Name: Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos de sangue total e realizar ensaios de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico. Este método rápido de 25 minutos facilita pesquisas sobre migração de células imunes.

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Este trabalho é parcialmente apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (CRSNG) e os Institutos de Pesquisa em Saúde do Canadá (IRSC). Agradecemos ao Instituto Clínico de Pesquisa Aplicada e Educação no Hospital Geral de Victoria em Winnipeg e ao Hospital Geral Seven Oaks em Winnipeg para o gerenciamento de amostras clínicas de indivíduos humanos. Agradecemos ao Dr. Hagit Peretz-Soroka por uma discussão útil sobre as estratégias de operação do ensaio. <style type="text/css">
</style> Agradecemos a professora Carolyn Ren e Dr. Xiaoming (Cody) Chen da Universidade de Waterloo por seu generoso apoio no processo de filmagem.

Todos os protocolos de recolha de amostras humanas foram aprovados pelo Joint-Faculty Research Ethics Board, na Universidade de Manitoba, em Winnipeg. 1. Fabricação de dispositivos microfluídicos ( Figura 1A ) <ol><li> Desenhar e imprimir máscara de transparência. <ol><li> Designe o dispositivo conforme detalhado anteriormente 25 . Veja a Figura 1A . NOTA: O dispositivo inclui duas camadas. A primeira camada (4 μm de altura) define o canal de barreira de encaixe de célula para capturar as células ao lado do canal de gradiente. A segunda camada (60 um de altura) define o canal gerador de gradiente, a porta e o canal para carga celular, os reservatórios de entrada química e a saída de resíduos. As marcas de alinhamento são projetadas para as duas camadas. Para a segunda camada, o comprimento e a largura do canal de entrada em serpentina a montante são de 60 mm e 200 μm, respectivamente; O comprimento e a largura do rio a jusanteO canal de entrada em serpentina é de 6 mm e 280 μm, respectivamente. </li><li> Imprima os recursos de primeira e segunda camada em uma máscara de transparência usando uma impressora de alta resolução. NOTA: A resolução de impressão depende dos recursos mínimos no projeto. No projeto atual, foram escolhidos 32.000 dpi para características mínimas de 10 μm. </li></ol></li><li> Limpe a bolacha de silício. <ol><li> Coloque uma bolacha de 3 em silício no limpador de plasma. Aplique o vácuo durante 3 min. </li><li> Ative a energia do plasma e defina o nível como ALTO. Use o plasma de oxigênio para tratar a bolacha de silício durante 30 min. </li><li> Desligue o limpador de plasma e tire a bolacha de silício; A bolacha de silício está pronta para fabricar o molde do dispositivo. </li></ol></li><li> Fabrique a primeira camada por fotolitografia em uma instalação de sala limpa. NOTA: Os parâmetros de fabricação exatos podem variar de acordo com a facilidade de fabricação. <ol><li> Diluir 10 mL de SU-8 2025 com 10 mL de SU-8 2000 em um disjuntor de vidro para preparar o fotorresist projetado. Deixe a mistura na exaustor durante 10 minutos até as bolhas desaparecerem. </li><li> Coloque cuidadosamente a bolacha de silício limpa no girador com o suporte apropriado e aplique o vácuo para imobilizar a bolacha de silício. </li><li> Coloque cuidadosamente 3 mL da mistura de fotoresist no centro da bolacha de silício. Girar a 500 rpm por 5 s. Em seguida, gire a 3.000 rpm por 30 s para obter um revestimento de fotossensibilidade final de 4 μm de espessura na bolacha de silício. </li><li> Retire cuidadosamente a bolacha de silício da máquina giratória e assegure a bolacha de silício em uma placa quente durante 4 minutos a 95 ° C. </li><li> Coloque cuidadosamente a bolacha de silício em um alinhador de máscara e ajuste o tempo de exposição UV para 6 s. Anexe cuidadosamente a máscara de transparência da primeira camada em uma placa de vidro transparente usando fita adesiva. </li><li> Coloque suavemente a placa de vidro transparente com a máscara anexada ao alinhador e alinhe a máscara com a bolacha de silício. Exponha o siWafer de licão para UV para padronizar a estrutura de encaixe da célula. </li><li> Retire cuidadosamente a placa de vidro e retire a bolacha de silício exposta. Asse a bolacha de silício numa placa quente durante 4 min a 95 ° C. </li><li> Transfira a bolacha