Protocolo de rastreamento de vídeo para a tela de quimioterapia para abelhas

O objetivo geral deste procedimento é avaliar repelentes químicos para abelhas melíferas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da entomologia, como quais substâncias químicas alteram o comportamento das abelhas melíferas, afastando-as de uma fonte alimentar. A principal vantagem deste protocolo é que ele oferece uma abordagem simples para triagem de repelentes químicos para abelhas melíferas de maneira relativamente rápida e fácil.

Para preparar um cubo de açúcar-agarose para o tratamento controle, despeje uma solução de açúcar-agarose semi-resfriada em um molde de barquinho de pesagem. Para o tratamento com repelente, adicione a quantidade desejada do composto à solução de agarose semi-resfriada. Nesta demonstração, utiliza-se uma concentração final de 1% de DEET.

Agite o frasco para misturar o composto e, em seguida, despeje a solução em uma forma de barquinho de pesagem. Após o resfriamento dos cubos de açúcar-agarose, retire os cubos solidificados das formas de barquinho de pesagem e coloque-os em um recipiente plástico com uma toalha de papel umedecida. Coloque os recipientes na geladeira para armazenamento.

No software de rastreamento, acesse as configurações do experimento na barra do explorador de experimentos, localizada à esquerda da tela. Certifique-se de que a câmera correta esteja selecionada e de que a gravação de vídeo esteja centralizada nas arenas da placa de Petri. Se for necessário centralizar a gravação de vídeo, acesse as configurações da câmera, na área de controles de interesse, e selecione as opções Centralizar X e Centralizar Y.

Em configurações do experimento, altere o número de arenas para 16. Em recursos rastreados, selecione a detecção do ponto central. Em seguida, selecione as configurações da arena para configurar a arena desejada para o ensaio.

Coloque as 16 placas de Petri em um padrão quatro por quatro sobre uma caixa de luz posicionada sob a câmera. Nas configurações da arena, use o botão capturar fundo localizado no painel de ferramentas do lado direito para tirar uma foto das 16 placas de Petri. Esta imagem será usada como modelo para configurar a arena.

Selecione criar elipse na barra de ferramentas na parte superior da tela de configurações da arena e crie um círculo que corresponda ao diâmetro de um dos recipientes de Petri na imagem capturada. Posicione o marcador da arena dentro do círculo. Em seguida, selecione o grupo de zonas um, localizado abaixo da arena um no painel de ferramentas do lado direito.

Selecione criar retângulo na barra de ferramentas na parte superior da tela. Crie um quadrado de 30 por 30 pixels usando esta ferramenta. Em seguida, posicione-o no centro do círculo criado na etapa anterior.

Selecione "adicionar zona" na barra de ferramentas superior e clique no centro do quadrado. Mova a zona em um marcador para posicioná-la dentro do quadrado. Em seguida, selecione "arena um" no painel de ferramentas do lado direito e clique em "duplicar arena completa".

No menu suspenso, selecione todas as outras arenas e clique em OK. Mova as configurações de arena duplicadas para as placas de Petri restantes na imagem capturada. Em seguida, selecione a arena um e selecione calibrar escala na barra de ferramentas superior. Desenhe a linha de calibração ao longo do diâmetro da placa de Petri da arena um.

Altere a medição do diâmetro para nove centímetros. Selecione validar configurações da arena no painel de ferramentas do lado direito. Em seguida, selecione configurações de detecção na barra de controle do lado esquerdo.

Selecione as configurações de detecção um e, em seguida, selecione a escala de cinza no menu suspenso localizado na caixa de ferramentas do lado direito. Em detecção, defina a faixa de zero a 83. Clique com o botão direito nas configurações de detecção e crie uma nova configuração denominada Configurações de Detecção Dois.

Certifique-se de que a escala de cinza ainda está selecionada, mas não altere os outros parâmetros. Selecione a lista de ensaios no explorador experimental e clique em adicionar variável na barra de ferramentas superior. Nomeie a variável definida pelo usuário como Tratamento.

