Name: Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a extrair e purificar polifenóis de bagas liofilizadas usando extração ultrassônica com etanol. Este método reprodutível permite estudar os efeitos cardioprotetores desses compostos em células musculares lisas vasculares in vitro.

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Este trabalho foi financiado pela Associação Americana do Coração (14GRNT20180028) e pelo Conselho da Universidade Estadual da Flórida sobre Pesquisa e Criatividade (COFRS).

1. Preparação de Reagentes <ol><li> Prepare 80% de etanol (100 mL) misturando 80 mL de etanol absoluto (grau de biologia molecular) e 20 mL de água estéril de grau de cultura celular. </li><li> Para preparar extrato de polifenol (10 mg / mL), pesa 10 mg de CE ou PE. Adicione 1 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sob uma capa de cultura de células. Vortex a solução. Alíquota em porções de 200 μL e armazene a -20 ° C. </li><li> Prepare o tampão de lise. <ol><li> Adicionar 5 mL de solução de reserva de HEPES 1 M (pH 7,4, final de 50 mM), 1 mL de solução de reserva de NaCl 5 M (50 mM de final), 1 mL de solução de reserva de EDTA 0,5 M (final 5 mM), 2 mL de 0,5 Solução madre de NaF de M (10 mM final), 286 μL de solução de reserva de Na3 VO4 700 mM (final de 2 mM), 5 mL de solução de reserva de Na4P2O7 200 mM (10 mM de final) e 5 mL de Solução de reserva de Triton-X-100 a 20% preparada em água (1% final). Adicione água para atingir um volume de 100 mL. Mantenha-se a 4 ° C. </li><lI&gt; Adicione 10 μL / mL de coquetel inibidor de protease. Adicione o novo quando as células estiverem prontas para a lise. </li></ol></li><li> Prepare o tampão de amostra Laemmli (4x). <ol><li> Adicionar 31,25 ml de solução de reserva de Tris 2 M (pH 6,8), 100 mL de glicerol, 50 mL de uma solução a 20% de Dodecyl Sulfate de Sódio (SDS) preparada em água e 50 mL de β-mercaptoetanol. Adicione água até 250 mL. Mantenha-se a 4 ° C. </li></ol></li><li> Para preparar o tampão salino tamponado com Tris (TBS), pesa 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (2,5 mM final) e 8,76 g de NaCl (150 mM final). Ajuste o pH para 7,4 e adicione água até 1 L. Manter à temperatura ambiente. </li><li> Para preparar TBS-T, adicione 997,5 mL de TBS e 2,5 mL de uma solução Triton-X-100 a 20% preparada em água. Mantenha-se à RT. </li></ol> 2. Preparação de extratos de Blackerry <ol><li> Preparação de extracto bruto de pó de baga liofilizado. <ol><li> Pesar 10 g de pó de amora liofilizada (ou 5 g de pó fresco). Se for usada fruta congelada, corte-aNto peças muito pequenas antes de iniciar a extração. </li><li> Misture o pó de fruta com 100 mL de etanol aquoso a 80% num balão Erlenmeyer de 1 L de fundo redondo. </li><li> Sonicate a mistura por 20 min a 42 kHz, 135 W usando um banho ultra-sônico a 25 ° C, sem intervalo de tempo entre eles. Execute a sonicação com purga contínua de nitrogênio em luz moderada. Para frutas congeladas, aumentar o tempo de incubação para 4 h. </li><li> Filtre a mistura através de um papel de filtro # 2 usando um funil refrigerado Buchner com aspiração a vácuo. NOTA: No final desta etapa, os resíduos da amostra aparecem no papel de filtro; Isso é chamado de bolo de filtro. </li><li> Lavar o bolo de filtração com 50 mL de etanol a 100%. Salve o filtrado e adicione o bolo de filtração a um frasco de fundo redondo de 1 L contendo 100 mL de etanol aquoso a 80%. </li><li> Repita o processo de extração para o resíduo (etapas 2.1.2 - 2.1.4). </li><li> Combine os dois filtrados num balão de fundo redondo com 50 ml adicionaisDe etanol aquoso a 80%. NOTA: O volume final deve ser de aproximadamente 300 mL. </li><li> Use um evaporador rotativo a 62 ° C e 50 rpm para evaporar o solvente. Continue este processo até que o etanol não se evapore mais. NOTA: Este processo leva aproximadamente 45 min. </li><li> Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mL. Evaporar o etanol por injetar gás nitrogênio na parte superior do tubo durante 10 min. NOTA: Esta etapa é necessária para assegurar a evaporação completa do etanol. O volume da amostra neste passo é de aproximadamente 20 mL. </li><li> Congele a amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 h. NOTA: Esta etapa é necessária para permitir um processo de liofilização mais eficiente. </li><li> Congele a amostra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Armazene as amostras a -20 ° C. NOTA: O secador de gelo cria um vácuo poderoso a -50 ° C dentro da câmara para secar as amostras, mas preserva a maioria dos compostos, como polipaNols. </li></ol></li><li> Preparação de extratos purificados de polifenóis a partir de extratos brutos. <ol><li> Pesar as amostras extraídas liofilizadas. NOTA: O volume do extrato neste passo é de aproximadamente 10 mL. </li><li> Adicione dois volumes (~ 20 mL) de clorofórmio ao extrato bruto e agite a solução por 5 minutos em uma placa de agitação. </li><li> Despeje a mistura em um funil de separação. Deixe o extracto bruto decantar durante 1 h à TA para obter a fração purificada. NOTA: Nesta etapa, formará uma mistura de duas fases. </li><li> Descarte a camada inferior (fase de clorofórmio) do funil de separação e cole a camada aquosa em um copo limpo. </li><li> Adicionar dois volumes de acetato de etilo à fração aquosa e usar uma barra de agitação magnética para agitar a mistura durante 5 min à TA. </li><li> Filtre a mistura