de silício para uma aspiradora e coloque-a em uma panela de vidro contendo o desenvolvedor SU-8. Agite suavemente isso por 30 s. </li><li> Limpe a bolacha de silício usando um desenvolvedor SU-8 fresco seguido de álcool isopropílico (IPA) dentro da exaustão. Secar a bolacha de silício por gás nitrogênio dentro da exaustão; A primeira camada está pronta. </li></ol></li><li> Fabrique a segunda camada na primeira camada. <ol><li> Use uma fita adesiva para cobrir as marcas de alinhamento na primeira camada. Coloque cuidadosamente a bolacha de silício com a primeira camada no empuxo de vácuo da máquina giratória e aplique vácuo para imobilizar a bolacha de silício. </li><li> Despeje 3 mL de fotoresist SU-8 2025 na bolacha de silício. Gire a bolacha de silício a 500 rpm por 5 s. Em seguida, gire a 2000 rpm por 30S para obter um revestimento final de fotoresist de 60 μm de espessura na bolacha de silício. </li><li> Retire cuidadosamente a bolacha de silício da máquina giratória e transfira-a para uma placa de aquecimento; Assar a 65 ° C durante 2 min. </li><li> Remova cuidadosamente a fita adesiva para expor as marcas de alinhamento na primeira camada. Coloque a bolacha de silício em uma placa quente e asse em 95 ° C durante 6 min. </li><li> Coloque cuidadosamente a bolacha de silício em um alinhador de máscara e defina o tempo de exposição UV para 18 s. </li><li> Anexe cuidadosamente a máscara de transparência da segunda camada em uma placa de vidro transparente usando fita adesiva. </li><li> Coloque cuidadosamente a placa de vidro com a máscara anexada ao alinhador e alinhe a máscara e a primeira camada na bolacha de silício pelas marcas de alinhamento de cruzamento usando o microscópio de inspeção do alinhador. </li><li> Exponha a bolacha de silício revestida com fotorresist para UV para padronizar os canais de carga celular e gradiente. </li><li> Remova cuidadosamente a placa de vidro e retire o silício wAfer. Asse a bolacha de silício em uma placa quente a 65 ° C durante 2 min e depois transfira a bolacha de silício para outra placa quente a 95 ° C e asse por 6 minutos. </li><li> Transfira a bolacha de silício para o aspirador e coloque-a em uma panela de vidro contendo o desenvolvedor SU-8. Agite suavemente isso por 6 min. </li><li> Limpe a bolacha de silício usando o desenvolvedor fresco SU-8 seguido de IPA dentro da exaustão. </li><li> Secar a bolacha de silício usando gás nitrogênio dentro da exaustão. Coloque a bolacha de silício em uma placa de cozedura e dure o forno a 150 ° C durante 30 min; A segunda camada está pronta. </li></ol></li><li> Modificação de superfície do molde principal. NOTA: Um passo de modificação de superfície de silanização é aplicado ao molde SU-8 para facilitar a liberação de polidimetilsiloxano (PDMS) a partir do molde em litografia suave. <ol><li> Pegue 10 μL de solução tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil (triclorosilano) em uma ponta de micropipeta. Coloque a ponta da micropipleta em um tubo de plástico de 15 mL aE afrouxe a tampa do tubo. </li><li> Coloque o tubo e a bolacha de silício padrão SU-8 dentro de um dessecador e aplique o vácuo por 1 h; O molde de máscara está pronto para fabricar o dispositivo PDMS. </li></ol></li><li> Fabricação do dispositivo PDMS. <ol><li> Prepare a solução PDMS misturando 40 g de base de PDMS e 4 g de agente de cura em um copo de plástico. Coloque o molde principal SU-8 preparado em uma placa de Petri e derrame com cuidado 44 g de solução PDMS no molde. </li><li> Coloque a placa de Petri em um dessecador e aplique vácuo para desgasear a solução PDMS por 20 min. Em seguida, coloque a placa de Petri em um forno e cure o PDMS a 80 ° C por 2 h. </li><li> Depois de assar, retire a placa de Petri e coloque-a em um banco limpo. Corte com cuidado e remova a placa PDMS do molde SU-8. </li><li> Perfure a porta de carregamento da célula usando um perfurador de 3 mm de diâmetro. Retire os reservatórios de entrada química e a saída de resíduos usando um perfurador de 6 mm de diâmetro. </li><li> Remova a poeira noSuperfície da placa PDMS usando fita adesiva. Coloque a laje PDMS e uma corrediça de vidro limpa na máquina de plasma. Aplique o vácuo durante 3 min. </li><li> Ative a energia do plasma e defina o nível como ALTO. Ajuste suavemente a válvula de ar e aplique a placa de PDMS e o vidro deslize durante 3 min. </li><li> Desligue a energia do plasma e solte o vácuo. Retire cuidadosamente a laje do PDMS e o slide de vidro usando uma pinça. </li><li> Coloque imediatamente a laje PDMS (com estruturas de canais viradas para baixo) no topo do slide de vidro; Pressione suavemente a placa PDMS para encaixá-la no vidro. Encha o canal microfluídico com água desionizada imediatamente; A fabricação e montagem de dispositivos microfluídicos estão completos. