Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

O objetivo geral deste procedimento é medir a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área dos microtúbulos, como a forma pela qual mutações em tubulinas e reguladores dos microtúbulos afetam a dinâmica dos microtúbulos em uma célula viva. A principal vantagem desta técnica é que as células de levedura vivas são estabilizadas na imagem.

Em vez disso, alta resolução temporal por dez minutos ou baixa resolução temporal por várias horas. O procedimento será demonstrado por Colby Fees e Cassi Estrem, dois estudantes de pós-graduação do meu laboratório. As células de levedura utilizadas neste experimento foram construídas para expressar constitutivamente tubulina marcada com GFP.

Inocule cerca de um microlitro de células de levedura de uma única colônia em uma placa em três mililitros de meio sintético completo. Deixe as células crescerem durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 250 RPM. No dia seguinte, dilua a cultura saturada para uma OD600 inferior a 0,1 no meio.

Retorne a cultura diluída ao agitador a 30 graus Celsius por três a quatro horas, ou até que a DO600 esteja entre 0,4 e 0,8. Inicie a preparação das lâminas de câmara de fluxo cortando uma folha de filme de parafina em um pedaço medindo quatro polegadas de largura por sete polegadas de comprimento. Coloque uma lâmina de microscópio padrão no sentido do comprimento sobre a largura de quatro polegadas do filme de parafina e enrole o filme ao redor da lâmina de três a quatro vezes, de modo que a lâmina fique coberta com uma película de três a quatro camadas de espessura.

Pressione as camadas juntas para garantir um selamento adequado, mas evite pressionar com muita força ou causar rugas no filme. Usando uma lâmina limpa de estilete e outro lâmina para fornecer uma borda reta para o corte, corte o filme de parafina ao longo das bordas externas da lâmina. Remova o filme excedente da lâmina de trabalho e descarte-o.

Usando o segundo lâmina como guia reta, corte as camadas empilhadas do filme ao longo do eixo longo da lâmina em aproximadamente 10 tiras, cada uma com dois a quatro milímetros de largura. Em seguida, corte as camadas empilhadas do filme de parafina perpendicularmente aos cortes anteriores, ao longo do eixo curto da lâmina, para criar tiras com dois a quatro milímetros de largura, 23 a 24 milímetros de comprimento e com espessura de três a quatro camadas. Use uma lâmina em um ângulo de 45 graus para destacar as tiras de filme cortadas.

Em seguida, use pinças para distribuir uniformemente as tiras cortadas sobre uma lâmina de microscópio limpa, criando o número desejado de câmaras. Neste exemplo, quatro tiras de filme serão usadas para criar três câmaras. Coloque uma única lamínula sobre as tiras de filme e posicione-a com pinças.

Coloque a lâmina preparada, com a lamínula voltada para cima, sobre uma placa aquecida ajustada em aproximadamente 95 graus Celsius, e aqueça a lâmina por cerca de três minutos, até que as tiras de filme fiquem translúcidas. Sobreponha a lâmina e a lamínula pressionando suavemente, com pinça, as regiões da lamínula que estão diretamente acima das tiras de filme de parafina. Utilize pinças para remover a lâmina da placa aquecida e deixe-a esfriar com o lado da lamínula voltado para cima.

À medida que a lâmina esfria, o filme retornará à coloração branca opaca. Para iniciar este procedimento, descongele um alíquota congelado de 200 microlitros de Concanavalina A em temperatura ambiente. Adicione aproximadamente 100 microlitros de Concanavalina A descongelada a cada câmara da lâmina preparada, pipetando em uma das extremidades abertas.

Em seguida, pendure a lâmina, com a lamínula voltada para baixo, entre duas grades para tubos microcentrífugos durante cinco minutos para permitir que a concanavalina A adira à lamínula. Retorne a lâmina para a posição com a lamínula para cima e remova a concanavalina A lavando a câmara com meio sintético completo. Passe um volume de meio equivalente a duas vezes o volume da câmara através dela, usando o canto de uma toalha de papel para puxar o líquido de uma extremidade da câmara, enquanto simultaneamente se pipeta líquido fresco na outra extremidade da câmara.

Carregue as células fluindo duas vezes o volume da câmara de suspensão celular utilizando o método de fluxo direcionado. Pendure a lâmina, com a lamínula voltada para baixo, por 10 minutos para permitir que as células adiram à lamínula. Remova as células não aderidas fluindo quatro vezes o volume da câmara com meio sintético completo.

