Name: Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a controlar a expressão gênica no tronco encefálico auditivo da galinha usando eletroporação in ovo. Este método permite estudar o desenvolvimento de neurônios auditivos e fenômenos fisiopatológicos relacionados.

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Gostaríamos de agradecer aos Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria e Sra. Ximena Optiz-Araya para assistência inicial com configuração do protocolo e para fornecer plasmídeos. Este trabalho foi suportado pela concessão NIH / NIDCD DC013841 (JTS).

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Northwestern e realizados de acordo com as Diretrizes de Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Manuseio de ovos <ol><li> Compre ovos fertilizados de um fornecedor local. Armazene os ovos a 13 ° C na geladeira por não mais de 5 dias antes da incubação. A viabilidade do embrião diminui significativamente após 1 semana. </li><li> Espume cada ovo com etanol a 70% antes de se estabelecer na incubadora. </li><li> Configure 1-2 dúzias de ovos em seus lados em uma incubadora com a temperatura ajustada para 38 ° C a ~ 50% de umidade. Isso garante o posicionamento adequado do embrião para eletroporação e viabilidade ideal, respectivamente. NOTA: Após 48-52 h de incubação, os ovos estarão no estágio Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 e pronto para eletroporação. </li></ol> 2. Preparação <ol><li> Plasmid MiXing <ol><li> Adicione 1 μL de 0,1% de verde rápido (0,1% em 18 MΩ desionado e H 2 O destilado [ddH 2 O]) por cada 7 μL de mistura de DNA. </li><li> Para co-electroporação de plasmídeos múltiplos, misture plasmídeos em proporção 1: 1. A concentração final de DNA deve ser 5-8 μg / μL. </li></ol></li><li> Pipeta de injeção de preenchimento <ol><li> Puxe pipetas em um extractor de micropipetas. Encha a pipeta com 1-2 μL de plasmídeos usando uma agulha de seringa 28G. </li><li> Deslize a ponta da pipeta para 10 a 20 μm usando fórceps. Use um microscópio para ajudar a determinar o tamanho da ponta de pipeta quebrada. Anexe a pipeta ao titular da pipeta do picospritzer. </li></ol></li></ol> 3. Windowing NOTA: O procedimento de janelas foi publicado antes de 13 . Consulte a referência 13 para obter informações visuais adicionais. <ol><li> Limpe todos os instrumentos e a área de trabalho com 70%etanol. </li><li> Pegue o número desejado de ovos estabelecidos para fora da incubadora (entre 6-10), deixe à temperatura ambiente e colete ovos com 70% de etanol novamente. Os ovos permanecem viáveis ​​por pelo menos 2 h após a remoção da incubadora. </li><li> Coloque o ovo em cima de um iluminador leve para identificar o posicionamento do embrião. Circule o centro da área escura ( ou seja , embrião) com um lápis. </li><li> Usando uma agulha 19G, puxa um buraco na extremidade contundente do ovo. </li><li> Puxar outro buraco perto do círculo desenhado no lado aguçado do ovo. Remova um pequeno pedaço da casca de ovo exterior (cerca de 16 mm 2 ) com a agulha 19G e, em seguida, remova uma pequena peça da casca de ovo interior (cerca de 8 mm 2 ) com fórceps. </li><li> Com uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha 19G, retire 1,5-2,5 mL de albumina do ovo através do buraco sem corte. Certifique-se de inclinar a agulha para baixo a 45 °. </li><li> Cubra o orifício sem corte com um pequeno pedaço de fita (1 cm x 1 cm). Cubra o círculo desenhado eD o segundo furo com fita adesiva (2,5 cm x 4 cm). </li><li> Com tesoura curvada (corte = 2,5 cm), corte uma janela dentro do círculo. As tesouras devem ser paralelas à casca do ovo e o diâmetro da janela deve ser inferior a 2 cm. </li></ol> 4. Injeção de plasmídeo <ol><li> Ligue o picospritzer. Ajuste a pressão para 18 psi e a duração para 5 μs. Ligue o tanque de ar e a lâmpada para o microscópio de dissecação. </li><li> Faça uma solução de reserva de 30 mL de uma diluição 1:10 de tinta indiana comprada na loja misturada com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Armazenar a 4 ° C. A injeção de tinta indiana é um passo importante para obter uma melhor visualização do embrião de frango. <ol><li> Encha uma seringa de 1 mL com a solução diluída de tinta indiana. Anexe uma agulha 27G e