Técnica laparoscópica para a coleção de série do fígado e mesentérica linfonodos em macacos

O objetivo geral deste procedimento laparoscópico minimamente invasivo é melhorar a avaliação dos efeitos da translocação microbiana do trato gastrointestinal por meio da coleta de linfonodos mesentéricos e biópsias hepáticas em vários momentos, melhorando o bem-estar animal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do HIV sobre as consequências imunológicas da infecção e translocação microbiana nos linfonodos mesentéricos e no fígado, e a patologia desses tecidos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a amostragem em vários momentos de um estudo com impacto mínimo para o animal ou para os parâmetros que estão sendo avaliados.

Este método pode fornecer amostras críticas para aprofundar nossa compreensão do HIV. Também pode ser aplicado a outros modelos em que a inflamação gastrointestinal e a translocação microbiana são importantes. Fazendo o procedimento estarão o Dr. Jeremy Smedley e a Dra. Cassie Moats, cirurgiões veterinários do Centro Nacional de Pesquisa de Primatas de Washington.

Depois de preparar um macaco para a cirurgia, conforme indicado no protocolo de texto, cubra-o com um campo fenestrado estéril. Em seguida, usando uma cortina de câmera estéril, cubra firmemente a câmera digital e conecte-a à torre. Conecte o osciloscópio rígido com o cabeçote da câmera.

Em seguida, conecte um cabo de luz estéril ao osciloscópio rígido e conecte-o à fonte de luz. Finalmente, monte um tubo de insuflação estéril no insuflador. Para iniciar a laparoscopia, posicione uma lâmina de bisturi 15 aproximadamente um a dois centímetros à esquerda do umbigo e faça uma incisão de aproximadamente 5 milímetros na pele que atinge os músculos abdominais.

Com a mão não dominante, levante a parede abdominal no lado cranial do corte. Em seguida, usando a outra mão, introduza através da incisão a ponta de uma agulha em varo inclinada em direção à cabeça do animal. Segure a agulha em varo pela haste e empurre-a com firmeza até que ela penetre na parede abdominal e a resistência contra a agulha diminua na cavidade abdominal.

Em seguida, encaixe o tubo do insuflador de CO2 na agulha e abra a torneira para liberar o gás na cavidade abdominal. Crie um pneumoperitônio atingindo a pressão de até 10 a 12 milímetros de mercúrio. Agora que o abdômen está totalmente insuflado, posicione a lâmina do bisturi 15 sobre o abdômen cranial esquerdo, aproximadamente dois a quatro centímetros caudal à última costela, e faça uma incisão na pele de aproximadamente cinco a sete milímetros.

Em seguida, insira através do corte um conjunto de cânula de trocarte de cinco milímetros. Introduza o conjunto a uma profundidade de um a dois centímetros, direcionando-o a aproximadamente 45 a 60 graus caudomedialmente. Em seguida, com um movimento de rotação, deslize a cânula para frente, atingindo uma profundidade de 1,5 a três centímetros para aparafusar a cânula no abdômen.

Em seguida, remova o trocarte. Desconecte o tubo insuflador da agulha em varo e, em seguida, desligue a torneira. Conecte o tubo à cânula e abra a torneira para manter o pneumoperitônio.

Uma vez verificado que a pressão está sendo mantida com sucesso, remova a agulha em varo. Em seguida, através da cânula, insira o escopo rígido na cavidade abdominal. Sob o controle da câmera, aprofunde a incisão da pele remanescente após a remoção da agulha em varo, cortando os músculos abdominais e o peritônio.

Por fim, posicione o animal com os pés elevados aproximadamente 15 a 30 graus acima da cabeça. Para coletar uma biópsia do linfonodo mesentérico, introduza uma sonda sólida na cavidade abdominal através da incisão preparada. Posicione a sonda entre o omento e o intestino e, com um movimento suave de varredura, exponha o intestino do omento para visualizar o mesentério que está escondido abaixo.

Continue a mover a sonda da direção caudal para a cranial para empurrar o omento para longe do campo operatório. Em seguida, usando a sonda, mova o cólon descendente em direção à parede abdominal. Examine o mesentério com a sonda para localizar os gânglios linfáticos mesentéricos localizados ao longo do cólon e dos vasos mesentéricos.

Assim que o linfonodo for identificado, substitua a sonda na cavidade abdominal por uma pinça de catraca Maryland e agarre o mesentério adjacente ao nódulo. Puxe o mesentério em direção à incisão e remova o escopo da cânula. Em seguida, desligue o insuflador e deixe a torneira da cânula aberta para liberar o gás do abdômen, o que facilitará a exteriorização do mesentério.