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do ensaio de migração de células microfluídicas <ol><li> Preparação do dispositivo microfluídico. <ol><li> Prepare uma solução de fibronectina de 50 μg / mL diluindo 50 μL de solução de fibronectina em estoque (1 mg / mL) para 95081; solução salina tamponada com fosfato de L Dulbecco (DPBS) dentro de um gabinete de biossegurança. </li><li> Prepare o meio de migração misturando 9 mL de meio de Instituto Roswell Park Memorial (RPMI-1640) e 1 mL de RPMI-1640 com 4% de albumina de soro bovino (BSA). </li><li> Remova a água desionizada do dispositivo. </li><li> Adicione 100 μL de solução de fibronectina ao dispositivo da tomada. Aguarde 3 min para garantir que todos os canais sejam preenchidos com solução de fibronectina. Coloque o dispositivo microfluídico em uma placa de Petri coberta durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Remova a solução de fibronectina do dispositivo. Adicione o meio de migração de 100 μL da saída. Aguarde 3 min para garantir que todos os canais estejam preenchidos com o meio de migração. </li><li> Incubar o dispositivo por mais 1 h à temperatura ambiente; O dispositivo está pronto para a experiência de quimiotaxia. </li></ol></li><li> Preparação da solução quimiotratante para o experimento de quimiotaxia. <ol><li> Prepare a solução de fMLP 100 nM em t1 mL de meio de migração. Misture 5 μL de FITC-Dextran em estoque (10 kDa, 1 mM) com a solução fMLP em um tubo de 1,5 mL. NOTA: FITC-Dextran é usado para medição de gradiente. Alternativamente, use Rhodamine como indicador de gradiente. A solução de quimiotratante fMLP está pronta para a experiência de quimiotaxia. </li></ol></li><li> Preparação da amostra de escarro. NOTA: A quimiotaxia de neutrófilos induzida por um gradiente de amostra de escarro de pacientes com DPOC foi testada como uma aplicação de diagnóstico clínico deste método todo-em-chip. <ol><li> Obtenha um protocolo de ética humana para coletar amostras de escarro de pacientes com DPOC. NOTA: Obtivemos aprovações para coletar amostras no Hospital Geral Seven Oaks em Winnipeg (aprovado pela Universidade de Manitoba). </li><li> Obtenha os formulários de consentimento por escrito informado de todas as matérias. </li><li> Recolher amostras espontâneas de escarro dos pacientes com DPOC. Coloque 500 μL de amostra de escarro em um tubo de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 500 μL 0,1% diTioreitol no tubo de 1,5 mL e misture suavemente. Coloque o tubo em banho-maria a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar a amostra a 753 xg durante 10 min e depois recolher o sobrenadante. Centrifugar o sobrenadante a 865 xg durante 5 min e depois recolher o sobrenadante final. Armazene o sobrenadante coletado dentro de um congelador de -80 ° C antes de usar. </li><li> Quando estiver pronto para experimentar a quimiotaxia, descongelar a solução de escarro; Transfira 900 μL de meio de migração para um tubo de 1,5 mL e misture com 100 μL de solução de escarro dentro de um gabinete de biossegurança; A solução de escarro está pronta para a experiência de quimiotaxia. </li></ol></li><li> Coleta de amostras de sangue. <ol><li> Obtenha um protocolo de ética humana para coletar amostras de sangue de doadores saudáveis. Obtenha os formulários de consentimento por escrito informados de todos os doadores de sangue. NOTA: Aqui amostras foram obtidas no Hospital Geral de Victoria em Winnipeg (aprovado pelo Joint-Faculty Research Ethics Board da Universidade de ManitOba). </li><li> Recolher a amostra de sangue por punção venosa e colocar a amostra em um tubo revestido com EDTA. Mantenha o tubo em um gabinete de biossegurança antes da experiência. </li></ol></li></ol> 3. Operação de ensaio