expulse as bolhas que estão presentes na seringa. </li><li> Insira a agulha logo abaixo da membrana da gema ~ 2 - 3 mm do embrião e injete suavemente 0,2 mL de tinta indiana sob o embrião. FazNão injetar mais de 0,5 mL da tinta indiana, pois pode diminuir a sobrevivência do embrião. </li></ol></li><li> Coloque o ovo com janelas em um suporte de ovo sob o microscópio de dissecação. Use a maior ampliação para melhor visualização do local de injeção de plasmídeo. </li><li> Usando fórceps, remova a membrana sobre a área de injeção. Regiões auditivas de tronco encefálico de interesse ( ou seja , NM e NL) surgem de Rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 estão localizados adjacentes aos otocistos (uma estrutura embrionária em vertebrados que se desenvolve na orelha interna) que servem como marcos para injeções plasmáticas R5 / R6. </li><li> Abaixe a pipeta cheia de DNA no tubo neural que cobre a região R5 / R6 e entre otocistos usando o micromanipulador. Um esquema da colocação ideal é mostrado na Figura 1A . </li><li> Aplique pressão de ar (18 psi, 5 μs de duração) do picospritzer para expulsar o DNA no tubo neural. </li></ol> 5. Electroporação <ol><li> Ativar tO estimulador de corrente / tensão. </li><li> Encha uma seringa de 3 mL com PBS e prenda o filtro da seringa. Adicione 1-2 gotas de PBS no embrião. </li><li> Abaixe o eletrodo bipolar para o embrião usando o micromanipulador com o eletrodo negativo acima do local da injeção (medial) e o eletrodo positivo lateral ao R5 / R6 ( Figura 1A ). Evite o contato direto com o embrião. Use eletrodos bipolares onde o material do eletrodo é iridio de platina. Ajuste o espaçamento entre as pontas para 0,5 mm com fórceps. </li><li> Usando um estimulador de corrente / tensão, pulso 20 vezes a 50 V por 1 ms a intervalos de 1 s. </li><li> Após a eletroporação, adicione uma gota de PBS sobre a área exposta. Remova cuidadosamente o eletrodo e limpe-o com um tecido de laboratório e 70% de etanol. Feche a janela expondo o embrião com fita adesiva. </li><li> Marque a casca de ovo com o tipo de plasmídeo injetado e a data da escotilha. </li><li> Coloque os ovos de volta na incubadora com a janela voltada para cima. Incube a 38 ° C com 50% De umidade até atingir o estágio de desenvolvimento desejado. </li><li> Se um vetor tet-on é eletroporizado para o controle temporal da expressão gênica, aplique Doxiciclina (Dox) a cada 24 h para induzir a expressão gênica (ver Seção 6). </li></ol> 6. Sistema Tet-on para Controle Temporal de Expressão Genética <ol><li> Use os seguintes plasmídeos: PCAGGS-T2TP: um plasmídeo que expressa transposase. PT2K-CAGGS-rtTA-M2: um plasmídeo que expressa de forma estável a proteína de ligação de Dox. PT2K-BI-TRE-EGFP: um plasmídeo que contém uma expressão de promotor tet-on bidirecional bidireccional (TRE) do repórter EGFP e um segundo gene de interesse. NOTA: Os três plasmídeos acima mencionados precisam ser co-electroporados em uma proporção de 1: 1: 1. </li><li> Preparação da solução de estoque: <ol><li> Dissolver Dox em PBS estéril para produzir uma solução de reserva de 1 mg / mL. Armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Aplicação Dox: <ol><li> Para induzir o expressioN do gene de interesse durante certos estágios de desenvolvimento, aplique Dox a cada 24 h. </li><li> Ao aplicar o Dox, retire o ovo, abra a janela, pipette 50 μL de Dox na membrana corioalointoica, feche a janela e coloque o ovo novamente na incubadora. </li></ol></li></ol> 7. Preparação da área de dissecação para fatias do tronco encefálico NOTA: As seguintes seções (7-9) e procedimentos foram publicados antes de 14 . Veja essas referências para obter informações visuais adicionais. <ol><li> Prepare uma solução de ágar (40 mg / mL de agarose, ou seja , 4% em ddH 2 O). Despeje a solução de ágar numa placa de Petri e deixe-a solidificar à temperatura ambiente. Armazene a placa de ágar coberta na geladeira para uso futuro durante o corte de tecido do tronco encefálico. </li><li> Fluido espinhal cerebral artificial contínuo (ACSF) com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,2-7,4 e osmolaridade: 295-310 mOsm / L).