Luz Folha com base em microscopia de fluorescência de Vida ou fixados e corados Tribolium castaneum Os embriões

O objetivo geral deste protocolo é observar o desenvolvimento de embriões de Tribolium castaneum de forma não invasiva por longos períodos de tempo. A microscopia de fluorescência baseada em folha de luz ajuda a responder a questões relacionadas à morfogênese no organismo modelo de inseto emergente Tribolium castaneum, abordando os padrões de migração e proliferação celular desde o blastoderma inicial até o início do movimento muscular. A principal vantagem deste método é que os fatores críticos, como fotobranqueamento e fototoxicidade, são reduzidos ao mínimo, mesmo quando os embriões são observados por vários dias.

Para montar um embrião na câmara de amostra usando uma coluna de agarose, primeiro encha uma seringa de um milímetro com água destilada e use uma pequena mangueira de borracha para prender a seringa a um capilar de vidro. Encha o capilar até a metade com água destilada, use um pincel para transferir um embrião para o lado interno da abertura capilar de vidro e cole o capilar na agarose líquida, puxando lentamente alguns microlitros da agarose junto com o embrião para o capilar. Quando o embrião está no lugar, deve haver alguns microlitros de agarose acima e abaixo do embrião.

Quando a agarose se solidificar, encurte o capilar para um comprimento de cerca de cinco milímetros. O fragmento restante deve ser completamente preenchido com agarose e o embrião deve ser encontrado dentro do segundo quartil. Em seguida, insira o cilindro de aço com o pino na câmara de amostra e cole o fragmento capilar no topo do pino, a coluna de agarose deve se projetar alguns milímetros da região do fragmento capilar que contém o embrião.

Para montar o embrião na câmara de amostra usando um hemisfério de agarose, primeiro coloque 200 microlitros de agarose líquida em uma seringa de um milímetro e use a seringa para encher o tubo de aço com a câmara de amostra com agarose da parte superior do tubo até que um hemisfério se forme na abertura inferior. Quando a agarose estiver solidificada, pegue um embrião com a ponta de um pincel e reorganize o embrião para que a extremidade anterior se torne acessível. Mergulhe o hemisfério de agarose em agarose líquida para cobrir o hemisfério com uma película fina e coloque o embrião com sua extremidade anterior na vertical no pólo do hemisfério de agarose.

Gire o tubo de aço e use a escova para corrigir a posição do embrião conforme necessário. Idealmente, menos da metade da superfície do embrião deve ser coberta por agarose e os flancos devem ser o mais íngremes possível. Muita agarose na superfície do embrião leva a uma constrição mecânica e a uma redução da troca de gases e íons, o que tem um efeito dramático na taxa de sobrevivência do embrião.

Em seguida, insira lentamente o tubo de aço na câmara de amostra. Para montar o embrião na câmara de amostra usando um suporte de teia de aranha, primeiro selecione um embrião com o pincel e coloque o pincel de lado. Em seguida, cubra o orifício do suporte da teia de aranha com cinco a oito microlitros de agarose líquida e, em seguida, remova a maior parte da agarose até que reste apenas uma fina película de agarose.

Coloque o embrião no filme de agarose e ajuste sua posição com cuidado, movendo o embrião para o centro do eixo x do orifício com fenda e alinhando seu eixo anterior e posterior alongado com o eixo alongado do orifício com fenda. Certifique-se de colocar o embrião no filme de agarose dentro de 10 a 15 segundos após sua aplicação, ou seja, enquanto a agarose ainda estiver líquida ou não se fixará corretamente. Em seguida, insira lentamente o suporte da teia de aranha na câmara de amostras, posicionando o suporte de forma que não interfira na excitação e na emissão de luz.

Para ensaios de imagem ao vivo, primeiro configure o lapso de tempo e, em seguida, no modo de luz de transmissão, posicione o embrião ao longo dos eixos X e Y no centro do campo de visão sem expor o embrião ao laser. Gire o embrião 360 graus em passos de 90 graus para examinar o tecido em busca de qualquer dano que possa ter ocorrido durante o processo de montagem. No modo de florescência, defina o Z-Stack para cada direção, adicionando um tampão espacial de 25 a 50 micrômetros na frente e atrás do embrião e defina o espaçamento Z.

Para imagens de longo prazo, certifique-se de que a câmara de amostra esteja cheia com tampão de imagem suficiente e cubra a abertura da câmara de amostra. Em seguida, inicie o processo de imagem, monitorando a aquisição correta ao longo de todas as direções em todos os canais para todos os embriões. No final do período de imagem, remova o suporte da amostra da câmara de amostra e transfira o embrião para uma lâmina de objeto.

Se uma coluna de agarose foi usada, use uma lâmina afiada para extrair os embriões da agarose circundante. Se um hemisfério de agarose foi usado, transfira o hemisfério com um lado plano para a lâmina do objeto. Para o método do suporte de teia de aranha, use um pincel para desmontar suavemente o embrião do filme de agarose.

Em seguida, incube a lâmina do objeto carregado com embriões em um pequeno prato de vidro em uma atmosfera de umidade saturada sob condições padrão até que as larvas eclodam. Para processar os dados do embrião observado, abra os arquivos de interesse no software de análise de imagem apropriado e gire os Z-Stacks para alinhar o eixo anterior posterior do embrião com o eixo Y, conforme necessário. Corte as Z-Stacks ao longo dos eixos X e Y para que apenas um fundo mínimo permaneça e, em seguida, calcule a projeção máxima Z para cada Z-Stack.

Em seguida, dependendo da linha transgênica e das modalidades de imagem, faça os ajustes de intensidade dinâmica apropriados das pilhas de tempo para corrigir qualquer fotobranqueamento ou flora para flutuações de expressão, conforme necessário. Usando uma linhagem transgênica que expressa uma proteína de fusão histona 2B M-Emerald sob o controle do promotor alfa-tubublina um, 66 horas de desenvolvimento embrionário à temperatura ambiente foram registradas desde a retração da banda germinativa até o fechamento dorsal. Esta linha de armadilha intensificadora pode ser usada para visualizar aglomerados neuronais dentro dos apêndices da cabeça e a dinâmica da migração da cirrosa durante o fechamento dorsal.

Imageando uma linha transgênica semelhante que carrega o mesmo transgene, mas em um local genômico diferente, as seções ópticas da transição da gastrulação para o alongamento da banda germinativa mostram o arranjo celular interno da banda germinativa emergente. Usando a linha transgênica glia-blue, a aquisição de Z-Stacks ao longo de várias direções por meio da rotação da amostra permite a observação da reorganização das células gliais ao longo e ao redor do cordão nervoso ventral, bem como sua dinâmica de proliferação do lado dorsal dos lóbulos da cabeça no mesmo embrião. Pequenos corantes fluorescentes também podem ser usados para a marcação específica de estruturas intercelulares para destacar certas características embrionárias, como a cirrose gar, as células de cirrose ventral posterior ou a tricamada de tecido da banda germinativa do âmnio da serosa que emerge durante o fechamento da janela da serosa.

A coloração de corante fluorescente de duas cores permite a visualização adicional de duas estruturas intercelulares no mesmo embrião. Por exemplo, o citoesqueleto de actina e o envelope nuclear. Uma vez terminada a gravação, é importante para o controle de qualidade do experimento recuperar os embriões e criá-los em adultos férteis saudáveis.

Este procedimento pode ser combinado com outras técnicas, como a diferença de RNA parental, para analisar fenótipos derrubados.