de quimiotaxis All-on-chip <ol><li> Isolamento de célula em chip ( Figura 1B ). <ol><li> Coloque 10 μL de sangue total em um tubo de 1,5 mL dentro de um gabinete de biossegurança. NOTA: Os detalhes da coleta de amostras de sangue estão na seção 2.4. </li><li> Adicione 2 μL de coquetel de anticorpos (Ab) e 2 μL de partículas magnéticas (MP) do kit de isolamento de neutrófilos (veja a tabela de materiais) no tubo de 1,5 mL e misture suavemente; Isso rotará as células no sangue, exceto os neutrófilos. </li><li> Incubar a mistura sanguínea-Ab-MP durante 5 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Isto irá marcar magneticamente as células marcadas com anticorpos no sangue. </li><li> Anexe dois discos magnéticos pequenos aos dois lados do carregamento celularOu do dispositivo. Aspira o meio de todas as portas do dispositivo. </li><li> Pentee lentamente 2 μL de mistura sanguínea-Ab-MP no dispositivo microfluídico da porta de carga celular. NOTA: As células marcadas magnéticamente são presas nas paredes laterais da porta de carga da célula enquanto os neutrófilos fluem para o dispositivo e ficam presos na estrutura de encaixe da célula. </li><li> Aguarde alguns minutos até que os neutrófilos suficientes estejam presos na área de encaixe da célula. </li></ol></li><li> Ensaio de quimiotaxis ( Figura 1C ). <ol><li> Coloque o dispositivo microfluídico no palco do microscópio controlado por temperatura a 37 ° C. </li><li> Adicione 100 μL de solução chemoattractant (solução de fMLP ou escarro) e 100 μL de meio de migração para os reservatórios de entrada designados usando dois pipetadores; Isto irá gerar um gradiente chemoattractant no canal de gradiente por meio de uma mistura química contínua baseada em fluxo laminar assistida por um pressurE estrutura de equilíbrio. NOTA: Os detalhes da coleta de escarro de pacientes com DPOC estão na seção 2.3. <ol><li> Para o experimento de controle médio, adicione apenas meio de migração para ambos os reservatórios de entrada. </li></ol></li><li> Adquira a imagem de fluorescência de FITC-Dextran no canal de gradiente. </li><li> Importe a imagem para o software ImageJ usando o comando &quot;Arquivo | Abrir&quot;. </li><li> Meça o perfil de intensidade de fluorescência no canal de gradiente usando o comando &quot;Analisar | Perfil de plotagem&quot;. </li><li> Exporte os dados de medição para uma planilha para planejamento adicional. </li><li> Incube o dispositivo no estágio do microscópio controlado por temperatura ou em uma incubadora de cultura de células convencional durante 15 min. </li><li> Imagem do canal gradiente usando um objetivo 10X para registrar as posições finais das células para a análise de dados. </li><li> Se necessário, grave a migração celular no dispositivo por microscopia por lapso de tempo. </li></ol></li></ol> 4. Migração celular DAta análise ( Figura 1C ) <ol><li> Analise o ensaio de quimiotaxia calculando a distância de migração celular da estrutura de ancoragem conforme descrito abaixo. Veja a Figura 1C . </li><li> Importe a imagem para o software NIH ImageJ (ver 1.45). </li><li> Selecione o centro de cada célula que se deslocou para o canal de gradiente. </li><li> Meça as coordenadas das células selecionadas para suas posições finais. Meça a coordenada de um ponto na borda da estrutura de encaixe como posição de referência inicial. </li><li> Exporte os dados de coordenadas medidas para um software de planilha eletrônica ( por exemplo, Excel). Calcule a distância de migração das células como a diferença entre a posição final de uma célula e a posição de referência inicial ao longo da direção do gradiente. </li><li> Calibre a distância até um micrômetro. Calcule a média e desvio da distância de migração de todas as células como medida de quimiotaxia. </li><li> Compare o migDistância da ração na presença de um gradiente chemoatrayante para o experimento de controle médio usando o teste t de Student. </li><li> Se as imagens de lapso de tempo da migração celular forem registradas, a migração celular e a quimiotaxia podem ser analisadas adicionalmente por análise de rastreamento celular 15 . NOTA: Os materiais necessários para a construção e realização do ensaio de quimiotaxia todo-em-chip são detalhados na tabela de materiais. </li></ol>