</li><li> Limpe a área de trabalho e vibratome com 70% de EtOH e enxágue a lâmina com água destilada. </li><li> Coloque uma almofada de absorção de fluido limpa na área de trabalho com ferramentas de dissecação adequadas. </li><li> Retire a placa de ágar da geladeira, corte um pequeno cubo de ágar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Cola o bloco de agar até o estágio de uma câmara de corte de vibratoma usando superglue comercialmente disponível. </li></ol> 8. Isolamento do Brainstem Auditivo de Frango <ol><li> Abra o ovo no local da janela gravada. Puncione o saco de membrana com um bisturi e remova a cabeça do embrião de frango. </li><li> Decapite o frango com tesoura afiada. </li><li> Coloque a ponta da lâmina de barbear ligeiramente posterior aos olhos. Incise através do crânio na linha média rostral-caudal. Aplique uma ligeira pressão dependendo da idade do embrião. Os embriões mais antigos exigem mais pressão. </li><li> Empurre suavemente a pele e as penas para expor o crânio e verificar o corte da linha média. </li><li> Aplicando sTrong pressure, corte a porção rostral do crânio com uma lâmina de barbear. Coloque imediatamente a lâmina posterior aos olhos e corte todo o tecido do crânio e do cérebro. </li><li> Faça incisões de linha a lateral com tesouras na região caudal do crânio, ligeiramente anterior aos músculos do pescoço em ambos os lados da cabeça. Exponha cérebro e cerebelo puxando o crânio e o excesso de tecido. </li><li> Corte o tecido ligado ao tronco cerebral com uma tesoura e remova o tronco encefálico, que se desprende livremente do crânio. </li></ol> 9. Preparação de fatias de tronco encefálico para eletrofisiologia ou imagem in vivo <ol><li> Desligue o tronco cerebral através da tela óptica. </li><li> Retire o cerebelo cortando pedúnculos com tesoura, expondo o piso do quarto ventrículo. </li><li> Usando pinças, remova qualquer tecido membranoso e vasos sanguíneos da superfície do tronco encefálico. </li><li> Para bloquear o tronco encefálico, faça um corte horizontal na extremidade mais rostral do chão dos quatroVentrículo, apenas caudal ao córtex. Faça cortes laterais perpendiculares através da tela óptica para isolar o tronco encefálico. </li><li> Coloque uma pequena quantidade de super cola na fase de vibração diretamente na frente do bloco de ágar. </li><li> Levante o tronco encefálico na medula espinhal usando pinças e coloque-o na super cola com o lado rostral para baixo e o lado dorsal em direção à pá vibratoma. Remova o excesso de cola com um papel de laboratório ou papel de filtro. </li><li> Despeje a ACSF oxigenada no estágio de vibração. Coloque a lâmina vibratoma em um ângulo de 20-22 °. Comece vibratome na oscilação de amplitude máxima. Mova o andar em direção à lâmina para que a parte superior do tecido seja paralela à lâmina. </li><li> Mova rapidamente a lâmina para o tecido do tronco encefálico. Deslize a lâmina lentamente antes do contato da lâmina com o tecido. </li><li> Corte o tecido com a velocidade de avanço mais lenta possível. Uma vez que a lâmina atravessa toda a seção de tecido coronal, remova suavemente a fatia usando uma pipeta de transferência. &lt;/ Li&gt; <li> Abaixe o palco 200-300 μm e faite novamente. Repita até que os marcos anatômicos dos núcleos auditivos se tornem visíveis, por exemplo, a região distinta de neuropil dorsal / ventral de NL e a localização medial do NM em relação à NL. </li><li> Mantenha cuidadosamente as fatias no ACFS. Isso pode ser feito a temperatura ambiente (22 ° C) ou perto de condições fisiológicas (~ 41 ° C) usando um banho de água quente. Observe a ordem de cortar. A primeira fatia corresponde à região mais caudal do tecido e a última fatia corresponde à região mais rostral. Isso representa grosseiramente a organização tonotópica do tronco auditivo auditivo, de regiões de codificação de baixa a alta freqüência, respectivamente. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A electroporação in ovo é um método para expressar ou derrubar genes de interesse para analisar a função de genes in vivo 8 , 9 . No embrião de frango, é um método inovador para expressar genes codificados por plasmídeos em diferentes regiões do tronco encefálico 8 . Para garantir a expressão ideal, são necessárias várias etapas críticas. Em primeiro lugar, apenas injete embriões cujos otocistos sejam claramente...

