Name: Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a medir a ligação de proteínas à actina F por co-sedimentação. Este método acessível utiliza ultracentrifugação e SDS-PAGE para quantificar a afinidade da interação proteína-actina em estudos de biologia celular.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant HL127711 para AVK.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O ensaio de co-sedimentação de actina é uma técnica direta que pode determinar rapidamente se uma proteína se liga à F-actina. Com algumas modificações, a técnica também pode ser usada para medir a afinidade da interação. Além dos pontos levantados no protocolo acima, as questões a seguir devem ser consideradas ao projetar, conduzir e interpretar o ensaio. Proteína de Interesse Pode utilizar-se uma proteína recentemente preparada ou congelada no ensaio. Se for utilizada proteína congelada, recomenda-se que os resultados sejam comparados com proteínas frescas (nunca congeladas) para assegurar que o congelamento não afecte a ligação da F-actina. G-actina Fonte Muitas experiï¿½cias de granulaï¿½o utilizam G-actina isolada do mï¿½culo devido ï¿½sua abundï¿½cia relativa. Existem três principais isotipos de actina em mamíferos - alfa, beta e gama - que são notavelmente semelhantes (&gt; 90%Ty). No entanto, existem diferenças funcionais entre os isotipos 12 , 13 . Se possível, o isotipo G-actina utilizado no ensaio de ligação deve corresponder ao isotipo in vivo . Por exemplo, se testar uma proteína expressa no músculo esquelético, alfa-actina é a melhor escolha; Se examinar uma proteína expressa em fibroblastos, beta-actina é recomendada. Uso de Phalloidin Uma vez que a faloidina se liga à F-actina, pode interferir ou mesmo bloquear a ligação de algumas proteínas de ligação a F-actina ( por exemplo, a faloidina bloqueia a cofilina da ligação a filamentos de actina) 14 . Assim, phalloidin deve ser usado com cautela e os resultados em comparação com não-phalloidin-tratados amostras quando possível. Fundo alto Não é raro que as proteínas se sedimentem na ausência de F-actina ( Figura 1A , nenhuma amostra de peletes de F-actinaS). No entanto, níveis elevados de sedimentação de fundo podem mascarar a verdadeira co-sedimentação de actina e tornar difícil, se não impossível, determinar se uma proteína se liga à F-actina ou medir a afinidade da interação. Adicionar polidicanol ao tampão de reacção (passo 4.1) pode reduzir significativamente o fundo e é uma solução fácil. Se isso não reduzir o fundo, o ajuste do tampão de reação, da concentração de sal e / ou da temperatura de incubação pode ajudar. Curva de encadernação Para gerar uma curva de ligação, é necessário variar a concentração quer da proteína de interesse quer da F-actina através de uma série de reacções. Na prática, é mais fácil e preferível manter F-actina numa concentração fixa e variar a concentração da proteína de interesse. A manutenção da F-actina numa concentração fixa ( por exemplo, 2 μM) no ensaio de peletização limita a captura não específica em concentrações mais elevadas de F-actina e impedeDepolimerização a concentrações mais baixas (&lt;0,5 μM) de F-actina. A despolimerização pode ser prevenida usando phalloidin, embora isto introduza um fator de complicação potencial no sistema (veja o passo 3.3 e acima). A manutenção da F-actina numa concentração fixa também permite comparar (e normalizar) a pastilha de actina F entre amostras e identificar experiências falhadas ( isto é, onde a pastilha de actina F é altamente variável, impedindo a análise entre concentrações). Finalmente, manter F-actina numa concentração fixa permite determinar se a ligação ao filamento de actina é cooperativa ( Figura 1C ). Ligação saturada Tal como em todas as experiências de ligação, é crítico que a ligação à F-actina esteja saturada e que a concentração de proteína mais platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sem um platô, não é possível calcular uma constante de equilíbrio de dissociação precisa. Assim,É importante planejar cuidadosamente a série de diluição a ser testada e sempre incluir concentrações mais altas de proteína ( ou seja, pelo menos 5- a 10 vezes maior do que o esperado K d ). Análise de ligação Para que as constantes de dissociação medidas sejam conclusivas, o ensaio deve ser realizado utilizando uma concentração de actina F que permita que a concentração dos locais de ligação na actina F para a proteína de interesse seja muito mais baixa do que a afinidade. Para verificar se este critério foi atingido, estimar a concentração de locais de ligação de B max . Por exemplo, se [F-actina] fosse 2 μM e Bmax = 0,5, então [locais de ligação] ≈ 1 μM. O Kd deve ser pelo menos 5- a 10 vezes maior do que [locais de ligação]. Se o Kd medido é da mesma ordem de grandeza que [locais de ligação], então é possível que a curva de ligação observada represente uma titulação de ligação de alta afinidade siEm vez de uma verdadeira isoterma de ligação. Se isto for observado, repetir o ensaio usando uma concentração de F-actina 10 vezes menor para medir uma afinidade precisa. Para interações de alta afinidade, a estabilização da faloidina (etapa 3.3) pode ser necessária para se obter uma concentração de F-actina suficientemente baixa para medir com precisão a afinidade. Finalmente, existem limitações fundamentais com o ensaio de co-sedimentação que os pesquisadores devem estar cientes de quando realizar e avaliar o ensaio. Mais importante ainda, o ensaio de co-sedimentação não produz uma verdadeira constante de equilíbrio. Os produtos de ligação ( isto é, proteína mais F-actina) são separados dos reagentes durante a centrifugação, após o que os produtos podem então dissociar-se para criar um novo equilíbrio. Como resultado, o ensaio de co-sedimentação pode calcular mal ou não detectar interacções de baixa afinidade. Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade baixa ( isto é, micromolar) para a actina F, um resultado negativo ( <eM&gt; isto é, nenhuma ligação detectável) no ensaio não significa necessariamente que uma proteína não se liga à F-actina. Como alternativa, os ensaios de ligação de filamento único com base em microscopia TIRF são mais sensíveis e mais precisos para determinar uma constante de dissociação (para revisões nesta técnica, ver referências 15 , 16 ). Apesar destas limitações, o ensaio de granulação está dentro dos meios da maioria dos investigadores e é uma ferramenta eficaz para determinar se uma proteína liga F-actina e para medir a afinidade da interacção.