através do papel de filtro # 2 usando um funil Buchner refrigerado com aspiração a vácuo. </li><li> Coletar a amostra filtrada e transferi-la para um balão de fundo redondo para ser nósCom o evaporador rotativo. </li><li> Colocar o evaporador rotativo a 62 ° C e 50 rpm e evaporar o acetato de etilo durante cerca de 30 min. </li><li> Congele a amostra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mL e guarde-o a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Tratamento de VSMCs com Extractos de Berry <ol><li> Cultura de VSMCs. <ol><li> Isolar VSMCs das aortas torácicas de ratos Sprague-Dawley realizando uma digestão enzimática, como descrito anteriormente 29 . Cultive os VSMCs como descrito 29 . </li><li> Prepare o meio completo para a cultura de VSMCs usando DMEM contendo 1 g / L de glicose e suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS), 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. Armazene o meio completo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Incubação de VSMCs com extratos de polifenóis. <ol><li> Para dividir os VSMCs, descarte o cultuRe médio e lave as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 4 mL de PBS e 2 mL de tripsina EDTA 0,25%. Incubar as células durante 5 minutos a 37 ° C numa incubadora de CO 2 . <ol><li> Recolher as células, misturá-las com 2 mL de meio completo em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 1.100 × g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com 1 mL de PBS. Contar as células usando um hemocitómetro. </li><li> Semear 50,000 VSMCs por poço em placas de cultura de 6 poços e cultivá-las em meio completo contendo 10% de FBS até atingir 90% de confluência (cerca de 3 d). Manter os VSMCs a 37 ° C em uma incubadora humidificada a 5% CO 2 . </li></ol></li><li> Prepare o meio para o tratamento usando meio DMEM contendo 1 g / L de glicose, 100 U / mL de penicilina, 100 mg / mL de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 0,5% de FBS. Armazene o meio de tratamento a 4 ° C. NOTA: Os extratos de polifenóis e Ang II são adicionados diretamente às células usando este euDium. </li><li> Prepare uma solução-mãe de 10 mg / mL de Extracto Bruto (CE) ou Extracto Purificado (PE) de polifenóis dissolvendo 10 mg de extrato em 1 mL de meio DMEM liso. Mantenha o estoque em alíquotas de 200 μL a -20 ° C. </li><li> Incubar os VSMCs com 2 mL de meio de tratamento contendo 0,5% de FBS e adicionar extratos CE ou PE para atingir uma concentração de 50 a 500 μg / mL. Mude o meio a cada 24 h adicionando extratos de polifenóis frescos. Trate as células por 3 d. </li><li> Para o tratamento com Ang II ou outros hormônios e fatores de crescimento, fome as células por pelo menos 24 h incubando as células com meio de tratamento contendo 0,5% de FBS antes da adição de Ang II (100 nM). NOTA: Incubação com e sem CE e PE em meio de tratamento com FBS a 0,5% antes da adição de Ang II. <ol><li> Após 24 h de fome, adicione 100 nM de Ang II. Substitua o meio de tratamento por CE, PE ou Ang II frescos a cada 24 h por 3 d. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de amostras de células. <ol><li> Lavar as células tratadas duas vezes em PBS frio e lisá-las com 200 μL de tampão de lise em gelo. </li><li> Coletar lisados ​​celulares usando raspadores de células e transferir os lisados ​​para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube os lisados ​​celulares totais durante 20 min no gelo e vortex a cada 5 min. </li><li> Sonicate os extratos celulares com três rajadas em 125 W por 10 s cada, com uma pausa de 2 s no meio. Mantenha as amostras em gelo ao longo da sonicação. </li><li> Medir a concentração de proteína usando um reagente de teste de proteína a 595 nm. </li><li> Armazene as amostras a -20 ° C para análise por Western blot. </li></ol></li><li> Western blot. <ol><li> Misture quantidades iguais de proteína (cerca de 50 μg) a partir de amostras tratadas não tratadas e tratadas com polifenol ou Ang II com tampão de lise para obter um volume total máximo de 50 μL. Adicione 16 μL de um tampão de amostra 4x Laemmli. Aquecer as amostras por 5 minutos a 75 ° C. </li><li> Separar a amostraEs em 10% de géis SDS-PAGE e transfira-os para membranas PDVF a 10 V durante 75 min em um sistema de transferência semi-seco para análise de Western blot com anticorpos específicos. </li><li> Bloqueie a membrana com 2% de leite em TBS 0,05% de tampão Triton-X100 (TBS-T) durante 20 min. </li><li> Retire o leite lavando a membrana pelo menos três vezes com TBS (5 min cada) e incuba com anticorpos primários durante 1 h à TA ou O / N a 4 ° C. </li><li> Lave a membrana três vezes, 10 min cada, com TBS-T e incuba com um anticorpo secundário ligado a HRP durante 45 min. </li><li> Lave a membrana três vezes, 10 min cada, com TBS-T e desenvolva-se por quimioluminiscência avançada (ECL). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os polifenóis isolados das bagas contêm composições distintas. O protocolo de extração baseado em etanol descrito aqui permitiu a identificação de diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonóides presentes em extratos de polifenóis brutos e purificados de BL ( Tabela 1 ). CE foi enriquecido em ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquinico e ácido 5-O-cafeoilquinico. O processo de purificação não alterou significativamente os níveis de ácido gálico e ácido p-cumarico. No entanto, aumentou os ...

