Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

O objetivo geral desta técnica é testar a capacidade de uma proteína de co-sedimentar com actina filamentosa e, se a ligação for observada, medir a afinidade da interação. Este método é uma técnica simples para determinar se uma proteína se liga à F-actina. As vantagens dessa técnica são que ela não requer equipamentos especializados além de uma ultracentrífuga, e todos os reagentes podem ser feitos ou adquiridos.

Para começar, prepare proteínas de alta pureza conforme descrito no protocolo de texto. Determinar a concentração de proteínas medindo os absorventes a 280 nanômetros. Pouco antes de usar, gire a proteína com força para remover agregados de proteína insolúvel.

Se a solubilidade for uma preocupação, meça novamente a concentração de proteína após a centrifugação. Em seguida, remova uma alíquota de actina globular ou g-actina do freezer de 80 graus Celsius negativos e descongele-a rapidamente. Adicione tampão de polimerização 10X à G-actina e dilua até uma concentração final de 1X com água.

Incube a mistura por uma hora em temperatura ambiente para permitir que a actina polimerize. Após a polimerização, armazene a actina filamentosa polimerizada, ou F-actina, em solução a quatro graus Celsius, onde ficará estável por algumas semanas. Antes de usar a F-actina após o armazenamento, inverta suavemente ou sacuda o tubo várias vezes para garantir que toda a actina seja dissolvida e distribuída uniformemente na solução.

Estabelecer a ligação da proteína de interesse à F-actina, conforme descrito no protocolo de texto. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, diluir a proteína em série para fazer uma série de concentrações contendo sete a oito amostras duas vezes a concentração final a ser testada. Por exemplo, se o intervalo a ser testado for de 0,1 a oito micromolares, prepare diluições de 16, oito, quatro, dois, um, 0,5 e 0,2 micromolares de proteína em tampão de reação 1X em tubos de microcentrífugas.

Diluir a proteína de interesse até a concentração final em tampão de reação 1X em tubos de ultracentrífuga. Adicionar F-actina às amostras apropriadas. Em seguida, incube todas as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após 30 minutos, remova um quinto de cada amostra e misture com o tampão de amostra. Estas são as amostras totais. Carregue os tubos de amostra da ultracentrífuga no rotor e centrifugue por 20 minutos a 100.000 vezes G e quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova três quartos do sobrenadante de cada tubo e misture com tampão de amostra 4X em um tubo de microcentrífuga separado. Estas são as amostras sobrenadantes. Remova o sobrenadante restante com uma ponta de carregamento de gel, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Em seguida, adicione 1X tampão de amostra a todos os tubos e incube por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, triturar a amostra oito a dez vezes com uma ponta de pipeta p200, lavando continuamente a área do pellet do tubo. Raspe suavemente a ponta da pipeta sobre o pellet durante a trituração para ajudar na ressuspensão.

Transfira a proteína ressuspensa para um tubo de microcentrífuga. Estas são as amostras de pellets. Por fim, analise as amostras totais e de pellets por página SDS.

Imagem dos géis corados de Coomassie usando um sistema de imagem que mede as intensidades das bandas de proteínas em uma faixa ampla e linear. Concentrações crescentes de homodímero alfa e catenina foram incubadas na presença ou ausência de F-actina 0,2 micromolar. As amostras foram centrifugadas e os pellets resultantes foram analisados.

Como esperado, o homodímero alfa e catenina co-sedimentou com F-actina acima do fundo. A BSA foi executada como um controle negativo. A proteína ligada foi quantificada e plotada sobre a proteína livre para calcular a afinidade da interação.

Esta técnica pode ser feita em quatro horas ou menos se a F-actina já estiver polimerizada. Ao tentar este procedimento, é fundamental que o sobrenadante seja removido rapidamente após a centrifugação e o pellet seja ressuspenso completamente. Como em todos os experimentos de ligação, é fundamental que a ligação à F-actina esteja saturada e que a pureza mais F-actina se estabilize, sem um platô não é possível calcular uma constante de equilíbrio de associação precisa.

Existem limitações fundamentais para o ensaio de co-sedimentação das quais os pesquisadores devem estar cientes, o mais importante, ele não produz uma constante de equilíbrio verdadeira e, como resultado, pode calcular mal ou não detectar interações de baixa afinidade. Apesar dessas limitações, o ensaio de co-sedimentação é uma ferramenta acessível e eficaz para determinar se uma proteína se liga à F-actina e medir a afinidade da interação.