A actina é uma proteína essencial do citoesqueleto que desempenha um papel crítico em múltiplos processos celulares, incluindo motilidade, contração, adesão e morfologia 1 . A actina existe em duas formas: actina globular monomérica (G-actina) e actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro das células, a organização da F-actina é controlada por uma grande coleção de proteínas que regulam a nucleação, crescimento, reticulação e desmontagem dos filamentos de actina 2 , 3 , 4 . No entanto, como múltiplas proteínas de ligação de actina funcionam em conjunto para regular a organização da rede de actina ainda não está bem esclarecida. A medição das interações proteína-proteína é uma abordagem importante para entender como as proteínas exercem seus efeitos sobre o comportamento celular ao nível bioquímico. Muitos ensaios diferentes podem ser utilizados para detectar interacções entre proteínas purificadas.Abordagens comuns para proteínas solúveis incluem pull-downs, polarização de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica e ressonância de plasmão de superfície. É importante notar que todos estes ensaios requerem que as proteínas sejam solúveis e são, portanto, difíceis de adaptar para utilização com uma proteína polimérica, filamentosa tal como F-actina. Aqui, descrevemos uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou granulação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio se liga F-actina e para medir a afinidade da interação. O ensaio de peletização de actina é uma técnica relativamente simples que não requer equipamento especializado, além de uma ultracentrífuga. Todos os reagentes podem ser feitos, assumindo conhecimentos de bioquímica básica, ou adquiridos. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, o ensaio pode ser utilizado para medir a afinidade aparente ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação) 5 . Além disso, uma vez estabelecida a afinidade, o ensaio de peletizaçãoÉ uma ferramenta útil para medir como alterações na proteína de interesse ( isto é , modificações pós-translacionais, mutações, ou ligação de ligando) afetam sua interação com F-actina 6 . A técnica tem limitações (ver a Discussão ) que o pesquisador deve estar ciente antes de tentar o ensaio.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga - 0,2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actina, músculo esquelético de coelho</td><td>Citoesqueleto</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(&beta;-éter aminoetílico)-N,N,N',N',N'-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Corante Azul R-250</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Coloração Azul Coloidal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