A codificação neural rápida do som é essencial para funções auditivas normais. Estas incluem habilidades de localização de som 1 , fala na discriminação de ruído 2 e a compreensão de outros sinais de comunicação relevantes ao comportamento 3 . Os neurônios análogos localizados no tronco encefálico auditivo de aves e mamíferos são altamente especializados para codificação neural rápida 4 . Estes incluem o núcleo de galinha magnocellular (NM), o núcleo laminaris (NL) e seus análogos de mamíferos, o núcleo coclear anteroventral (AVCN) e a azeitona mediana superior (MSO), respectivamente 5 . No entanto, os mecanismos de desenvolvimento que regulam a codificação neural rápida são mal compreendidos no tronco encefálico auditivo. Portanto, é vantajoso estudar genes específicos que são responsáveis ​​pela codificação neural rápida, a fim de melhor compreender a sua expressão, regulação e função no auDesenvolvimento de distritos. O embrião de frango em desenvolvimento é uma ferramenta de pesquisa eficaz e bem estabelecida para estudar questões biológicas básicas de desenvolvimento do sistema auditivo 6 , 7 . Avanços moleculares recentes abordaram essas questões biológicas no embrião de frango em desenvolvimento, expressando ou derrubando genes de interesse para analisar a função de genes in vivo 8 , 9 . Investigar o papel regulador de genes específicos é um avanço significativo na compreensão de patologias associadas aos déficits auditivos. Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos no tronco encefálico de frango onde ocorre uma rápida codificação neural de som 10 . Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com os fômulos 5 e 6 11 , 12 (R5 /R6), mostramos o controle espacial da transfecção do plasmídeo em NM e NL. Além disso, mostramos a regulação temporal da expressão adotando um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox) 8 .

