Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

O objetivo geral deste procedimento é medir a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos microtúbulos, como como mutações em túbulos e reguladores de microtúbulos regulam a dinâmica dos microtúbulos em uma célula viva. A principal vantagem dessa técnica é que as células vivas de levedura são estabilizadas na imagem.

Em vez disso, alta resolução de tempo por dez minutos ou baixa resolução de tempo por várias horas. Demonstrando o procedimento estarão Colby Fees e Cassi Estrem, dois alunos de pós-graduação do meu laboratório. As células de levedura usadas neste experimento foram construídas para expressar constitutivamente a tubulina marcada com GFP.

Inocular cerca de um microlitro das células de levedura de uma única colônia em uma placa em três mililitros de meio sintético completo. Deixe as células crescerem durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 250 RPM. No dia seguinte, diluir a cultura saturada para um OD600 inferior a 0,1 no meio.

Retorne a cultura diluída ao agitador de 30 graus Celsius por três a quatro horas ou até que o OD600 esteja entre 0,4 e 0,8. Comece a preparação das lâminas da câmara de fluxo cortando uma folha de filme de parafina em um pedaço medindo quatro polegadas de largura e sete polegadas de comprimento. Coloque uma lâmina de microscópio padrão longitudinalmente na largura de quatro polegadas do filme de parafina e enrole o filme ao redor da lâmina três a quatro vezes, de modo que a lâmina seja coberta com um filme de três a quatro camadas de espessura.

Pressione as camadas juntas para garantir que haja uma vedação razoável, mas evite pressionar com muita força ou fazer com que o filme enrugue. Usando uma navalha de estilete limpa e outra lâmina para fornecer uma borda reta para o corte, corte o filme de parafina ao longo das bordas externas da lâmina. Retire o excesso de filme da lâmina de trabalho e descarte.

Usando a segunda lâmina como uma borda reta, corte as camadas de filme empilhadas ao longo do eixo longo da lâmina em aproximadamente 10 tiras, cada uma com dois a quatro milímetros de largura. Em seguida, corte as camadas de filme de parafina empilhadas perpendicularmente aos cortes anteriores ao longo do eixo curto da lâmina para criar tiras de dois a quatro milímetros de largura, 23 a 24 milímetros de comprimento e três a quatro camadas de espessura. Use uma navalha em um ângulo de 45 graus para descascar as tiras de filme cortadas.

Em seguida, use uma pinça para distribuir uniformemente as tiras cortadas em uma lâmina de microscópio limpa para criar o número desejado de câmaras. Neste exemplo, quatro tiras de filme serão usadas para criar três câmaras. Coloque uma única lamínula em cima das tiras de filme e mova-a para a posição com uma pinça.

Coloque a lâmina preparada, com a lama para cima, em uma placa quente ajustada a cerca de 95 graus Celsius e aqueça a lâmina por aproximadamente três minutos até que as tiras de filme fiquem translúcidas. Sele a lâmina e a lamínula usando uma pinça para pressionar suavemente as regiões da lamínula que estão diretamente acima das tiras de filme de parafina. Use uma pinça para remover a corrediça da placa quente e deixe-a esfriar com o lado da lamínula voltado para cima.

À medida que o slide esfria, o filme retornará a uma coloração branca opaca. Para iniciar este procedimento, descongele uma alíquota congelada de 200 microlitros de Concanavalina A à temperatura ambiente. Adicione aproximadamente 100 microlitros de Concanavalina A descongelada a cada câmara da lâmina preparada, pipetando em uma das extremidades abertas.

Em seguida, pendure a lâmina, com a lamínula para baixo, entre dois racks de tubos de microcentrífugas por cinco minutos para permitir que a Concanavalina A adira à lamínula. Retorne a corrediça para uma posição deslizante de cobertura e remova a Concanavalina A lavando a câmara com meio sintético completo. Flua duas vezes o volume da câmara do meio através da câmara usando o canto de uma toalha de papel para retirar o fluido de uma extremidade da câmara, enquanto simultaneamente pipeta o fluido fresco para a outra extremidade da câmara.

Células de carga fluindo duas vezes o volume da câmara de suspensão de células usando o método de fluxo direcionado. Pendure a lâmina, com a lamínula para baixo, por 10 minutos para permitir que as células adiram à lamínula. Lave todas as células não aderentes fluindo através de quatro vezes o volume da câmara do meio sintético completo.