Selecione a barra suspensa de valores predefinidos na coluna de tratamento definido pelo usuário e adicione controle e tratamento como valores predefinidos. Clique no botão "adicionar ensaios" localizado na barra de ferramentas superior e adicione dois ensaios. Em seguida, para cada arena, selecione se ela é uma arena de controle ou uma arena de tratamento.

Em seguida, selecione perfil de dados no painel do explorador de experimentos. Na coluna à esquerda, selecione tratamento, localizado sob o título de variáveis independentes definidas pelo usuário. Isso adicionará uma caixa de filtro à área com o fluxograma.

Selecione C na caixa pop-up e, em seguida, posicione o filtro recém-criado entre a caixa inicial e a caixa de resultado. As setas do fluxograma devem se ajustar para apontar da caixa inicial ao filtro e, finalmente, à caixa de resultado. Repita este passo, mas desta vez selecione T para o filtro e, em seguida, selecione resultado na seção de elementos comuns.

Mova as caixas recém-criadas para a área do fluxograma e conecte-as com setas, depois salve o arquivo. Inicie o programa de rastreamento visual e abra o arquivo experimental salvo que foi criado para este ensaio. Selecione as configurações de detecção dois.

Em seguida, coloque cubos de açúcar-agarose controle no centro de oito das 16 placas de Petri. Repita este processo com os cubos de composto de açúcar-agarose nas oito placas restantes. Use uma pinça para remover uma única abelha da caixa de plástico e colocá-la em uma das placas de Petri controle.

Repita este passo para as 15 placas de Petri restantes. Coloque todas as placas sobre a caixa de luz. Ilumine a caixa de luz por baixo com um conjunto de luzes LED ajustadas para o espectro vermelho e posicione-as de modo que as áreas de detecção da arena se encaixem em cada uma das arenas das placas de Petri.

Cubra completamente a caixa e a câmera com uma folha de plástico preto para eliminar a luz externa e reduzir as sombras dentro das arenas. Após o posicionamento das placas de Petri, certifique-se de que a configuração de detecção um seja a configuração selecionada. Neste momento, o software de rastreamento visual deverá detectar apenas as abelhas melíferas dentro das arenas das placas de Petri.

Em seguida, selecione aquisição no explorador de experimentos. Pressione o botão verde de iniciar ensaio localizado na caixa pop-up de controle de aquisição à direita para começar a gravação. Execute o ensaio por 10 minutos e, em seguida, clique no botão vermelho de interromper ensaio na caixa pop-up de controle de aquisição para encerrar a gravação.

Resultados representativos do efeito do DEET no comportamento alimentar de abelhas melíferas individuais são mostrados aqui. Os indivíduos expostos aos cubos controle passaram em média 343 segundos na zona de alimentação, comparado a 16 segundos para indivíduos expostos aos cubos com DEET. Aqui são apresentados resultados representativos dos efeitos de dois compostos diferentes no comportamento alimentar de abelhas melíferas individuais.

Indivíduos expostos a um composto não deterrente passaram em média 282 segundos na zona de alimentação, em comparação com os controles, que passaram cerca de 352 segundos nesse local. A exposição a um composto deterrente resulta em indivíduos passando uma quantidade significativamente menor de tempo, cerca de 23 segundos, na zona de alimentação, em comparação com os controles, que passaram em média 493 segundos na zona.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar tudo com antecedência e privar as abelhas melíferas de alimento por um tempo adequado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar os efeitos de um composto infundido em uma fonte alimentar sobre abelhas melíferas individuais utilizando software de rastreamento por vídeo.

Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de campo próximo e de campo, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o efeito de um composto no nível da colônia. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de entomologia explorarem novas substâncias químicas e seus efeitos no comportamento alimentar de abelhas melíferas. Não se esqueça de que trabalhar com compostos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.