Avaliar impacto efeitos In Vitro

O objetivo geral deste método é gerar ondas de choque representativas que podem ocorrer durante eventos de explosão e avaliar o impacto desse choque mecânico na viabilidade das células primárias em cultura. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave relacionadas à resposta de tipos de células individuais a eventos de alta energia, como a exposição a uma onda de choque. A principal vantagem deste método é que ele nos permite avaliar respostas celulares distintas a uma única onda de choque em oposição às respostas em nível de tecido ou órgão.

As implicações dessa técnica se estendem à identificação dos mecanismos celulares alterados como resultado de lesões primárias por explosão, que são causadas pela exposição a uma onda de choque. Embora este método esteja sendo demonstrado com um tipo específico de célula de interesse, qualquer célula pode ser cultivada e colocada dentro da configuração de teste para avaliar as respostas específicas da célula a uma onda de choque. Para começar, cultive a linhagem celular de interesse em cultura padrão até atingir 80% de confluência.

Em seguida, aspire o meio. Lave as células duas vezes com PBS e adicione dois mililitros de tripsina-EDTA. Incube-os em condições de cultura padrão por cinco minutos.

Verifique brevemente se as células se dissociaram com sucesso do frasco. Em seguida, adicione quatro mililitros de FBS contendo meio de cultura ao frasco para neutralizar a tripsina e transferir as células para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue as células a 200 vezes g durante quatro minutos para as pulverizar em pellets.

Em seguida, aspire lentamente o sobrenadante tomando cuidado para não desalojar o pellet. E ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio. Coloque três pratos rotulados de 35 mililitros dentro de um prato de 90 mililitros.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio a cada prato e semeie cada um com 70 mil células. Incube as células durante a noite para permitir a fixação adequada das células antes de expô-las à onda de choque. Antes de iniciar a montagem do tubo de choque, coloque o equipamento de proteção individual adequado, incluindo botas de trabalho com biqueira de aço e um jaleco.

Comece inserindo duas barras de alinhamento através dos orifícios dos parafusos encontrados no plano horizontal do flange de saída. Em seguida, coloque uma folha de vedação de borracha nitrílica sobre a extremidade das barras de alinhamento de modo que fique entre o flange de saída e o equipamento de cultura de órgãos ex vivo. Conecte o equipamento EVOC ao flange de saída do tubo de choque deslizando o acessório sobre as barras de alinhamento.

Certifique-se de que está orientado corretamente para que a secção que contém a placa de Petri esteja localizada na sua base. Em seguida, insira quatro parafusos e arruelas M24 nos orifícios restantes e aperte firmemente as porcas e parafusos sequencialmente de forma diagonalmente simétrica, enquanto verifica visualmente se o equipamento EVOC e o tubo de choque se alinharam com sucesso. Em seguida, conecte um transdutor de pressão ao equipamento EVOC e conecte-o à fonte de corrente usando um cabo sensor.

Além disso, use um cabo BNC para conectar a fonte de corrente ao osciloscópio. Certifique-se de que todas as válvulas de liberação e controles de fluxo no tubo de choque estejam fechados. Em seguida, abra a linha de ar comprimida externa embutida e gire manualmente o regulador de pressão no sentido horário para carregar o solenóide a 2,5 bar.

Abra o cilindro de ar comprimido e gire lentamente o regulador de pressão no sentido horário para aumentar a pressão para aproximadamente 15 bar. Em seguida, prepare os diafragmas cortando uma folha de plástico de 0,125 mililitro de espessura em quadrados de 10 centímetros por 10 centímetros. Crie alças com fita adesiva e fixe-as na parte superior e inferior do diafragma.

Use-os para posicionar cuidadosamente o diafragma próximo ao pequeno flange frontal pela câmara da culatra. Certifique-se de que o diafragma esteja reto e posicionado corretamente antes de fechar a culatra. Em seguida, prenda-o no lugar usando quatro parafusos e porcas M24.

Dentro da coifa estéril, prepare membranas adesivas permeáveis a gás de forma que cada uma seja grande o suficiente para cobrir a parte superior de uma placa de Petri de 35 mililitros. Em seguida, transfira uma placa de Petri de 90 mililitros contendo três amostras experimentais para o exaustor. Aspire o meio de um dos pratos e cubra-o com duas seções de membrana, garantindo que haja uma vedação firme entre a membrana e a borda do prato.

