Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

O objetivo geral deste procedimento é congelar os tecidos musculares, mergulhando-os diretamente no nitrogênio líquido, eliminando os artefatos de congelamento. Maozhang He, um aluno do meu laboratório, demonstrará esse procedimento com Yizhong Huang. Para começar, rotule a identidade da amostra em cada frasco criogênico.

Em seguida, organize os seguintes equipamentos: um tanque de nitrogênio líquido, óculos de segurança ou protetor facial, luvas de freezer, pinça de 10 centímetros e pinça de 25 centímetros. Além disso, organize um refrigerador de isopor, filme plástico, bisturi e capas de encadernação de PVC A4. Para preparar amostras musculares, comece enchendo o refrigerador com nitrogênio líquido.

Dentro de cinco minutos após a obtenção de uma amostra, coloque suavemente a amostra em um pedaço de capa de PVC A4 e observe a direção das fibras musculares. Em seguida, use um bisturi para fazer duas incisões paralelas através da amostra na direção das fibras musculares, com aproximadamente 3 centímetros de comprimento e 0,6 centímetros de distância. Apare o músculo inciso em um retângulo de aproximadamente 0,6 centímetros de largura, por 0,6 centímetros de altura e por 1,5 centímetros de comprimento.

Em seguida, usando uma pinça de dez centímetros, coloque suavemente a amostra em um pedaço de filme plástico com o eixo longitudinal do músculo incisado paralelo à borda longa do filme. Coloque o tecido muscular no meio inferior de um frasco criogênico rotulado, apenas entre os orifícios de entrada, e tampe bem o frasco. Para congelar a amostra de tecido, use uma pinça de 25 centímetros para submergir rapidamente todo o frasco criogênico em nitrogênio líquido, no refrigerador de isopor pré-resfriado, esperando até que o nitrogênio líquido não ferva mais.

O nitrogênio líquido deve ser adequado para imergir todo o criovírus e o frasco criogênico deve estar totalmente abaixo do nível do líquido. Transfira as amostras musculares para um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido ou um freezer de 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. É importante evitar o contato acidental entre os músculos congelados e os recipientes ou instrumentos em temperatura ambiente.

Para preparar lâminas, pré-resfrie um criostato entre 20 graus Celsius e 22 graus Celsius. Remova e descarte a lâmina de microtom antiga e limpe o porta-faca e a placa anti-rolamento no criostato. Em seguida, instale uma nova lâmina de microtom no criostato e defina a espessura de corte para oito micrômetros.

Remova o frasco criogênico com a amostra de músculo do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido ou freezer de 80 graus Celsius e coloque-o no nitrogênio líquido ou em gelo seco. Em seguida, transfira a amostra para o criostato e aguarde 30 minutos para que a amostra se equilibre com a temperatura do criostato. Depois de usar a OCT para incorporar a amostra, monte a amostra no suporte da amostra.

Em seguida, corte oito seções de micrômetros. Monte as seções em direção ao centro de uma microlâmina à temperatura ambiente. Coloque imediatamente o slide em uma caixa de slides.

Em seguida, coloque a caixa de lâminas em um freezer de 80 graus Celsius. Não deixe a lâmina secar à temperatura ambiente. Como visto aqui, cristais de gelo se formaram quando uma amostra do músculo longissimus dorsi de porcos foi colocada diretamente em um freezer de 80 graus Celsius e causou um efeito de queijo suíço bem conhecido na crioseção muscular.

Cristais de gelo também se formaram quando o tecido muscular foi imerso diretamente em nitrogênio líquido. Usando outro método, muitos cristais de gelo em forma de agulha se formaram no compartimento citoplasmático das miofibras quando o tecido foi mergulhado em meio de montagem OCT na orientação adequada e, em seguida, rapidamente congelado em uma pasta de isopentano. O congelamento do tecido no criovial de vários orifícios alcança excelente integridade da amostra, com um compartimento citoplasmático claramente visível e a aposição apertada de miofibras ao tecido circundante.

Usando este método, a atividade da ATPase foi analisada em fibras musculares de contração rápida e lenta. Quando dados tempos equivalentes, as fibras de contração rápida parecem leves, com dois graus, e as fibras de contração lenta parecem pretas. Em um método de congelamento padrão mostrado aqui, o tecido muscular foi submerso em uma pasta de isopentano sem contato direto com o meio de montagem OCT, no entanto, um estado de pasta líquida sólida do isopentano é difícil de manter por mais de uma hora, e o isopentano nem sempre está disponível.