Os polifenóis são compostos contendo pelo menos um anel fenólico em sua estrutura e estão abundantemente presentes no reino vegetal 1 . Os seres humanos têm consumido plantas por milênios para fins medicinais sem estar ciente da existência de tais compostos 2 . Muitas frutas e vegetais têm alguns compostos polifenólicos compartilhados, embora com diferentes quantidades, incluindo flavonóides, stilbenos e ácidos fenólicos 3 . Embora os polifenóis sejam freqüentemente associados a frutas e vegetais coloridos, isso não é estritamente verdadeiro. Por exemplo, a zeaxantina e a xantina estão presentes em vegetais que não são altamente coloridos, como cebolas e alho, que são da família de cebolas e estão associados a numerosos benefícios para a saúde 4 . Além de estar associado a vários benefícios para a saúde 5 , os polifenóis também servem as plantas, protegendo-os de insetos eD radiação ultravioleta 2 . Os polifenóis são comumente encontrados na dieta humana e são considerados poderosos antioxidantes, pois eles podem evitar as espécies reativas de oxigênio (ROS) 6 , 7 , 8 . Eles também têm propriedades antiinflamatórias 9 , antimicrobianas 10 , anti-hipertensivas 11 e antitranscinogênicas 12 , 13 . Estudos epidemiológicos demonstram uma associação inversa entre o consumo de flavonóides e incidência de doença cardiovascular (DCV) 16 , 17 e mortalidade 14 , 15 . As bagas são amplamente consumidas nos EUA e possuem grandes quantidades de polifenóis, incluindo flavonóides. Por exemplo, o consumo de suco de amora (BL) (300<html> ML / d) durante oito semanas diminuiu significativamente a pressão arterial sistólica em pacientes dislipidêmicos 18 . Jeong et al. 19 relataram que homens e mulheres pré-hipertensos que consumiam 2,5 g de extrato de framboesa preta (BRB) por dia tiveram uma pressão arterial baixa de 24 horas e noite em comparação com aqueles que consumiam um placebo. As framboesas (RB) diminuíram a pressão sanguínea ao aumentar a expressão de superóxido dismutase (SOD) em ratos espontaneamente hipertensos 20 . Foi recentemente demonstrado que BL, RB e BRB reduzem os níveis de ROS e senescência induzidos pela angiotensina II (Ang II) em células musculares lisas vasculares (VSMCs) 21 . Além disso, a fração de antocianina do extracto de BL reduziu a expressão de óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e inibiu a atividade do Fator Nuclear kappa B (NF-kB) e cinase regulada por sinal extracelular (ERK) em lipopolisacarídeos (LPS) estimulada Células J774Ass = &quot;xref&quot;&gt; 22. Os extratos de BRB diminuíram a ativação de NF-κB e a expressão de ciclooxigenase 2 (COX-2) in vitro 23 , melhoraram o perfil lipídico e impediram a formação da lesão aterosclerose em camundongos alimentados com uma dieta rica em gordura 24 . As antocianinas, que são consideradas os flavonóides mais abundantes nas bagas, modulam a resposta inflamatória em macrófagos RAW 264.7 estimulados pelo LPS ao diminuir a produção 25 do Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) e diminuir a proliferação e migração de VSMCs 26 . Uma vez que tem crescido o interesse em compreender o papel dos polifenóis na saúde humana e na doença, é importante otimizar o método de extração. A extração de solvente é amplamente utilizada para esse propósito, pois é econômica e facilmente reprodutível. Neste estudo, utilizou-se uma extração solvente com etanol, juntamente com uma extração extraída por ultra-somN método, que foi adaptado de Kim e Lee 27 . A purificação e o fraccionamento de extratos brutos (CE) utilizando clorofórmio e acetato de etilo foram realizados para obter a fração de extrato purificado (PE) que foi adaptada de Queires et al 28 . Além disso, foram comparadas a eficácia de extratos de polifenóis em bruto contra purificado de BL na redução da fosforilação basal de ERK1 / 2 e foram apresentados exemplos representativos do efeito inibitório do extrato de polifenol BL purificado em reduções de sinalização induzidas por Ang II em VSMCs.