Em seguida, puxe o mesentério através da incisão. Agarre o mesentério exteriorizado com uma pinça para garantir o acesso através da incisão. Palpe ou observe o mesentério para identificar o linfonodo que deve aparecer como um nódulo mais firme ou uma área mais cinza.

Em seguida, usando hemostáticos curvos, faça uma abertura de três a cinco milímetros no mesentério adjacente ao nódulo e disseque sem rodeios quaisquer anexos ao tecido. Se necessário, ligue a vasculatura com uma sutura monofilamentar inabsorvível 4-0 e, usando o bisturi, disseque o linfonodo. Em seguida, coloque a biópsia em meio RPMI 1640 no gelo.

Finalmente, libere o mesentério e insufle o abdômen mais uma vez para permitir puxar o tecido para a cavidade abdominal. Retorne a mesa para a posição horizontal. Para coletar uma biópsia hepática, insira uma cânula rosqueada na cavidade abdominal através da incisão usada para a coleta de linfonodos.

Em seguida, usando a cânula, deslize o escopo rígido direcionado para a cavidade abdominal craniana para visualizar o fígado. Sob o controle da câmera, introduza uma pinça de biópsia através da cânula usada anteriormente para insuflar a cavidade abdominal. Posicione a pinça abaixo da margem do lobo do fígado designada de modo que suas mandíbulas fiquem voltadas para o tecido e abra a pinça permitindo que a margem caia nas mandíbulas.

Depois de ajustar sua posição, feche a pinça e mantenha a pressão por aproximadamente 20 a 30 segundos. Em seguida, remova a amostra puxando suavemente a pinça através da cânula. Coloque a biópsia em meio RPMI no gelo.

Finalmente, certifique-se de que nenhuma hemorragia seja observada no local da biópsia e feche as incisões. Apresentados aqui são os rendimentos celulares obtidos de biópsias de linfonodos mesentéricos e fígado coletadas de duas mecaques femininas saudáveis em dois pontos de tempo diferentes. Como esperado, as biópsias linfonodais produziram um número significativamente maior de células isoladas quando comparadas às biópsias hepáticas.

Independentemente do tecido de origem, mais de 85% das células isoladas eram viáveis. Em seguida, as amostras de células isoladas foram analisadas para populações de leucócitos CD45+ e CD45+CD3+. Os linfonodos mesentéricos apresentaram maiores frequências de leucócitos CD45+ e linfócitos CD3+ quando comparados às células derivadas do fígado.

A caracterização detalhada das populações isoladas mostrou que os linfonodos mesentéricos continham proporções significativamente maiores de células T CD3 + e células T CD4 +, bem como um número elevado de células T CD8 +. Por outro lado, o fígado foi significativamente enriquecido em leucócitos CD14+. Ambos os órgãos demonstraram abundâncias semelhantes de células B CD20+.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 30 a 40 minutos. Os animais são normalmente recuperados da anestesia, ativos e comendo em algumas horas, e as incisões são tão pequenas que podem ser difíceis de ver do lado da gaiola. Ao tentar este procedimento, é importante manter os animais em uma condição corporal que facilite o sucesso.

A gordura significativa do mesentério pode ser um obstáculo desafiador, pois obscurece os nós e aumenta a fritura e o sangramento. Após esse procedimento, outros métodos como flebotomia, biópsia de linfonodo periférico, endoscopia digestiva alta e inferior e biópsia retal podem ser realizados para avaliar as respostas imunes sistêmicas e mucosas, o estado de micróbios e barreiras epiteliais, bem como as cargas virais. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores de nosso laboratório explorarem populações microbianas em inflamação longitudinalmente em tecidos de macacos que antes só estavam disponíveis por necropsia.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia para o HIV, já que a translocação microbiana é uma das principais causas de inflamação que impulsiona a patogênese do HIV. Avaliar isso de forma seriada pode fornecer alvos potenciais e permitir a avaliação de intervenções terapêuticas. Não se esqueça de que trabalhar com qualquer macaco infectado por vírus pode ser extremamente perigoso.

Precauções como treinamento adequado para riscos biológicos, incluindo macacos herpesvírus 1, equipamento de proteção individual adequado, kits de mordida e arranhões e acompanhamento médico adequado devem estar disponíveis.