Transfira o sample para o equipamento EVOC e prenda-o na base do acessório de forma que a parte superior do prato fique alinhada com a base interna do tubo de choque. Neste ponto, coloque protetores auriculares, óculos de proteção, botas de segurança e um jaleco. Pressurize o sistema de tubo de choque girando o botão de controle de fluxo no regulador no sentido horário.

Na parte inferior do painel de controle, selecione a entrada da culatra dupla para uma onda de choque de curta duração ou a entrada do tubo do acionador para uma duração de onda aumentada. Em seguida, ligue a fonte de alimentação CC e o osciloscópio para exigir os dados da forma de onda. Em seguida, acenda as luzes de segurança usando o interruptor na parede oposta ao painel de controle para notificar outros pesquisadores para não entrarem na sala quando o tubo de choque estiver carregando.

Na caixa de controle do solenóide, pressione o interruptor para fechar o solenóide. Em seguida, no painel de controle, abra lentamente o controle de fluxo girando o botão no sentido anti-horário para aumentar gradualmente a pressão dentro da câmara de compressão. Quando a pressão de ruptura do diafragma for atingida, o diafragma se romperá e um estrondo será ouvido.

Assim que esse ruído for ouvido, feche rapidamente o botão de controle de fluxo. Em seguida, abra o solenóide desligando o interruptor na caixa de controle do solenóide e desligue a luz de segurança. Transfira a amostra de célula para o exaustor estéril.

Lá, remova a membrana adesiva permeável ao gás e encha o prato com dois mililitros de meio de crescimento fresco. Adicione 200 microlitros de reagente indicador redox a cada prato experimental logo após reabastecê-los com dois mililitros de meio de crescimento fresco. Em seguida, transfira o prato para uma incubadora padrão por quatro horas.

Após a incubação, transferir duas alíquotas de 100 microlitros de cada placa para uma placa apropriada de 96 poços. Leia a placa em um leitor de placa de fluorescência e, em seguida, exporte e salve os dados. Para imagens fluorescentes de células vivas e mortas, as células precisam ser inicialmente revestidas em uma lamínula de vidro dentro das placas de cultura de 35 mililitros.

Após o tratamento por ondas de choque, aspire o meio e lave as células duas vezes em um mililitro de PBS. Em seguida, transfira 100 microlitros do reagente de mortos vivos do kit de imagem para cada amostra. E incube as células e reagente à temperatura ambiente, proteja-o da luz por 15 minutos.

Após a incubação, remova o reagente e lave as células uma vez usando um mililitro de PBS. Usando uma pinça de ponta fina, remova cuidadosamente a lamínula do prato de 35 mililitros e coloque-o virado para baixo em uma lâmina de microscopia de vidro. Adquira imagens para cada amostra usando um microscópio fluorescente equipado com uma lente objetiva 5X com uma abertura numérica de 0,25.

Em seguida, use um software de análise de imagem para contar manual ou automaticamente o número de células verdes vivas e células mortas vermelhas de cada imagem. Usando o método descrito aqui, as células cultivadas em monocamada foram expostas a ondas de choque geradas com um tubo de choque. Os sensores no tubo de choque exibem os perfis de pressão observados em diferentes locais ao longo do tubo.

Usando um ensaio de indicação redox, verificou-se que a aplicação de uma onda de choque de 127 quilopascal foi capaz de reduzir significativamente a viabilidade das células da papila dérmica em comparação com os controles após 24 horas em cultura. A aplicação de uma onda de choque de 72 quilopascais ou menos não reduziu a viabilidade. Para apoiar essas observações, um ensaio de mortos-vivos também demonstrou uma redução da viabilidade celular naqueles expostos à onda de choque de 127 quilopascal quando comparados ao controle.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita de forma variável e rápida a uma taxa de 60 amostras por hora. O tubo de choque pode ser usado para gerar ondas de choque para explorar uma variedade de lesões primárias por explosão. Estes podem variar de pulmão blasto até ossificação heterotópica, que é a formação inadequada de osso dentro dos tecidos moles do corpo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar os riscos envolvidos ao trabalhar com gases comprimidos e ondas de choque de alta energia e sempre seguir as diretrizes de segurança corretas. Pequenas modificações em um tubo de choque podem nos permitir alterar a onda de choque. Podemos então avaliar a resposta celular a diferentes perfis e intensidades de pressão, que representam diferentes cenários de explosão.

Seguindo esse procedimento, o sequenciamento de próxima geração pode ser realizado para responder a perguntas adicionais de pesquisa, como: Como a exposição a uma onda de choque altera nossa inscrição natural dentro das células?