<table><tbody><tr><td>Ovos de galinha leghorn brancos fertilizados</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III,</td></tr><tr><td>estimulador de corrente/voltagem</td> de canal único ou duplo <td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Agulhas de seringa Microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm de comprimento, (Pacote de 5)</td></tr><tr><td>Suporte de eletrodo</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Aplicações de Pressão Não Elétrica</td></tr><tr><td>Microeletrodo estimulante</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Tanque de ar/regulador</td><td>NU Serviços</td><td></td> de Laboratório <td>Secar ao ar 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Fita plástica transparente</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxiciclina hiclato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerador de ovos</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &deg; C (56-61&deg; F)</td></tr> <tr><td>Incubadora</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &deg; C (100 &deg; F), ~50% de umidade</td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, Microscópio V8, 50.4X</td></tr><tr><td>Fonte de luz fria</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000</td></tr><tr><td>LED Micromanipuladores</td><td>Narishige Japão</td><td>Modelo: MM-3</td><td>2 Micromanipuladores</td></tr><tr><td>Tubos capilares</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Borossilicato de parede espessa (dimensões)</td></tr><tr><td>Seringas</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>BD Precision Glide&nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Suporte para ovos Dumont super fino</td></tr> Base <tr><td></td><td>de</td><td>argila</td>personalizada <td></td> também funciona</tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Instrumento</td><td></td> Sutter <td>Modelo P-97</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &mu; m</td></tr></tbody></table>

em ovo electroporation no brainstem auditivo da galinha

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

A eletroporação é um método que introduz genes de interesse em organismos biologicamente relevantes como o embrião de frango. Está estabelecido há muito tempo que o embrião de frango é um modelo de pesquisa eficaz para estudar as funções biológicas básicas do desenvolvimento do sistema auditivo. Mais recentemente, o embrião de frango tornou-se particularmente valioso no estudo da expressão gênica, regulação e função associada à audição. A eletroporação no ovo pode ser usada para direcionar as regiões auditivas do tronco encefálico responsáveis ​​por funções auditivas altamente especializadas. Estas regiões incluem o núcleo de galinha magnocellularis (NM) e o núcleo laminaris (NL). Os neurônios NM e NL surgem de precursores distintos de rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos para estudar propriedades relacionadas a genes nessas regiões. Mostramos um método para o controle espacial e temporal da expressão gênica que promove o ganho ou a perda de fenótipo funcionalEs. Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com R5 / R6, mostramos transfecção plasmídica em NM e NL. A regulação temporal da expressão gênica pode ser conseguida através da adoção de um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox). A técnica de eletroporação in ovo - juntamente com ensaios funcionais bioquímicos, farmacológicos e in vivo - fornece uma abordagem inovadora para estudar o desenvolvimento de neurônios auditivos e fenômenos fisiopatológicos associados.