<table><tbody><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A9525-10MG</td><td>Tratamento de VSMCs</td></tr><tr><td>&beta;-actina</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>A2228</td><td>Anticorpo primário (1:5000)</td></tr><tr><td>Fruta de amora</td><td>Mercer Foods</td><td></td><td>Pó de amora liofilizado</td></tr><tr><td>Catalase&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>219010</td><td>Anticorpo primário (1:1000)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Biotech Grd, Inc.</td><td>97064-678</td><td>Preparação de extratos de polifenóis purificados</td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)</td> <td>Mediatech, Inc.</td><td>10-014-CV</td><td>Cultura de VSMCs</td></tr><tr><td>Etanol (grau absoluto de biologia molecular)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>E7023-500ML</td><td>Preparação de extratos de polifenóis&nbsp;</td></tr><tr><td>Etilacetato</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>439169</td><td>Preparação de extratos de polifenóis purificados</td></tr><tr><td>ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>9102S</td><td>Anticorpo primário (1:500)</td></tr><tr><td>EDTA, 500 mM, pH 8,0</td><td>Teknova, Inc.</td><td>E0306</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>liofilizador</td><td>Labconco</td><td>VirTis Benchtop K</td><td>Preparação de extratos de polifenóis</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1400-500</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>H3375</td><td>Tampão de lise&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>EMD Millipore, Inc.</td><td>7760</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>NaF</td><td>J.T.Baker, Inc.</td><td>3688-01&nbsp;</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>450243</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>Na4P2O7 , decahidratado</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>S-9515</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>fosfofo ERK1/2&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular, Inc.</td><td>9101S</td><td>Anticorpo primário (1:1000)</td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>P8340-5ml</td><td>Tampão de lise</td></tr><tr><td>Reagente de corante de ensaio de proteína</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de transferência de PVDF</td> para medição de concentração de proteínas <td>Thermo Scientific, Inc.</td><td>88518</td><td>Western blots</td></tr><tr><td>Evaporador Rotativo</td><td>Buchi Labortechnik</td><td>Rotavapor R3000</td><td>Preparação de extratos de polifenóis</td></tr><tr><td>Água estéril</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-055-CV</td><td>Preparação de extratos de polifenóis</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>QSonica, LLC</td><td>Q125</td><td>Preparação de extratos celulares</td></tr><tr><td>SOD2</td><td>Enzo Life Sciences, Inc.</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td>Anticorpo primário (1:1000)</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>X100</td><td>Western borrões</td></tr><tr><td>Whatman #2 papel de filtro</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>28317-241</td><td>Preparação de extractos de polifenóis</td></tr></tbody></table>

extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares<em&gt; in vitro</em

Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro

Estudos epidemiológicos indicam que o aumento da ingestão de flavonóides correlaciona-se com a diminuição da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV) nos Estados Unidos (EUA) e na Europa. As bagas são amplamente consumidas nos EUA e têm um alto conteúdo polifenólico. Os polifenóis demonstraram interagir com muitos alvos moleculares e exercer numerosas funções biológicas positivas, incluindo efeitos antioxidantes, anti-inflamatórios e cardioprotetores. Os polifenóis isolados do blackberry (BL), da framboesa (RB) e da framboesa preta (BRB) reduzem o estresse oxidativo e a senescência celular em resposta à angiotensina II (Ang II). Este trabalho fornece uma descrição detalhada do protocolo usado para preparar os extratos de polifenóis de bagas liofilizadas. As extracções de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado foram realizadas utilizando 80% de etanol aquoso e um método de extração assistida por ultra-som. O extracto em bruto foi ainda purificado e fraccionado utilizando clorofórmio e acetato de etilo,respectivamente. Os efeitos de extratos brutos e purificados foram testados em células musculares lisas vasculares (VSMCs) em cultura.

Foi demonstrado anteriormente que os extratos de polifenóis isolados de BL, RB e BRB reduziram a senescência de VSMCs em resposta a Ang II 21 . Verificou-se que estes extratos de polifenóis purificados modulam a sinalização de Ang II através da redução da fosforilação de Akt, p38 Mitrogen-activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL evita a senescência ao reduzir a expressão da NADPH oxidase (Nox) 1, uma enzima que produz aniões superóxido e está fortemente regu...

Este trabalho detalha um método passo a passo para preparar extratos ricos em polifenóis de pó de baga liofilizado. Além disso, fornece uma descrição completa de como usar esses extratos ricos em polifenóis em cultura celular na presença do hormônio peptídico angiotensina II (Ang II) usando células musculares lisas vasculares (VSMCs).

Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares<em&gt; In Vitro</em

Epidemiological studies indicate that increased flavonoid intake correlates with decreased mortality due to cardiovascular diseases (CVD) in the United ...