Seque cuidadosamente cada extremidade da câmara com um canto limpo de uma toalha de papel, levando o menisco até a borda da lamínula. Sele cada extremidade da câmara com selante quente. A aquisição de imagens será realizada com um microscópio invertido equipado com uma objetiva 1.45 NA 100X CFI Plan Apo, um estágio piezoelétrico, uma unidade de varredura confocal de disco giratório, um laser de iluminação e uma câmera EMCCD.

Mantenha a temperatura da platina à temperatura ambiente durante a aquisição da imagem. Coloque as células em foco e procure no slide por células agrupadas para garantir que o campo de aquisição tenha pelo menos cinco a seis células agrupadas no mesmo plano focal. Programe uma aquisição multidimensional para coletar vários zSeries ao longo do tempo.

Ajuste as configurações dentro das configurações de aquisição ativa para o seguinte: profundidade Z total de seis micrômetros para abranger toda a célula de levedura, tamanho do passo Z de 300 nanômetros para maximizar a coleta de luz sem sobreamostragem, duração total de 10 minutos, intervalos de tempo de quatro segundos entre zSeries e tempo de exposição de 90 milissegundos para cada plano Z. Inicie a aquisição clicando em Executar e permita que ela seja executada por 10 minutos completos. Os dados são salvos como uma série de imagens e um exemplo de resultado de imagem de lapso de tempo é mostrado aqui.

Inicie a análise da imagem abrindo o ImageJ e arrastando a pilha de imagens adquiridas diretamente para o painel de controle. Os formatos biográficos importados serão iniciados automaticamente. Selecione OK"para carregar a pilha de imagens como uma hiperpilha.

Usando a função ZProject, recolha cada zSeries em uma intensidade máxima de projeção bidimensional. Aplique um filtro médio à pilha de imagens para reduzir o ruído de manchas selecionando o menu de processo, o submenu de filtro e o recurso de mediana. Digite 2,0 pixels na caixa de raio e clique em OK"Identifique as células pré-NFA no campo.

Estes são caracterizados por botões de tamanho médio e um fuso mitótico curto com cerca de um a um ponto de cinco micrômetros de comprimento. Começando no primeiro ponto de tempo da série de imagens, use a ferramenta de linha segmentada para desenhar uma linha ao longo de um único microtúbulo astral a partir do localizado na junção entre o microtúbulo astral e os microtúbulos fusiformes mais intensamente marcados, até a extremidade positiva, que está no citoplasma. Clique duas vezes na extremidade do microtúbulo para completar a linha segmentada.

Registre a medição na tabela de resultados usando o recurso de medição pressionando o botão M no teclado. Depois que as medições forem feitas para todos os pontos de tempo, copie os dados da tabela de resultados, cole-os em uma planilha e selecione Salvar como"para selecionar os dados. Este gráfico exibe uma série temporal da dinâmica dos microtúbulos astrais em uma célula do tipo selvagem e uma cepa mutante que demonstrou anteriormente ter microtúbulos mais estáveis.

Os microtúbulos são rotulados como tubulina alfa marcada com GFP para visualizar o comprimento dos microtúbulos. As setas vermelhas traçam o comprimento total de um microtúbulo astral, com as pontas das setas denotando as extremidades positivas. Os comprimentos dos microtúbulos foram medidos em cada ponto de tempo por oito minutos, e esses comprimentos compilados são representados em gráficos de vida.

Os pontos verdes denotam polimerização e os pontos rosa denotam despolimerização. Eventos de catástrofe são indicados por pontas de seta. Esses gráficos mostram que o microtúbulo no mutante é mais longo e exibe menos catástrofes do que o microtúbulo do tipo selvagem.

Além disso, as taxas de polimerização e despolimerização determinadas a partir das inclinações dos comprimentos dos microtúbulos ascendentes e descendentes são diminuídas no mutante em comparação com o tipo selvagem. As medições da dinâmica dos microtúbulos também revelam que o microtúbulo na célula mutante diminuiu a dinamicidade em comparação com o tipo selvagem. Uma vez dominado, a preparação da lâmina, o carregamento da célula e a aquisição da imagem podem ser realizados em 30 minutos, o que significa que muitas amostras diferentes podem ser visualizadas em um único dia.

As câmaras de lâminas podem ser feitas e armazenadas com antecedência antes de adicionar Concanavalina A. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabilizar células de levedura em câmaras de lâminas simples, imagem em quatro dimensões e medir a dinâmica dos microtúbulos em células vivas. Além dos microtúbulos, esse procedimento pode ser modificado para medir a dinâmica de outras proteínas marcadas com fluorescência em células vivas de levedura em escalas de tempo que variam de segundos a horas.