Mostramos aqui que em ovo a eletroporação permite a expressão gênica em um sistema biológico normalmente desenvolvido. Os genes codificados por plasmídeo são injetados focalmente no tubo neural que cobre R5 / R6. Um exemplo esquemático das colocações de eletrodo e pipeta em relação aos marcadores anatômicos importantes é mostrado na Figura 1A . A localização correta da injeção do plasmídeo é confirmada 24 h após a eletroporação e mostrada na Figura 1B</s...

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

O objetivo geral deste procedimento é controlar espacial e temporalmente a expressão gênica no tronco encefálico auditivo de embriões de galinha. A utilização da eletroporação in ovo fornece uma abordagem inovadora para estudar o desenvolvimento de neurônios auditivos e fenômenos patofisiológicos associados. Este procedimento pode ajudá-lo a responder perguntas fundamentais na área do desenvolvimento neural auditivo, como de que forma o controle da expressão gênica promove ganho ou perda de fenótipo necessários para o desenvolvimento normal do tronco encefálico auditivo.Quem demonstrará o procedimento será a Doutora Ting Lu, pesquisadora pós-doutoranda do meu laboratório. Para começar, prepare as soluções de plasmídeo adicionando um microlitro da solução de Verde Rápido para cada sete microlitros da mistura de DNA. Em seguida, misture as soluções de DNA em uma proporção de um para um para eletroporação simultânea de múltiplos plasmídeos.Uma vez que a solução de plasmídeo é preparada, fabrique pipetas com um puxador de micropipetas. Em seguida, use uma agulha de seringa de calibre 28 para encher a pipeta com um a dois microlitros da solução de plasmídeo. Usando pinças, quebre a ponta da pipeta para 10 a 20 mícrons e determine o tamanho da ponta quebrada sob um microscópio, depois conecte a pipeta a um picospritzer por meio de um suporte de pipeta.Antes do procedimento, armazene ovos adquiridos de um fornecedor local por não mais de cinco dias em geladeira a 13 graus Celsius. Para começar, desinfete o ovo com etanol 70%. Em seguida, para obter o posicionamento adequado do embrião, incube o ovo de lado a 38 graus Celsius e aproximadamente 50% de umidade para garantir viabilidade ideal. Após 48 a 52 horas de incubação, quando o ovo atingir o estágio Hamburger-Hamilton aproximadamente 12 a 13, desinfete a área de trabalho e todos os instrumentos com etanol 70%.Em seguida, retire o ovo da incubadora, deixe-o em temperatura ambiente e limpe-o com etanol 70% pela segunda vez. Usando um iluminador de luz, identifique a posição do embrião, visível como uma área escura, e, com um lápis, marque-a desenhando um círculo ao redor do seu centro. Faça um furo na extremidade romba do ovo com uma agulha de 19 gauge e, depois, faça um segundo furo próximo ao círculo desenhado na extremidade pontiaguda do ovo.Use a agulha de 19 gauge para remover um pequeno pedaço da casca externa do ovo e, com pinça, remova um pequeno pedaço da membrana interna da casca do ovo. Em seguida, introduza uma agulha de 19 gauge acoplada a uma seringa de três mililitros através do orifício na extremidade romba do ovo e retire 1,5 a 2,5 mililitros de albúmen. Cubra o orifício na extremidade romba do ovo com um pedaço de fita de um centímetro por um centímetro e, depois, cubra o círculo desenhado e o segundo orifício com um pedaço de fita de 2,5 centímetros por quatro centímetros.Usando tesoura curva com uma borda de corte de 2,5 centímetros e mantendo-a paralela à casca do ovo, excise uma janela dentro do círculo marcado. Para injetar o plasmídeo, ligue o picospritzer e ajuste o equipamento para aplicar uma pressão de 18 PSI durante cinco microssegundos, em seguida, ligue o tanque de ar e a lâmpada do microscópio de dissecação. Em seguida, prepare 30 mililitros de uma solução estoque de Tinta da Índia comercialmente adquirida em PBS estéril.Aspire a solução de tinta da Índia para dentro de uma seringa de um mililitro, em seguida acople uma agulha de 27 graus e remova todas as bolhas que aparecerem na seringa. Para visualizar o embrião, introduza a agulha logo abaixo da membrana da gema, aproximadamente dois a três milímetros do embrião, e injete cerca de 0,2 mililitros de tinta da Índia. Em seguida, transfira o ovo com janela para um suporte de ovo, posicionado sob o microscópio estereoscópico, e mude para a maior ampliação para obter a melhor visualização do local de injeção do plasmídeo.Remova a membrana que cobre a área de injeção com pinça. Localize os otocistos e use-os como marcos anatômicos para identificar os rombômeros cinco e seis, localizados nas proximidades, dos quais se originam o núcleo magnocelular e o núcleo laminar. Utilizando um micromanipulador, posicione a pipeta contendo o DNA no tubo neural que recobre a região R5-R6, situada entre os otocistos.Ejete o DNA para dentro do tubo neural com o picospritzer. Para iniciar a eletroporação, ligue o estimulador de voltagem, em seguida, acople um filtro de seringa de 0,22 mícrons a uma seringa de três mililitros previamente preenchida com PBS e adicione uma a duas gotas do PBS filtrado sobre o embrião. Posteriormente, mova um eletrodo bipolar em direção ao embrião utilizando o micromanipulador e posicione o eletrodo negativo acima do local de injeção, mantendo o eletrodo positivo na região lateral de R5-R6.Com o estimulador de voltagem, aplique 20 pulsos de 50 volts por um milissegundo em intervalos de um segundo. Você verá bolhas próximas à ponta do eletrodo. Após a eletroporação, adicione uma gota de PBS na área exposta, remova cuidadosamente o eletrodo e limpe-o com um lenço de laboratório e etanol a 70%, em seguida cubra a janela sobre o embrião com fita adesiva.Por fim, anote o tipo de plasmídeo injetado e a data de eclosão na casca do ovo, e coloque o ovo no incubador com o lado da janela voltado para cima. Incube os ovos a 38 graus Celsius com umidade de 50%, até que o estágio de desenvolvimento desejado seja atingido. Vinte e quatro horas após a eletroporação, retire o ovo do incubador, abra a janela e, utilizando um microscópio estereoscópico, confirme a localização correta da injeção do plasmídeo alvo.Se vetores tet-on foram utilizados, pipete 50 microlitros de Doxiciclina para dentro da membrana corioalantoide, feche a janela e devolva o ovo ao incubador. São apresentadas aqui fotografias de um corte do tronco encefálico preparado a partir de um frango do dia embrionário 12, obtidas sob iluminação de contraste de interferência diferencial e iluminação fluorescente. O núcleo magnocelular e o núcleo laminar podem ser reconhecidos dentro do corte do tronco encefálico.Sob iluminação fluorescente, ambas as estruturas revelam a expressão da proteína fluorescente amarela, confirmando a expressão espacial eficiente dos genes eletroporados. A expressão do gene eletroporado também pode ser observada em um corte do tronco encefálico compreendendo o núcleo magnocelular obtido de um frango no dia embrionário 18. Quando ampliado 80 vezes, os corpos celulares adendríticos clássicos são visíveis sob iluminação de contraste de interferência diferencial.Os corpos celulares adendríticos revelam a expressão da proteína fluorescente amarela, demonstrando ainda mais que a eletroporação in ovo pode induzir a expressão gênica em regiões específicas do tronco encefálico auditivo para estudos sobre o desenvolvimento de neurônios auditivos. Uma vez dominada e se realizada corretamente, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas para aproximadamente 12 ovos viáveis. Após este procedimento, outros métodos como ensaios funcionais bioquímicos, farmacológicos e in vitro-in vivo podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre como os fenótipos de expressão gênica regulam o desenvolvimento normal do tronco encefálico auditivo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como controlar espacial e temporalmente a expressão gênica no sistema auditivo cerebral do frango. A eletroporação in ovo permite o controle genético das especializações anatômicas e fisiológicas, bem como de períodos temporais bem definidos no desenvolvimento do sistema auditivo cerebral.

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Research

JoVE Journal

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