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Neste trabalho, foi descrito um protocolo detalhado para isolar diretamente os neutrófilos do sangue total seguido do teste de quimiotaxia, tudo em um único microfluídico. Este método oferece recursos úteis em sua operação fácil, seleção negativa de neutrófilos de alta pureza, teste de quimiotaxia rápido de amostra a resultado, reagentes reduzidos e consumo de amostras e análise precisa de dados de migração celular. Como uma estimativa aproximada, pelo menos 25% dos neutrófilos da amostra de sangue total de entrada entr...

A quimiotaxia, um processo de migração de células direcionadas para gradiente de concentração química solúvel, é criticamente envolvida em muitos processos biológicos, incluindo resposta imune 1 , 2 , 3 , desenvolvimento de tecido 4 e metástase de câncer 5 . Os neutrófilos são o subconjunto mais abundante de glóbulos brancos e desempenham papéis cruciais na habilitação das funções de defesa do hospedeiro inatas do corpo, bem como na mediação das respostas imunes adaptativas 6 , 7 . Os neutrófilos estão equipados com maquinaria quimiotáctica altamente regulada, permitindo que essas células imunes móveis respondam tanto a quimiotratantes derivados de patógenos ( por exemplo, fMLP) como a quimiotractivos derivados do hospedeiro ( por exemplo, interleucina-8) através de quimioestamento 8 . A migração de neutrófilos e a quimiotaxia medem vários problemas fisiológicosE doenças como inflamação e câncer 1 , 9 . Assim, a avaliação precisa da quimiotaxia dos neutrófilos fornece uma leitura funcional importante para estudar a biologia dos neutrófilos e as doenças associadas. Em comparação com os ensaios de quimiotexia convencional amplamente utilizados ( por exemplo, o ensaio Transwell 10 ), os dispositivos microfluídicos são de grande promessa para a avaliação quantitativa da migração celular e da quimiotaxia devido à geração de gradiente químico e miniaturização com precisão 11 , 12 , 13 . Nas últimas duas décadas, vários dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para estudar a quimiotaxia de diferentes tipos de células biológicas, especialmente neutrófilos 11 . Um esforço significativo foi dedicado a caracterizar a migração de neutrófilos no complexo spatiotemporalmente complexo.<html> Gradientes micos que foram configurados nos dispositivos microfluidicos 14 , 15 . Estratégias interessantes também foram desenvolvidas para estudar a tomada de decisão direcional por neutrófilos usando os dispositivos microfluídicos 16. A partir de pesquisas orientadas biologicamente, as aplicações de dispositivos microfluídicos foram estendidas para testar amostras clínicas para avaliação de doenças 17 , 18 , 19 . No entanto, o uso de muitos dispositivos microfluídicos é limitado a laboratórios especializados de pesquisa e exige um isolamento prolongado de neutrófilos a partir de grandes quantidades de amostras de sangue. Portanto, tem havido uma tendência crescente de desenvolvimento de dispositivos microfluídicos integrados para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue total 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . Em direção a esta direção, desenvolveu-se um método todo-on-chip que integra a purificação de neutrófilos negativos magnéticos eo subsequente teste de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico 25 . Este método tudo-em-chip tem os seguintes recursos inovadores: 1) em contraste com as estratégias anteriores sobre o chip que isolam os neutrófilos do sangue por captura de células à base de adesão ou filtragem baseada em tamanho celular 20 , 22 , este novo método permite alta Pureza, separação magnética no chip dos neutrófilos de pequenos volumes de sangue total, bem como medição de quimiotaxia na estimulação quimiotratante; 2) a estrutura de encaixe da célula ajuda a alinhar as posições iniciais dos neutrófilos perto do canal de gradiente químico e permite análise de quimiotexia simples sem rastreamento celular único; 3) a integração do isolamento de neutrófilos e quimioterapiaO ensaio de eixo em um único dispositivo microfluídico permite uma rápida análise de quimiotaxia de amostra a resultado em 25 min quando não há interrupção entre etapas experimentais. Este artigo fornece um protocolo detalhado para o método de construção, operação e análise de dados deste ensaio de quimiotaxia todo-em-chip. O documento demonstra o uso efetivo do método desenvolvido para realizar a quimiotaxia de neutrófilos, testando amostras chemoatractantes recombinantes recombinantes conhecidas e amostras chemotacticas complexas de pacientes, seguidas de uma discussão sobre estratégias de solução de problemas, limitações e direções futuras.

