Um novo método para modelar a encefalopatia traumática crônica em Drosophila

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para infligir lesões cerebrais traumáticas de cabeça fechada em Drosophila melanogaster . Nosso método tem a vantagem de entregar diretamente impactos repetitivos com força ajustável para a cabeça sozinho. Uma maior exploração do sistema de invertebrados ajudará a iluminar a patogênese da encefalopatia traumática crônica.

O objetivo geral deste novo procedimento é infligir lesões cerebrais traumáticas fechadas na mosca da fruta, Drosophila, para estabelecer um novo modelo de encefalopatia traumática crônica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da encefalopatia traumática crônica, como como o trauma repetitivo induz a degeneração dos neurônios. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece os impactos repetitivos de forças ajustáveis diretamente à cabeça da mosca, sem causar danos a outras partes do corpo do animal.

A demonstração desse método no mundo real é crítica, pois a montagem do dispositivo e as etapas de carregamento são difíceis de aprender, porque a cabeça da Drosophila é muito pequena e é importante aplicar o impacto apenas na cabeça. Para fazer o aparelho usado para concussão ou atacar as moscas da fruta, primeiro, faça a parte do impactor do aparelho. Remova o êmbolo de uma seringa de tuberculina de policarbonato de um mililitro e corte o cilindro na marca de um mililitro.

Para um impactador, use a barreira de aerossol encontrada em uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Este pêndulo deve ter três milímetros de comprimento e quatro milímetros de diâmetro. Em seguida, coloque o impactor no cilindro da seringa com o lado plano voltado para o bico.

Para fornecer força, conecte o corpo da seringa a um regulador de fluxo de dióxido de carbono. O regulador deve ter uma chave seletora On Off e um bom controle da vazão de gás. Em seguida, prenda o cano verticalmente a um suporte de ferro, de modo que o impactor caia no fundo do cano.

Em seguida, faça o porta-moscas. Comece com uma ponta de pipeta de 200 microlitros. Corte a ponta da pipeta a cinco milímetros da extremidade menor para fazer uma abertura de 8 milímetros de diâmetro.

Uma cabeça de mosca caberá neste orifício, mas o tórax não. Por fim, faça um para o dispositivo de suporte de mosca e impactador. Primeiro, corte uma ponta de pipeta de um mililitro a 44 milímetros da pequena abertura.

Em segundo lugar, corte um comprimento de seis milímetros da tampa da agulha para uma seringa de um mililitro. Em seguida, empurre os dois juntos. Anestesiar uma única mosca adulta de dois dias usando dióxido de carbono.

Da almofada de dióxido de carbono, use uma escova fina para transferir suavemente a mosca para o suporte. Em seguida, bata suavemente no suporte até que a cabeça se projete da ponta. Se a tromba estiver exposta, use uma agulha de seringa embotada de um mililitro para colocá-la suavemente de volta na ponta.

É fundamental manter o corpo da mosca, especialmente a parte da boca, dentro do suporte. Caso contrário, a mosca pode morrer por danos aos órgãos internos ou por não conseguir ingerir alimentos. Em seguida, defina a pressão do gás para 100 quilopascais e ajuste o fluxo conforme necessário.

Assim que a mosca estiver carregada, aperte o suporte ao corpo da seringa usando o conector, de modo que a cabeça da mosca fique voltada para baixo. Em seguida, usando a chave seletora, envie uma rajada de gás que move o impactor para atingir a mosca uma vez e apenas uma vez. Agora, solte o porta-moscas e despeje a mosca de volta na almofada de dióxido de carbono.

Pincele a mosca em um frasco vazio até que ela se recupere. Mantenha uma mosca por frasco. A recuperação leva apenas alguns minutos.

Repita o processo para testar quatro moscas por grupo experimental. O processamento de dois grupos, um teste e uma simulação, deve levar apenas 20 a 30 minutos. Trate as farsas como animais de teste, exceto que não inclua uma barreira de aerossol no tubo do impactor.

Para rastrear os movimentos das moscas em uma placa de Petri, primeiro encha uma placa de seis centímetros com elastômero de silicone transparente para fazer a arena de rastreamento. Deixe um espaço de três milímetros entre o silício e a tampa para que as moscas possam andar livremente na lacuna, mas não voar. Abaixo da arena de rastreamento, tenha um fundo branco.

Em seguida, anestesiar quatro moscas do mesmo grupo de tratamento e colocá-las na arena. Deixe as moscas se aclimatarem por uma hora à arena, que deve estar totalmente iluminada e a cerca de 22 graus Celsius. Não mais quente do que a temperatura ambiente.

Depois de uma hora, use uma câmera de dispositivo de carga acoplada posicionada acima da arena para registrar a atividade da mosca por cinco minutos. Após a gravação de cinco minutos, anestesie as moscas na arena e devolva-as a um novo frasco doméstico. Em seguida, descarte a arena.

Posteriormente, analise as gravações usando o software Ctrax disponível gratuitamente. Este software gera dados de rastreamento, que podem ser exportados em um formato compatível com linguagem programável, como o formato MATLAB. A partir dos dados, calcule a distância percorrida por quadro, a distância média percorrida para cada mosca e a distância média percorrida por mosca.

Para significância estatística, espere testar cerca de 100 moscas por grupo de tratamento. Para estabelecer um modelo de encefalopatia traumática crônica, a eficácia de um único traumatismo craniano fechado feito pelo aparelho impactante em diferentes velocidades foi analisada usando fêmeas Canton-S de dois dias de idade. A pressão do gás foi mantida em 100 quilopascais.

As moscas expostas a um único golpe na taxa de fluxo mais alta testada exibiram defeitos externos mínimos. Apesar de não haver evidências claras de danos externos, lesões a uma taxa de fluxo de 15 litros por minuto foram agudamente letais, resultando em menos de 10% de sobrevida em 24 horas. A sobrevivência aumentou com taxas de fluxo mais baixas.

Cem por cento de sobrevivência foi alcançada a cinco litros por minuto ou menos, então cinco litros por minuto foram selecionados como padrão para o modelo. Logo após serem atingidas, as moscas recuperaram gradualmente sua mobilidade em quatro minutos. A recuperação das farsas foi cerca de um minuto mais rápida.

O rastreamento de movimento assistido por vídeo pós-impacto foi usado para medir a função da locomotiva. Durante os dois dias após o impacto, a locomoção voltou lentamente ao normal. Essa evidência de recuperação gradual está de acordo com a recuperação do CTE em humanos.

Para avaliar os efeitos a longo prazo, foi aplicado um protocolo de lesão cerebral traumática repetitiva de cinco golpes em cinco dias. Vinte dias após o tratamento, a locomoção dos membros sobreviventes em cada grupo foi comparada e o grupo tratado claramente caminhou menos. A expectativa de vida do grupo tratado também foi substancialmente reduzida, com uma mediana de 26 dias em comparação com 37 dias para os controles.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que pesquisadores no campo de lesões cerebrais traumáticas repetitivas leves explorem mecanismos patogênicos no modelo animal clássico Drosophila melanogaster. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de proteger a tromba, o tórax e o abdômen do impacto direto da barreira de aerossol.