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples e reprodutível para a extração e purificação de polifenóis vegetais que possam ser usados para tratar células no futuro. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o papel da função dos alimentos na saúde humana e nas doenças. Esta extração de polifenóis baseada em etanol e assistida por ultrassom é um método fácil e reprodutível que permite um rendimento mais alto de polifenóis.O uso de clorofórmio permite a remoção de açúcares, ácidos graxos, proteínas e outras moléculas, enquanto o acetato de etila permite a fracionamento de polifenóis. Esses extratos concentrados de polifenóis podem então ser utilizados in vitro e in vivo para estudar os efeitos dos polifenóis, bem como seus mecanismos de ação em diversos tecidos, incluindo o sistema cardiovascular, conforme descrito aqui. Para iniciar este procedimento, prepare os reagentes conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, pese 10 gramas de pó de amora-preta liofilizado. Adicione o pó das frutas a um balão de fundo redondo de um litro contendo 100 mililitros de etanol aquoso a 80%. Coloque o balão em um banho ultrassônico a 25 graus Celsius.Sob purgação contínua de nitrogênio e em luz reduzida, sonique a mistura por 20 minutos a 42 kilohertz e 135 watts. Após isso, utilize um funil de Büchner gelado com sucção a vácuo para filtrar a mistura através de papel filtro número dois. Lave o bolo filtrado com 50 mililitros de etanol a 100%.Guarde o filtrado e adicione o resíduo filtrado a um balão de fundo redondo de um litro contendo 100 mililitros de etanol aquoso a 80%. Em seguida, repita o processo de extração por sonicamento, filtração e lavagem da mistura. Combine os dois filtrados em um balão de fundo redondo contendo 50 mililitros de etanol aquoso a 80%.Usando um evaporador rotativo a 62 graus Celsius e 50 rpm, evapore o solvente. Continue até que o etanol não evapore mais. Em seguida, transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mililitros.Injete gás nitrogênio na parte superior do tubo durante 10 minutos para evaporar qualquer etanol remanescente. Congele a amostra a menos 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas. Em seguida, liofilize a amostra a menos 50 graus Celsius por aproximadamente oito horas.Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius até o momento do uso. Para iniciar, pese as amostras extraídas liofilizadas. Adicione aproximadamente 20 mililitros de clorofórmio a um béquer de 100 mililitros contendo a amostra.Usando uma placa de agitação, misture a solução por cinco minutos. Em seguida, despeje a mistura em um funil de separação. Deixe o extrato bruto decantar por uma hora à temperatura ambiente.Após isso, descarte a camada inferior e colete a camada aquosa em um béquer limpo. Adicione dois volumes de acetato de etila ao béquer. Usando uma barra de agitação magnética, agite a mistura por cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, utilize um funil de Büchner gelado com sucção a vácuo para filtrar a mistura através de papel filtro número dois. Transfira a amostra filtrada para um balão de fundo redondo. Usando um evaporador rotativo a 62 graus Celsius e 50 rpm, evapore o acetato de etila por 30 minutos.Após isso, liofilize a amostra a menos 50 graus Celsius por oito horas. Transfira a amostra para um tubo cônico de 50 mililitros e armazene a menos 20 graus Celsius até o momento do uso. Após o cultivo das células musculares lisas vasculares, descarte o meio de cultura e lave as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato.Em seguida, adicione quatro mililitros de PBS e dois mililitros de Tripsina-EDTA 0,25%. Incube em uma estufa de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após isso, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros contendo dois mililitros de meio completo.Centrifugue a 1.100 × g durante cinco minutos. Descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular com um mililitro de PBS. Usando um hemocitômetro, conte as células.Em seguida, em placas de cultura de seis poços, semeie 50.000 células por poço. Cultive as células até atingirem 90% de confluência em meio completo contendo 10% de soro bovino fetal. Prepare o meio de tratamento conforme descrito no protocolo textual e armazene a quatro graus Celsius.Em seguida, adicione 10 miligramas de extrato bruto ou purificado a um