medir a ligação da proteína à actina f por co-sedimentação

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

A organização de actina filamentosa (F-actina) dentro das células é regulada por um grande número de proteínas de ligação à actina que controlam a nucleação, crescimento, reticulação e / ou desmontagem da actina. Este protocolo descreve uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou sedimentação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio liga F-actina e medir a afinidade da interação ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação). Nesta técnica, uma proteína de interesse é primeiro incubada com F-actina em solução. Em seguida, utiliza-se a centrifugação diferencial para sedimentar os filamentos de actina, e o material peletizado é analisado por SDS-PAGE. Se a proteína de interesse se liga à F-actina, co-sedimentará com os filamentos de actina. Os produtos da reacção de ligação ( isto é, F-actina e a proteína de interesse) podem ser quantificados para determinar a afinidade da interacção. O ensaio de peletização de actina é uma técnica simples para determinarSe uma proteína de interesse se liga a F-actina e para avaliar como as alterações a essa proteína, tais como a ligação do ligando, afectam a sua interacção com F-actina.

Examinámos a ligação do homodímero de αE-catenina à actina F no ensaio de co-sedimentação. Uma vez que experiências anteriores demonstraram que a afinidade do homodímero de αE-catenina para a actina F é de cerca de 1 μM e do B max próximo de 11 , realizámos o ensaio com uma concentração baixa de actina F (0,2 μM em vez de 2 μM; a discussão). Uma vez que 0,2 μM está abaixo da concentração crítica, a faloidina foi adicionada para estabilizar a F-actina polimerizada a partir da G-actina de músculo esquelético de coelho (passo 3.3). Incubaram-se concentrações crescentes de homodímero de cE-catenina (0,125-12,0 uM) na presença ou na ausência de actina F 0,2 uM. As amostras foram centrifugadas, e as pastilhas resultantes foram analisadas ( Figura 1A ). Conforme esperado, o homodímero de αE-catenina co-sedimentado com F-actina acima do fundo ( Figura 1A , compara as amostras de pastilhas de F-actina com o não-F-acAmostras de pellet de estanho). A BSA foi executada como um controlo negativo ( Figura 1B ). A proteína ligada foi quantificada e plotada sobre proteína livre para calcular a afinidade da interacção ( Figura 1C ). Os dados traçados correspondem melhor a uma equação de Hill. O Kd calculado foi 2,9 μM, o Bmax foi 0,2, eo coeficiente de Hill (h) foi 4,8. Assim, o homodímero de αE-catenina liga F-actina cooperativamente com uma baixa afinidade micromolar, consistente com o trabalho anterior (um Kd de 2,9 μM contra ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Ensaio de co-sedimentação de F-actina de alta velocidade. ( A ) Concentrações crescentes (0,125-12,0 μM) de homodímero de αE-catenina foram incubadas com (painéis esquerdos) ou sem (painéis direitos) F-actina 0,2 μM estabilizada com phalloidiN. Incubaram-se durante 30 min à RT e centrifugaram-se. O total (7,5% do material de partida) e o material peletizado (50% do material peletizado) foram separados por SDS-PAGE e corados com corante de Coomassie. ( B ) 4 μM BSA foi executado como um controlo negativo. As amostras totais e em pellets, com (+) ou sem (-) F-actina, foram separadas por SDS-PAGE e coradas com corante de Coomassie. ( C ) Ligou-se αE-catenina (μM / μM de actina) a partir de A contra cE-catenina livre (μM), e os dados encaixam-se numa equação de Hill (linha vermelha). Os coeficientes Kd, Bmax e Hill (h) estão listados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação de peletização de actina </sTrong&gt; - fluxograma. Este esquema descreve as etapas chave na seção 5, com exemplos de amostras de Total e Pellet ( A , CE ) e a curva padrão ( B ) usada para quantificação. 5.13 etapas: 1 ) Medir a quantidade de proteína de interesse nas amostras totais (A). 2 ) Gerar uma curva padrão, traçando a intensidade da banda versus a massa da proteína (B). 3 ) Meça a quantidade de proteína de interesse co-sedimentada com F-actina ( C ). 4 ) Meça a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina ( D ). 5 ) Subtrair D de C para determinar a quantidade de proteína ligada a F-actina. 6 ) Medir a quantidade de F-actina em cada pellet (E), calcular a quantidade média de F-actina por amostra e dividir cada amostra pela média (os números abaixo mostram a razão). 7 )Para cada amostra, divida-se a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5) pela razão de peletes de F-actina (calculada no passo 6) para ajustar as diferenças no grânulo. 8 ) Utilizar a curva padrão ( B ) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada em cada amostra (passo 7). 9 ) Determine a concentração de proteína livre e proteína ligada para criar uma curva de ligação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção.

