Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

O objetivo geral deste procedimento é analisar a expressão e produção de genes e marcadores proteicos, respectivamente, da diferenciação neural de células-tronco embrionárias de camundongos. Este método pode ajudar a determinar o mecanismo responsável pela inibição da diferenciação neural pela idade bruta dos DPAs e levar a melhores protocolos para diferenciar células-tronco em neurônios para fins terapêuticos. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita o rastreamento do processo de diferenciação neural nos níveis de emerina e proteína, inclusive por microscopia óptica.

Demonstrando o procedimento estará o Dr. Junning Yang, um pesquisador associado em meu laboratório. Comece a formação do corpo embrióide colhendo células-tronco embrionárias com 0,25% de tripsina-EDTA por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Adicione o meio de Dulbecco modificado de Iscove fresco, ou IMDM, com 15% de FBS às células de desprendimento e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.

Centrifugue a 160 x G por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro e prepare uma suspensão de cinco x 10 até a quinta células por mililitro em IMDM com ácido retinóico 0,5 micromolar. Em seguida, use uma pipeta de oito canais e pontas de 200 microlitros para plaquear gotas de 120 microlitros por placa de Petri de 100 milímetros.

Inverta o prato e encha a tampa invertida com PBS para evitar que as gotas penduradas sequem. Cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por três a quatro dias. Use pontas de pipeta de 200 microlitros para colher corpos embrióides suspensos cultivados por três dias.

Toque em um corpo embrióide com uma ponta de pipeta e transfira-o para uma lamínula revestida com fibra nectina em uma placa de 24 poços. Mude o meio das culturas a cada dois ou três dias. Ao trocar o meio, colete o meio usado para análise de secreção de proteínas, conforme necessário.

Para detectar proteínas secretadas no meio, transfira 500 microlitros de meio corporal embrióide para filtros centrífugos de corte de 10 kilodalton e gire a 20.000 x G a quatro graus Celsius. Examine o meio restante dentro dos filtros centrífugos a cada 15 a 20 minutos para evitar enriquecimento excessivo. Pare a centrifugação quando o volume do meio restante cair para 25 microlitros.

Inverter o filtro e centrifugar a 160 x G a quatro graus Celsius e, em seguida, recolher o restante do meio concentrado seguindo as instruções do fabricante. Para uma cultura 3D, colha corpos embrióides cultivados por quatro dias como gotas suspensas com pontas de pipeta de 200 microlitros, como antes. Transfira 30 corpos embrióides para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e, em seguida, prepare a solução de gel de colágeno diluindo os volumes apropriados de solução de colágeno e 5X DMEM, adicionando a solução de neutralização e misturando bem imediatamente.

Coloque o gel de colágeno no gelo. Em seguida, pipete um volume apropriado de solução de colágeno resfriado no tubo que contém os corpos embrióides e, em seguida, pipete suavemente a suspensão do corpo embrióide nos poços de uma placa de seis poços sem criar bolhas. Transfira imediatamente a placa para 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por 60 minutos para iniciar a polimerização do colágeno.

Após os 60 minutos, sobrepor a placa contendo os corpos embrióides com IMDM. Para a dissociação do corpo embrióide, colete novamente os corpos embrióides suspensos de quatro dias com pontas de pipeta de 200 microlitros. Desta vez, transfira-os para uma placa de Petri bacteriológica não adesiva contendo IMDM com 15% de FBS e cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono, por mais quatro dias.

Verifique os corpos embrióides duas vezes ao dia para garantir que eles não se prendam ao fundo. Agite suavemente o prato para evitar a fixação do corpo embrióide. Após quatro dias, transferir os corpos embrióides para um tubo de centrifugação e centrifugar a 185 x G durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Após centrifugação, remover o sobrenadante. O volume da paleta não deve exceder 100 microlitros. Em seguida, pipete um mililitro de colagenase tipo I a 0,25%, suplementado com 20% de FBS em PBS no tubo de corpos embrióides.

Incube a mistura por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Pipete suavemente a suspensão usando uma ponta de pipeta de um mililitro a cada 20 minutos. Após a incubação, lave suavemente as células três vezes com PBS.

Se houver agregados de células, use um filtro de células com uma malha de 100 mícrons para removê-los. Coloque as células em lamínulas revestidas de gelatina no IMDM e, em seguida, incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Lave os corpos embrióides 2D ou 3D dissociados com PBS.

Em seguida, fixe com quatro por cento de paraformaldeído e PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar as células fixas três vezes com PBS para remover detritos de células flutuantes, adicione 1% de triton X-100 em PBS para permeabilizar as células por 20 minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem como antes, remova a última lavagem e bloqueie com 5% BSA em PBS por 30 minutos.

No final da incubação, prepare uma dilucição de anticorpo primário em 1% BSA em PBS suplementado com 0,03% de triton X-100. Decorridos os 30 minutos, substitua a solução de bloqueio pela solução primária de anticorpos. Incube por três horas em temperatura ambiente, ou durante a noite, a quatro graus Celsius.

Após a lavagem, aplique um anticorpo secundário em PBS e incube por uma hora em temperatura ambiente. Por fim, monte lamínulas em lâminas de vidro com um meio antidesbotamento para microscopia óptica. Esta imagem mostra a emergência de brotos de um corpo embrióide gerado a partir de ESCs, positivo para duas cópias do gene Syx, que codifica um fator de troca de guanina que ativa a GTPase RhoA.

A imagem foi tirada após seis dias em cultura 3D. Este corpo embrióide formado a partir de Syx KnockOut ESCs demonstra aumento da brotação após o mesmo tempo em cultura. Aqui, imagens de fase das bordas do corpo embrióide 2D mostram que as células se expandiram mais rapidamente a partir de Syx KnockOuts do que de Syx do tipo selvagem.

Essas imagens de imunofluorescência ilustram que o marcador de diferenciação neural, Nestin, mostrado em vermelho, era mais abundante em células que se expandiram de corpos embrióides 2D6 KnockOut de seis dias do que de suas contrapartes do tipo selvagem Syx. Aqui, as imagens de imunofluorescência mostram que os marcadores de diferenciação neural Nestin e beta III Tubulin eram mais abundantes em células dissociadas de corpos embrióides 3D6 KnockOut de 13 dias do que de suas contrapartes do tipo selvagem Syx. Este é um procedimento demorado devido à duração do crescimento e diferenciação do corpo embrióide.

Não requer apenas pelo menos oito dias, mas em alguns casos seguimos a diferenciação até 24 dias. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de limitar a viabilidade do diâmetro do corpo embrióide para garantir taxas de diferenciação semelhantes ao longo dos corpos embrióides.