<table><tbody><tr><td><forte>Fabricação de dispositivos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Máscara alinhador</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Balança digital</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 mais fino</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>fotorresistente Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 desenvolvedor</td><td>Microchem</td><td>SU-8 desenvolvedor</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil) triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Adesivos Ellsworth</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de corte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sob medida</td></tr><tr><td>Perfuradores</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Feito sob medida</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Fonte</td><td>Número de catálogo</td> <td> Comentários</td></tr> <tr><td> Isolamento celular no chip e ensaio de quimiotaxia</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Discos magnéticos</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm de diâmetro, 1 mm de espessura</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina</td><td> Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração Giemsa</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Kit de Isolamento de Neutrófilos </td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U microscópio fluorescente invertido Nikon Ti-U</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>câmara ambiental do microscópio</td>.Câmera CCD <td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

um método all-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

A migração de neutrófilos e a quimiotaxia são críticas para o sistema imunológico do nosso corpo. Os dispositivos microfluídicos são cada vez mais utilizados para investigar a migração de neutrófilos e a quimiotaxia devido às suas vantagens na visualização em tempo real, controle preciso da geração de gradiente de concentração química e menor consumo de reagentes e amostras. Recentemente, um esforço crescente foi feito pelos pesquisadores microfluídicos para o desenvolvimento de sistemas de análise de quimiotaxia microfluídica integrada e de fácil operação, diretamente do sangue total. Nessa direção, o primeiro método all-on-chip foi desenvolvido para integrar a purificação magnética negativa de neutrófilos e o teste de quimiotaxia a partir de pequenas amostras de volume sanguíneo. Este novo método permite um rápido teste de quimiotaxia de neutrófilos de amostra a resultado em 25 min. Neste artigo, fornecemos métodos detalhados de construção, operação e análise de dados para este ensaio de quimiotaxia com todas as discussões sobre estratégias de solução de problemas, limiTations e direções futuras. Os resultados representativos do ensaio de quimiotaxia de neutrófilos com teste de um quimioatractante definido, N -Formulídeo-Met-Leu-Phe (fMLP) e escarro de um paciente com doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), usando este método de todo o chip. Este método é aplicável a muitas investigações relacionadas com migração celular e aplicações clínicas.