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

O objetivo geral desta técnica é testar a capacidade de uma proteína de co-sedimentar com actina filamentosa e, caso seja observada ligação, medir a afinidade da interação. Este método é uma técnica direta para determinar se uma proteína se liga à F-actina. As vantagens desta técnica são que ela não requer equipamentos especializados além de uma ultracentrífuga, e todos os reagentes podem ser preparados ou adquiridos comercialmente.Para começar, prepare a proteína de alta pureza conforme descrito no protocolo textual. Determine a concentração da proteína medindo a absorbância a 280 nanômetros. Imediatamente antes do uso, realize uma centrifugação de alta velocidade da proteína para remover agregados de proteína insolúvel.Se a solubilidade for uma preocupação, remova a concentração da proteína após a centrifugação. Em seguida, retire uma alíquota de actina globular ou g-actina do congelador a menos 80 graus Celsius e descongele rapidamente. Adicione o tampão de polimerização 10X à G-actina e dilua até uma concentração final de 1X com água.Incube a mistura por uma hora à temperatura ambiente para permitir a polimerização da actina. Após a polimerização, armazene o filamento de actina polimerizada, ou F-actina, em solução a quatro graus Celsius, onde permanecerá estável por algumas semanas. Antes de usar a F-actina após o armazenamento, inverta suavemente o tubo ou toque-o várias vezes para garantir que toda a actina esteja dissolvida e uniformemente distribuída na solução.Estabeleça a ligação da proteína de interesse à F-actina conforme descrito no protocolo textual. Uma vez confirmada a ligação à F-actina, dilua a proteína em série para preparar uma série de concentrações contendo de sete a oito amostras na concentração final duas vezes maior do que a a ser testada. Por exemplo, se a faixa a ser testada for de 0,1 a oito micromolar, prepare diluições de 16, oito, quatro, dois, um, 0,5 e 0,2 micromolar de proteína em tampão de reação 1X em tubos de microcentrífuga.Dilua a proteína de interesse até a concentração final em tampão de reação 1X em tubos para ultracentrífuga. Adicione F-actina às amostras apropriadas. Em seguida, incube todas as amostras por 30 minutos à temperatura ambiente.Após 30 minutos, retire um quinto de cada amostra e misture com o tampão de amostra. Essas são as amostras totais. Carregue os tubos de amostra da ultracentrífuga no rotor e centrifugue por 20 minutos a 100.000 × g e 4 °C.Após a centrifugação, remova três quartos do sobrenatante de cada tubo e misture com tampão amostral 4X em um tubo microfuga separado. Essas são as amostras de sobrenatante. Remova o sobrenatante restante com uma ponteira para carregamento em gel, tomando cuidado para não perturbar o pellet.Em seguida, adicione tampão amostra 1X a todos os tubos e incube por pelo menos cinco minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, triture a amostra de oito a dez vezes com uma ponteira de pipeta p200, lavando continuamente a região do pellet no tubo. Arraste suavemente a ponteira da pipeta sobre o pellet durante a trituração para auxiliar na re-suspensão.Transfira a proteína re-suspensa para um tubo de microcentrífuga. Estas são as amostras de pellet. Por fim, analise as amostras totais e de pellet por eletroforese em gel de SDS-PAGE.Imagem os géis corados com comassie utilizando um sistema de imagem que mede as intensidades das bandas proteicas em uma faixa ampla e linear. Concentrações crescentes de homodímero de alfa e catenina foram incubadas na presença ou ausência de 0,2 micromolar de F-actina. As amostras foram centrifugadas e os pellets resultantes foram analisados.Conforme esperado, o homodímero de alfa e catenina co-sedimentou com F-actina acima do fundo. A BSA foi utilizada como controle negativo. A proteína ligada foi quantificada e representada graficamente em relação à proteína livre para calcular a afinidade da interação.Essa técnica pode ser realizada em quatro horas ou menos, caso a F-actina já esteja polimerizada. Ao realizar este procedimento, é fundamental remover rapidamente o sobrenadante após a centrifugação e ressuspender completamente o pellet. Como em todos os experimentos de ligação, é essencial que a ligação à F-actina esteja saturada e que a pureza e a quantidade de F-actina atinjam um platô, pois, na ausência de um platô, não é possível calcular uma constante de equilíbrio de associação precisa.Existem limitações fundamentais no ensaio de co-sedimentação das quais os pesquisadores devem estar cientes, principalmente o fato de que ele não produz uma constante de equilíbrio verdadeira e, como resultado, pode calcular incorretamente ou deixar de detectar interações de baixa afinidade. Apesar dessas limitações, o ensaio de co-sedimentação é uma ferramenta acessível e eficaz para determinar se uma proteína se liga à F-actina e para medir a afinidade da interação.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Proteínas se ligam à actina filamentosa (F-actina) através de módulos de actina de ligação distinto. Neste vídeo podemos demonstrar o procedimento de actina co-sedimentação, que é um ensaio in vitro rotineiramente usado para analisar proteínas ou domínios específicos que se ligam F-actina.