mililitro de DMEM simples para preparar uma solução estoque de 10 miligramas por mililitro. Armazene a solução estoque em alíquotas de 200 microlitros a menos 20 graus Celsius. Após isso, adicione dois mililitros de meio de tratamento, contendo 0,5% de soro bovino fetal e a concentração desejada da solução estoque, às células.Incubar por três dias a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com 5% de CO2. Em seguida, se for tratar com hormônios ou fatores de crescimento, privar as células de nutrientes por pelo menos 24 horas, incubando-as com meio de tratamento contendo 0,5% de soro bovino fetal. Após a privação, adicionar o hormônio desejado, substituindo o meio de tratamento a cada 24 horas durante três dias, conforme detalhado no protocolo no texto.Em seguida, lave as células tratadas duas vezes com PBS frio. Lisar as células utilizando 200 microlitros de tampão de lise em gelo. Usando espátulas para células, colete o lisado celular e transfira para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro.Incube o lisado coletado por 20 minutos no gelo, fazendo vortex a cada cinco minutos. Após esse período, sonique os extratos celulares com três rajadas de 10 segundos cada a 125 watts, com uma pausa de dois segundos entre cada rajada. Utilizando um reagente de ensaio proteico a 595 nanômetros, meça a concentração de proteína.Misture 50 microgramas de proteína com tampão de lise para obter um volume total máximo de 50 microlitros. Adicione 16 microlitros de um tampão amostral 4x Laemmli. Em seguida, aqueça as amostras por cinco minutos a 75 graus Celsius.Separar as amostras em géis de SDS-PAGE 10% e transferir para membranas de PVDF para análise por Western blot com anticorpos específicos. Neste estudo, utiliza-se uma extração baseada em etanol para identificar os diferentes níveis de ácidos fenólicos e flavonoides presentes em extratos brutos e purificados de polifenóis de amora. Embora o processo de purificação não tenha alterado significativamente os níveis de ácido gálico ou ácido p-cumárico, ele aumentou os níveis de ácido 3-O-cafeoilquíncico de 170,5 para 235,3 ppm e de quercetina de 24,5 para 95 ppm.Em contraste, o ácido ferúlico e a rutina foram perdidos durante a purificação do extrato bruto. Após a extração, as células musculares lisas vasculares (VSMCs) foram incubadas em concentrações de 50 a 500 microgramas por mililitro de extrato de amora bruto ou purificado, em meio contendo 0,5% de soro bovino fetal, durante três dias. Observou-se que ambos os extratos são eficazes na redução da fosforilação basal de ERK.No entanto, observa-se que o extrato purificado regula fortemente para baixo a 100 microgramas por mililitro, enquanto são necessários de 400 a 500 microgramas por mililitro do extrato bruto. Isso sugere que a maior eficiência do extrato purificado em inibir a fosforilação da ERK se deve às suas concentrações mais elevadas de compostos polifenólicos. Após isso, as células musculares lisas vasculares são tratadas durante 24 horas com 200 microgramas por mililitro de extrato purificado de amora antes da adição de 100 nanomols de angiotensina II. Conforme relatado anteriormente, o extrato de polifenóis de amora reduz a fosforilação da ERK induzida pela angiotensina II, mas não demonstra efeito sobre a expressão da catalase ou da SOD2.Uma vez dominada, a extração de polifenóis pode ser realizada em algumas horas. Esta técnica pode auxiliar pesquisadores na área de alimentos funcionais a explorar o papel dos polifenóis in vitro e em modelos animais. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de extrair e purificar polifenóis de frutas e vegetais e utilizar os extratos de polifenóis para tratar células em cultura.Utilizamos este método para demonstrar o papel dos polifenóis da amora na prevenção do envelhecimento das células musculares lisas vasculares aórticas. Isso é significativo, considerando que o envelhecimento do sistema vascular é um fator de risco importante para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares.

extraction-purification-polyphenols-from-freeze-dried-berry-powder

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Extração e purificação de polifenóis a partir de pó de baga liofilizado para o tratamento de células musculares lisas vasculares In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal

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