Os neutrófilos são negativamente selecionados a partir de uma gota de sangue total diretamente no dispositivo microfluídico. A pureza dos neutrófilos isolados foi verificada pela coloração com Giemsa no chip e os resultados mostraram os núcleos típicos em forma de anel e lobo de neutrófilos ( Figura 2A ) 25 . Isto indica um isolamento efetivo de neutrófilos no chip com alta pureza a partir de um pequeno volume de sangue total. Além di...

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método para separar neutrófilos de uma gota de sangue total e, em seguida, realizar um ensaio de quimiotaxia subsequente usando um único dispositivo microfluídico. Este método fornece nosso código para realizar um ensaio de quimiotaxia de neutrófilos usando um pequeno volume de sangue total. E pode ser facilmente aplicado por pesquisadores para responder a questões biológicas relacionadas à migração de células imunológicas.A principal vantagem desta técnica é a integração e nosso ensaio de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico. Isso permite montagem e análise em 25 minutos. Para começar, prepare o maldus mestre descrito no protocolo de texto que acompanha.Em seguida, silanize a superfície do molde SU8 para facilitar a liberação do PDMS do molde. Em seguida, misture 40 gramas de base PDMS e quatro gramas do agente transportador em um copo de plástico. Coloque o molde mestre SU8 preparado em uma placa de Petri e despeje cuidadosamente a solução PDMS misturada no molde.Colocar a placa de Petri num exsicador e aplicar um vácuo para desgaseificar a solução PDMS durante 20 minutos. Em seguida, coloque a placa de Petri em um forno e cure o PDMS a 80 graus Celsius por duas horas. Após o cozimento, corte e descasque cuidadosamente a placa PDMS do molde SU8.Corte a laje PDMS para separá-la em dispositivos individuais. Apare o dispositivo PDMS para fazer duas paredes ao redor da porta de carregamento da célula para segurar os ímãs. Em seguida, perfure a porta de carregamento da célula usando um perfurador de três milímetros de diâmetro.Em seguida, mude para um punção de seis milímetros e remova os reservatórios de entrada de produtos químicos na saída de resíduos. Usando um pedaço de fita adesiva, remova a poeira da superfície da placa PDMS. Coloque a laje limpa em uma lâmina de vidro limpa na máquina de plasma.Aplique o vácuo por três minutos. Em seguida, ligue a energia do plasma e defina o nível para alto. Ajuste suavemente a válvula de ar e trate o plasma do PDMS e da lâmina de vidro por três minutos.Quando terminar, desligue a alimentação do plasma e libere o vácuo. Retire cuidadosamente a placa PDMS na lâmina de vidro usando uma pinça, coloque imediatamente a placa PDMS em cima da lâmina de vidro, com as estruturas do canal voltadas para baixo, pressione suavemente a placa PDMS para ligá-la ao vidro e, em seguida, encha imediatamente o canal microfluídico com água deionizada. Os PDMS foram geralmente pressionados sobre o substrato de vidro para evitar o poço no canal de barreira.Remova a água deionizada do dispositivo e adicione 100 microlitros de solução de fribronectina da saída. Aguarde três minutos para garantir que todos os canais estejam preenchidos com solução de fibronectina. Em seguida, incube o dispositivo em uma placa de Petri coberta por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, remova a solução de fibronectina do dispositivo e adicione 100 microlitros de meio de migração da saída. Novamente, aguarde três minutos para garantir que todos os canais sejam preenchidos com o meio de migração. Incubar o dispositivo por mais uma hora em temperatura ambiente antes de usá-lo no experimento de quimiotaxia.Coloque dez microlitros de sangue total em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione dois microlitros do coquetel de anticorpos. E dois microlitros de partículas magnéticas de um kit de isolamento de neutrófilos e misture suavemente o tubo para rotular magneticamente as células marcadas com anticorpos.Incube a mistura de rótulos por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, conecte dois pequenos discos