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Nós aplicamos rótulo sem análise da interação da proteína usando X100 Biacore para estrutura-função de análise da ligação de mutantes B várias cistatina à papaína através da caracterização cinética. Calibração livre de análise de concentração (ACCP) mede a concentração de proteína com actividade de ligação retida sem a necessidade de uma curva padrão. Nós mostramos que a confirmação de concentrações usando ACCP aumenta a confiabilidade da análise cinética e que constantes cinéticas pode ser...

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

Neste vídeo, descrevemos a técnica de anisotropia de fluorescência para estudar as interações entre a proteína da síndrome de Shwachman-diamante marcada com fluoróforo (SBDS) e a 1 GTPase semelhante ao fator de alongamento (EFL1). Na incubação de proteínas SBDS com concentrações gradualmente crescentes de EFL1, observa-se um aumento constante na anisotropia, indicando uma interação bem-sucedida entre as duas proteínas.

Detecção baseada em anisotropia de fluorescência de interações proteína-proteína

A polimerização de FtsZ é essencial para a divisão celular bacteriana. Neste relatório, detalhamos protocolos simples para monitorar a atividade de polimerização de FtsZ e discutimos a influência da composição do tampão. Os protocolos podem ser usados para estudar a interação de FtsZ com proteínas reguladoras ou drogas antibacterianas que afetam a polimerização de FtsZ.

FtsZ Polimerização Ensaios: protocolos simples e Considerações

Este protocolo compara as afinidades relativas dos parceiros de ligação para GTPases da família Rho, incluindo Rac1. In vivo, as proteínas de ligação a Rac1 competem por uma única interface de ligação, cuja conformação é ditada por um nucleotídeo ligado. O nucleotídeo é importante e difícil de controlar experimentalmente, devido à alta taxa de hidrólise.

Comparando-se a afinidade de proteínas de ligação utilizando ensaios de competição de GTPase

interações proteína estão no cerne da função de uma célula. calorimétrica técnicas espectroscópicas e são vulgarmente utilizados para os caracterizar. Aqui, descrevemos a anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar a interacção entre a proteína mutada na Síndrome Shwachman- diamante (SBDS) e o factor de alongamento como uma GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Apresentamos um método que combina purificação de proteína de membrana e reconstituição em peptidiscs em um único passo cromatográfico. Andaimes biotinylados são usados para fixação direta da superfície e medição de interações proteína-ligand através da interferometria da biocamada.

PeptiQuick, uma incorporação de um passo de proteínas da membrana em Peptidiscs biotinylated para ensaios obrigatórios de proteína aerodinâmica

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

Este protocolo descreve como produzir cometas de actina nas superfícies de contas usando ingredientes proteicos comercialmente disponíveis. Tais sistemas imitam as estruturas protuberantes encontradas nas células e podem ser usados para examinar mecanismos fisiológicos de produção de força de forma simplificada.

Reconstituição da Motilidade à Base de Actina com Proteínas Comercialmente Disponíveis

Este método descreve um ensaio de sedimentação in vitro baseado em lectina para quantificar a afinidade de ligação da fosfatase glucana e amilopectina. Este ensaio de co-sedimentação é confiável para medir a ligação do substrato glucana fosfatase e pode ser aplicado a vários substratos glucanos solubilizados.

Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Aprenda a medir a ligação de proteínas à actina F por co-sedimentação. Este método acessível utiliza ultracentrifugação e SDS-PAGE para quantificar a afinidade da interação proteína-actina em estudos de biologia celular.

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

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