Braçadeira de tensão Fluorometria em

O objetivo geral deste procedimento é introduzir um aminoácido não natural fluorescente em uma proteína de membrana expressa em oócitos de Xenopus e determinar simultaneamente a função da proteína e suas mudanças estruturais, utilizando a fluorometria com fixação de voltagem. Esta técnica ajudará a responder perguntas fundamentais na área de relações entre estrutura e função de proteínas de membrana. Com a fluorometria com fixação de voltagem, podemos correlacionar diretamente mudanças estruturais com a função da proteína.

A adição de marcação com aminoácidos não naturais fluorescentes ajuda a superar limitações anteriores na marcação, como a acessibilidade dos sítios de marcação e a marcação de fundo devido a sítios de ligação endógenos. A implicação dessa técnica estende-se a uma melhor compreensão biofísica de proteínas de membrana, pois agora é possível investigar domínios que anteriormente eram inacessíveis com a fluorometria tradicional associada ao clamp de voltagem.

Após a remoção cirúrgica dos oócitos de Xenopus, lave os oócitos três vezes com solução SOS. Selecione individualmente os oócitos grandes e saudáveis e incube-os a 18 graus Celsius por pelo menos quatro horas em solução de Barth suplementada com antibióticos e 5% de soro de cavalo antes da injeção. Para injeção nuclear de DNA, prepare uma ponta de injeção longa e fina para alcançar o núcleo sem danificar os oócitos.

Em seguida, preencha a ponta de injeção com óleo e acople a ponta de injeção no dispositivo de nanoinjeção. Depois, instale o nanoinjetor sob um microscópio estereoscópico e quebre a extremidade da ponta com pinça. Após isso, ejetar o óleo até que não haja bolhas de ar aprisionadas dentro da extremidade da ponta.

Em seguida, coloque um microlitro de 0,1 micrograma por microlitro de pAnap em água livre de nucleases sobre um pedaço de Parafilm sob o estereoscópio e encha a ponta de injeção com DNA. Então, transfira os ovócitos para um prato de injeção contendo malha e solução de Barth suplementada com antibióticos. Como o núcleo do ovócito está localizado no polo animal, direcione a ponta de injeção para o centro do polo animal e perfure de modo que a ponta alcance próximo ao centro do hemisfério animal.

Em seguida, injete 9,2 nanolitros da solução pAnap no núcleo de cada ovócito. Posteriormente, incube os ovócitos em dois mililitros de solução de Barth suplementada com antibióticos e 5% de soro de cavalo a 18 graus Celsius por seis a 24 horas para permitir a expressão robusta de tRNAs e sintetases de tRNA específicas para Anap. Agora, prepare novamente o nanoinjetor, mas desta vez, a ponta de injeção não precisa ser tão fina quanto a usada para injeção de DNA.

Trabalhe apenas com luz vermelha a partir deste ponto para evitar o desbotamento fotossensível do Anap. Misture um microlitro de Anap a um milimolar com um microlitro de mRNA a um a dois microgramas por microlitro diretamente sobre um pedaço de Parafilm e preencha a ponta de injeção com a solução da mistura. Insira a ponta no polo vegetal logo abaixo da membrana e injete 46 nanolitros da solução da mistura em cada ovócito injetado com pAnap.

Em seguida, proteja os ovócitos da luz colocando-os em uma caixa opaca à luz ou envolvendo o frasco com papel alumínio. Incube-os em solução de Barth suplementada com antibióticos e soro de cavalo a 5% a 18 graus Celsius por dois a três dias. Substitua por solução de Barth fresca diariamente e remova os ovócitos mortos para evitar contaminação.

Nesta configuração, o equipamento de grampo de voltagem com câmara aberta é integrado a um sistema de microscopia de fluorescência. A câmara de registro é instalada em um deslizador que permite movê-la entre o estereoscópio padrão, usado para posicionar o oócito, e o microscópio, utilizado para realizar as medições de fluorescência. Um sistema de detecção por fotodiodo está conectado à saída C-mount do microscópio de fluorescência, e a leitura da fotocorrente é ligada a um segundo canal de entrada no processador de sinal digital.

Uma lâmpada halógena de 100 watts e 12 volts é utilizada como fonte de luz para a excitação da fluorescência. A excitação é controlada por um obturador mecânico posicionado entre a fonte de luz de excitação e o microscópio. A ativação é acionada por um pulso TTL proveniente do processador de sinal digital, que é temporizado no software de gravação de modo que o obturador se abra cerca de 100 milissegundos antes do início da gravação, sendo necessário um cubo de filtro apropriado na torreta de cubos de filtro.

Para a VCF de duas cores, incubar os ovócitos preparados em solução de marcação com maleimida de TMR a cinco micromolares durante 15 minutos imediatamente antes do registro. Em seguida, lavar os ovócitos três vezes com a solução de marcação para remover o corante em excesso antes do registro. Neste ponto, a proteína está especificamente marcada com dois fluoróforos diferentes.

Após o posicionamento do ovócito, com o polo animal voltado para cima e permeabilizado, deslize a câmara para o microscópio e foque o ovócito utilizando uma objetiva de 4X. Em seguida, introduza o ovócito com um eletrodo V1 sensor de voltagem. Depois, mude para a objetiva de imersão em água de 40X.

Foque no polo animal, que está voltado para cima. Em seguida, desligue a luz vermelha. Selecione o cubo de filtro Anap girando a torreta do cubo de filtro e a saída óptica conectada ao fotodiodo.

Em seguida, ligue a lâmpada de halogênio na intensidade máxima e abra o obturador por dois a cinco segundos para ler a intensidade de fluorescência de fundo originada do ovócito. Depois, ligue o clamp, mude a chave banho/proteção para ativo e ajuste o potencial da membrana ao potencial de comando girando o botão na cabeça do amplificador. Posteriormente, selecione no software de gravação o potencial de retenção, o protocolo de degrau, o número e a duração dos pulsos.

Em seguida, registre as correntes dependentes de voltagem e as intensidades de fluorescência de Anap. Para VCF de duas cores, selecione o cubo de filtro TMR girando a torreta do cubo. Leia a fluorescência de fundo para TMR, conforme descrito para Anap, e registre simultaneamente as correntes dependentes de voltagem e a intensidade de fluorescência de TMR.

Esta figura exibe os sinais de fluorescência de Anap e TMR usando protocolos em degraus obtidos do mesmo ovócito que expressa uma mutante de Shaker. Ao adicionar uma cisteína, acessível a partir da solução externa, ao fundo L382 stop W434F e marcá-la com maleimida de TMR, é possível investigar movimentos em tempo real em diferentes regiões da mesma proteína simultaneamente. A relação tensão-fluorescência é obtida plotando-se a intensidade de fluorescência no estado estacionário em função da tensão.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como expressar aminoácidos não naturais fluorescentes em oócitos de Xenopus e como realizar fluorometria por eletrodo de fixação de voltagem com uma ou duas cores. Uma vez dominada a técnica, o procedimento deve levar aproximadamente o mesmo tempo que experimentos tradicionais de eletrofisiologia, com a única diferença de incluir o passo adicional de injetar DNA no núcleo do oócito. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar a expressão de vazamento na ausência do aminoácido não natural.

Isso deve ser feito para cada mutação, pois a quantidade de expressão vazia depende do local de inserção do códon de parada dentro da proteína. Esta técnica agora permite aos pesquisadores estudar alterações conformacionais no sítio citosólico da proteína, onde ocorrem muitos dos mecanismos regulatórios.