magnéticos aos dois lados da porta de carregamento da célula do dispositivo. Aspire o meio de todas as portas do dispositivo.Em seguida, pipete lentamente dois microlitros da mistura de sangue marcada no dispositivo microfluídico a partir da porta de carregamento da célula. Coloque o dispositivo microfluídico no microscópio com temperatura controlada stage a 37 graus Celsius. Aguarde alguns minutos até que neutrófilos suficientes fiquem presos na área de encaixe celular.Em seguida, adicione 100 microlitros da solução quimioatraente e 100 microlitros de meio de migração aos reservatórios de entrada designados usando dois pipetadores. Isso gerará um gradiente de quimioatração por mistura química baseada em fluxo laminar contínuo. O quimioatraente pode ser proteínas recombinantes, como FMLP, ou uma amostra clínica, como o sobrenadante do escarro de pacientes com DPOC.Uma vez que o fluxo tenha se estabilizado, adquira imagens de fluorescência do gradiente de dextron FitZ no canal. Em seguida, incube o dispositivo no estágio de microscópio com temperatura controlada ou em uma incubadora de cultura de células convencional por 15 minutos. Após a incubação, crie uma imagem do canal de gradiente usando uma objetiva de dez vezes para registrar as posições finais da célula para análise de dados.Os neutrófilos são selecionados negativamente a partir de uma gota de sangue total diretamente no dispositivo microfluídico usando marcação de anticorpos de partículas magnéticas e um par de ímãs. Para confirmar a pureza dos neutrófilos isolados no chip, foi realizada a coloração de Giemsa. Os resultados mostram os núcleos típicos em forma de anel e lobo dos neutrófilos.Após o carregamento da célula, a estrutura de encaixe alinha efetivamente as células próximas ao canal de gradiente antes de aplicar um gradiente químico. Quando exposto a um gradiente químico por 15 minutos, ocorre quimiotaxia. E pode ser medido usando imagens.Esses resultados mostram que, após 15 minutos, poucas células rastejaram através do canal de barreira na amostra controlada por meio. Em contraste, muitos neutrófilos se moveram rapidamente através do canal de barreira e migraram para um gradiente FMLP de 100 nanomolares. Uma vez que isso pode enviar quimiotaxia diretamente do nosso em 25 minutos.Isso oferece uma ferramenta útil para os pesquisadores estudarem a mecânica da migração de células inteiras. E uma ferramenta para aplicações clínicas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Este vídeo demonstra o ensaio de quimiotaxia de neutrófilos usando um método all-on-chip. O método permite o isolamento direto de neutrófilos do sangue total por seleção imunomagnética negativa seguida de ensaio de quimiotaxia em um chip microfluídico.

Um método baseado em chip microfluídico para análise rápida de quimiotaxia de neutrófilos usando sangue total

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Este protocolo detalha um ensaio concebido para medir a quimiotaxia de neutrófilos humanos a partir de uma gota de sangue total com reprodutibilidade robusta. Esta abordagem evita a necessidade de separação de neutrófilos e requer apenas alguns minutos de ensaio tempo de preparação. O chip de microfluídica permite a medida repetida de quimiotaxia de neutrófilos ao longo do tempo em crianças ou pequenos mamíferos, onde o volume da amostra é limitado.

Plataforma microfluídica para medição de quimiotaxia de neutrófilos não transformados Sangue Total

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Este protocolo gera micromatrizes de biopartículas que fornecem enxame de neutrófilos espacialmente controlados. Ele fornece fácil acesso aos mediadores que os neutrófilos liberam durante a migração e permite análise quantitativa de imagem.

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Aprenda a isolar neutrófilos de sangue total e realizar ensaios de quimiotaxia em um único dispositivo microfluídico. Este método rápido de 25 minutos facilita pesquisas sobre migração de células imunes.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

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