Seque cuidadosamente cada extremidade da câmara com um canto limpo de uma toalha de papel, trazendo o menisco até a borda da lamínula. Selle cada extremidade da câmara com selante aquecido. A aquisição de imagens será realizada com um microscópio invertido equipado com um objetivo CFI Plan Apo 100X com NA 1,45, uma platina piezoelétrica, uma unidade de varredura confocal de disco giratório, um laser de iluminação e uma câmera EMCCD.

Mantenha a temperatura da platina em temperatura ambiente durante a aquisição de imagens. Foque as células e examine a lâmina em busca de células agrupadas para garantir que o campo de aquisição tenha pelo menos cinco a seis células agrupadas no mesmo plano focal. Programe uma aquisição multidimensional para coletar múltiplas séries z ao longo do tempo.

Ajuste as configurações nas configurações ativas de aquisição para os seguintes valores: profundidade Z total de seis micrômetros para abranger toda a célula de levedura, tamanho do passo Z de 300 nanômetros para maximizar a coleta de luz sem superamostragem, duração total de 10 minutos, intervalos de tempo de quatro segundos entre as séries Z e tempo de exposição de 90 milissegundos para cada plano Z. Inicie a aquisição clicando em Executar e permita que ela prossiga durante toda a duração de 10 minutos. Os dados são salvos como uma série de imagens, e um exemplo de resultado de imagem em lapso de tempo é mostrado aqui.

Inicie a análise de imagem abrindo o ImageJ e arrastando diretamente a pilha de imagens adquirida para o painel de controle. Os formatos bio importados serão iniciados automaticamente. Selecione "Ok" para carregar a pilha de imagens como uma hiperpilha.

Utilizando a função ZProject, colapse cada série z em uma projeção bidimensional de intensidade máxima. Aplique um filtro mediano à pilha de imagens para reduzir o ruído tipo speckle, selecionando o menu Processo, o submenu Filtro e a opção Mediana. Insira 2,0 pixels na caixa de raio e clique em OK. Identifique as células pré-NFA no campo.

Essas características são definidas por brotos de tamanho médio e um fuso mitótico curto, com cerca de um a um ponto cinco micrômetros de comprimento. A partir do primeiro ponto temporal da série de imagens, utilize a ferramenta de linha segmentada para desenhar uma linha ao longo de um único microtúbulo astral, partindo da junção entre o microtúbulo astral e os microtúbulos do fuso, que são mais intensamente marcados, até a extremidade positiva, localizada no citoplasma. Dê dois cliques na extremidade do microtúbulo para concluir a linha segmentada.

Registre a medida na tabela de resultados utilizando a ferramenta de medição pressionando o botão M no teclado. Após as medições terem sido realizadas em todos os pontos temporais, copie os dados da tabela de resultados, cole-os em uma planilha e selecione "Salvar como" para selecionar os dados. Este gráfico exibe uma série temporal da dinâmica dos microtúbulos astrais em uma célula do tipo selvagem e em uma linhagem mutante previamente descrita como possuindo microtúbulos mais estáveis.

Os microtúbulos são marcados com alfa-tubulina marcada com GFP para visualizar o comprimento dos microtúbulos. As setas vermelhas indicam o comprimento total de um microtúbulo astral, com as pontas das setas indicando as extremidades positivas. Os comprimentos dos microtúbulos foram medidos em cada ponto de tempo durante oito minutos, e esses comprimentos compilados são representados em gráficos de vida.

Os pontos verdes indicam polimerização, e os pontos rosas indicam despolimerização. Os eventos de catástrofe são indicados por cabeças de seta. Esses gráficos mostram que o microtúbulo no mutante é mais longo e apresenta menos catástrofes do que o microtúbulo do tipo selvagem.

Além disso, as taxas de polimerização e despolimerização determinadas a partir das inclinações dos comprimentos de microtúbulos ascendentes e descendentes estão reduzidas no mutante em comparação com o tipo selvagem. Medições da dinâmica de microtúbulos também revelam que o microtúbulo na célula mutante apresenta dinamicidade reduzida em comparação com o tipo selvagem. Uma vez dominada, a preparação da lâmina, o carregamento celular e a aquisição de imagens podem ser realizadas em 30 minutos, o que significa que muitas amostras diferentes podem ser analisadas em um único dia.

As câmaras de microscopia podem ser preparadas e armazenadas previamente antes da adição de concanavalina A. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabilizar células de levedura em câmaras de microscopia simples, realizar imagens em quatro dimensões e medir a dinâmica de microtúbulos em células vivas. Além dos microtúbulos, este procedimento pode ser modificado para medir a dinâmica de outras proteínas marcadas com fluorescência em células vivas de levedura em escalas de tempo que variam de segundos a horas.