Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

O objetivo geral deste procedimento é congelar tecidos musculares, mergulhando-os diretamente em nitrogênio líquido enquanto se eliminam artefatos de congelamento. Maozhang He, um aluno do meu laboratório, demonstrará este procedimento junto com Yizhong Huang. Para começar, rotule a identidade da amostra em cada frasco criogênico.

Em seguida, organize o seguinte equipamento: um tanque de nitrogênio líquido, óculos de proteção ou protetor facial, luvas para freezer, pinças de 10 centímetros e pinças de 25 centímetros. Além disso, organize uma caixa de isopor, filme plástico, um bisturi e capas plásticas de encadernação A4 em PVC. Para preparar as amostras musculares, comece enchendo a caixa de isopor com nitrogênio líquido.

Em até cinco minutos após a obtenção de um espécime, coloque suavemente a amostra sobre um pedaço de capa de encadernação PVC tamanho A4 e observe a direção das fibras musculares. Em seguida, use um bisturi para fazer dois cortes paralelos através do espécime na direção das fibras musculares, com aproximadamente 3 centímetros de comprimento e distantes 0,6 centímetro um do outro. Apare o músculo cortado em um retângulo com aproximadamente 0,6 centímetro de largura, por 0,6 centímetro de altura, por 1,5 centímetro de comprimento.

Em seguida, utilizando pinças de dez centímetros, coloque suavemente a amostra sobre um pedaço de filme plástico com o eixo longitudinal do músculo incisado paralelo à borda longa do filme. Coloque o tecido muscular na parte inferior central de um tubo criogênico identificado, exatamente entre os orifícios de entrada, e feche o tubo firmemente. Para congelar a amostra de tecido, utilize pinças de 25 centímetros para submergir rapidamente todo o tubo criogênico em nitrogênio líquido, dentro do recipiente de isopor previamente resfriado, aguardando até que o nitrogênio líquido deixe de ferver.

O nitrogênio líquido deve ser suficiente para imergir todo o criovial, e o frasco criogênico deve estar completamente abaixo do nível do líquido. Transfira as amostras musculares para um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido ou para um congelador a -80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. É importante evitar o contato acidental entre os músculos congelados e os recipientes ou instrumentos à temperatura ambiente.

Para preparar lâminas, preencha um criostato entre 20 graus Celsius e 22 graus Celsius. Remova e descarte a lâmina de micrótomo usada, e limpe o suporte da lâmina e a placa antirrolagem no criostato. Em seguida, instale uma nova lâmina de micrótomo no criostato e ajuste a espessura de corte para oito micrômetros.

Retire o tubo criogênico com a amostra muscular do tanque de armazenamento em nitrogênio líquido ou do congelador a -80 graus Celsius e coloque-o em nitrogênio líquido ou sobre gelo seco. Em seguida, transfira a amostra para o criostato e aguarde 30 minutos para que o espécime atinja equilíbrio térmico com a temperatura do criostato. Após utilizar OCT para embutir a amostra, monte a amostra no suporte do espécime.

Em seguida, corte seções de oito micrômetros. Monte as seções em direção ao centro de uma lâmina microscópica à temperatura ambiente. Coloque imediatamente a lâmina em uma caixa para lâminas.

Em seguida, coloque a caixa de lâminas em um congelador a 80 graus Celsius. Não permita que a lâmina seque à temperatura ambiente. Como visto aqui, cristais de gelo se formaram quando uma amostra de músculo longíssimo dorsal de suínos foi colocada diretamente em um congelador a 80 graus Celsius, causando o bem conhecido efeito de queijo suíço no crio-corte muscular.

Os cristais de gelo também se formaram quando o tecido muscular foi imerso diretamente em nitrogênio líquido. Usando outro método, muitos cristais de gelo em forma de agulha se formaram no compartimento citoplasmático dos miócitos quando o tecido foi mergulhado em meio de montagem OCT na orientação adequada e, em seguida, congelado rapidamente em uma suspensão de isopentano. O congelamento do tecido no criovial com múltiplos orifícios proporciona excelente integridade da amostra, com um compartimento citoplasmático claramente visível e a estreita aproximação dos miócitos ao tecido circundante.

Utilizando este método, a atividade ATPase foi analisada em fibras musculares de contração rápida e de contração lenta. Quando submetidas a tempos equivalentes, as fibras de contração rápida aparecem claras, com dois graus, e as fibras de contração lenta aparecem pretas. No método padrão de congelamento mostrado aqui, o tecido muscular foi submerso em uma suspensão de isopentano sem contato direto com o meio de montagem OCT, entretanto, um estado sólido em suspensão de isopentano é difícil de manter por mais de uma hora, e o isopentano nem sempre está disponível.