro da proteína. Essa técnica agora permite que os pesquisadores estudem mudanças conformacionais no local citosólico da proteína, onde ocorrem muitos dos mecanismos regulatórios.