Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

O objetivo geral deste procedimento é induzir a ablação direcionada de células epiteliais do rim de peixe-zebra para modelar lesão e reparo de néfrons. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da regeneração de órgãos, especificamente do rim, tais como: quais são os principais processos celulares envolvidos na regeneração, qual é o grau de plasticidade dos tecidos remanescentes, entre muitas outras.

A principal vantagem desta técnica é que ela permite um controle preciso do espaço e do tempo da lesão, bem como a possibilidade de ajustar o grau de lesão. As implicações desta técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico da lesão renal aguda, pois permitem a avaliação precisa dos processos celulares e moleculares envolvidos na lesão e regeneração das células renais, em termos espaciais e temporais. Para começar, gere embriões cruzando peixes-zebra fluorescentes GFP renais.

Por 24 horas após a fertilização, mantenha os embriões em solução E3 a 28,5 graus Celsius. Em seguida, utilize PTU a 0,003% em E3 para substituir o meio E3. Retorne os embriões ao incubador por seis ou mais dias, momento em que os rins já terão amadurecido.

Para mapear o peixe-zebra para imagem em tempo real, prepare uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 1% a 2% com solução de tricaina a 0,2 miligramas por mililitro. Certifique-se de que a solução de agarose com tricaina esteja fria antes de usar uma pipeta de plástico ou vidro para transferir um embrião para a solução. Em seguida, usando uma pipeta de transferência, aspire a larva na agarose e coloque-a no centro de uma placa de 35 milímetros.

Espalhe rapidamente o agarose contendo o peixe-zebra para cobrir uniformemente o fundo do recipiente. Em seguida, use uma sonda de vidro para posicionar a larva para ablação fotônica e imagem, de modo que o segmento renal de interesse fique perpendicular ao trajeto do feixe, enquanto o segmento contralateral esteja afastado do feixe a laser. O posicionamento do peixe-zebra é crucial para as etapas subsequentes que envolvem ablação a laser.

Recomenda-se uma boa técnica para garantir que as larvas mantenham uma posição perpendicular no agarose. Cubra a placa de Petri para minimizar a evaporação e deixe o agarose solidificar por cerca de 15 minutos. Após configurar o microscópio confocal, de acordo com o protocolo descrito no texto, na configuração ereta, posicione a placa de Petri contendo a larva sobre uma lâmina de microscopia e utilize massa de modelar para mantê-la no lugar.

Em seguida, posicione o prato de Petri deslizante sobre a platina do microscópio. Depois, adicione três mililitros da solução de imagem. Sob uma lente de imersão em água, eleve lentamente a platina, certificando-se de que a lente esteja ligeiramente inclinada para evitar que o ar fique aprisionado no caminho do feixe.

Uma vez que a lente toque a solução em um ângulo, centralize-a para que fique no campo de visão do embrião. Agora, utilizando a fonte de luz fluorescente, localize o segmento de interesse e, em seguida, foque no ramo superficial para direcionar a lesão. Os ramos superficiais são escolhidos para minimizar a dispersão da luz.

No software do microscópio, navegue até visualização, controle de aquisição, GUI compacta C2plus. Defina o tempo de permanência do pixel como 1,9 microssegundos, o tamanho do quadro como 512 por 512 pixels e o tamanho do pinhole como 90 mícrons. Defina a intensidade do laser de 405 nanômetros como zero e a intensidade do laser de 488 como um valor baixo.

Ao usar o laser de 488 nanômetros, clique em escanear na interface do software. Localize o segmento de interesse que é perpendicular ao trajeto do feixe e que está bem visualizado com boa fluorescência GFP. Uma vez identificada essa região, acesse ROI, desenhe um ROI elíptico, para delimitar uma região de interesse.

Em seguida, navegue até visualização, controles de aquisição, área de varredura C2plus e selecione a área de varredura em faixa; uma máscara retangular aparecerá dentro dessa interface. Usando o cursor, defina manualmente uma varredura retangular para cobrir o segmento destinado à ablación a laser. Clique com o botão direito dentro da área da máscara para aceitar a seleção.

Usando apenas o laser de 488 nanômetros para ativar a GFP, inicie a medição do tempo enquanto monitora o canal verde. Certifique-se de que a intensidade do laser de 488 nanômetros seja relativamente baixa. Meça a intensidade média da GFP na região de interesse selecionando medição, medição de tempo.

Utilize o gráfico ou a guia de dados para monitorar os níveis médios de intensidade dentro da ROI. Usando o laser violeta, induza dano às células renais aumentando a intensidade para 100% movendo o controle de potência do laser completamente para a direita. Na guia de gráfico, observe um gráfico de linhas ou use a guia de dados para observar os valores numéricos da intensidade de GFP e aguarde até que ela diminua para um nível desejado.

Por exemplo, 50% da linha de base. Assim que a intensidade de GFP dentro da ROI elíptica diminuir para o nível desejado, reduza imediatamente a intensidade do laser violeta para zero no painel de controle do software, movendo o controle deslizante de potência do laser totalmente para a esquerda. Por fim, obtenha uma nova linha de base da fluorescência de GFP.

Como mostrado nesta figura, após a exposição à luz laser de 405 nanômetros, a fluorescência da GFP continua a desaparecer uma célula de cada vez. Até os 220 minutos, todo o segmento ablado perde 100% da sua positividade para GFP. Isso se deve à morte celular e não à regulação negativa da expressão da GFP, como observado pelo aparecimento de núcleos positivos para iodeto de propídio com fluorescência vermelha nas células que perdem a positividade para GFP.

Essas imagens demonstram que, ao variar a exposição inicial, é possível ajustar a lesão e a resposta do epitélio lesionado. Com 10% a 20% de descoloração inicial da GFP, praticamente nenhuma redução na positividade para GFP é observada cinco horas após a lesão. 50% e 60% levam à desaparição completa da GFP após cinco horas, enquanto a descoloração de 30% e 40% resulta em resultados intermediários, com morte estimada em 50% observada em aproximadamente 35% de descoloração.

Isso é confirmado pela coloração com iodeto de propídio, na qual o branqueamento fotográfico de 20% resulta praticamente em nenhuma coloração com iodeto de propídio aos 100 minutos após a ablação. No entanto, o branqueamento fotográfico de 50% leva à positividade contínua ao iodeto de propídio no epitélio ablado após 60 minutos. Enquanto isso, os branqueamentos fotográficos de 30% e 40% levam a uma incorporação intermediária de iodeto de propídio.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 30 minutos se for executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com lasers e reagentes químicos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como evitar olhar diretamente para o feixe de laser e usar luvas ao manipular produtos químicos, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia de lapso de tempo, coloração por imunofluorescência e outros, podem ser realizados para responder perguntas adicionais destinadas a investigar a lesão e a reparação renal nos níveis celular e molecular.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de regeneração renal. Para explorar o papel da migração coletiva de células e da reparação renal após lesão em peixes-zebra. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a microscopia confocal para lesionar segmentos renais específicos em larvas e embriões de peixes-zebra transgênicos GFP.