Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

O objetivo geral deste procedimento é detectar populações putativas de células-tronco cancerígenas em amostras biológicas com base na capacidade de extrusão de corante das células da população lateral. Este método aborda uma questão fundamental na pesquisa de células-tronco cancerígenas sobre meios confiáveis para detecção e purificação de células-tronco cancerígenas a partir de amostras biológicas. A principal vantagem desta técnica é que utiliza marcadores funcionais e, portanto, oferece melhor resolução.

Além disso, a expressão desses transportadores de fármacos ABC é altamente conservada entre as células-tronco cancerígenas e, portanto, podemos utilizar esta técnica para diversas entidades cancerígenas diferentes. As implicações desta técnica estendem-se à descoberta de terapêuticas contra células-tronco cancerígenas, pois facilita análises downstream, como o perfil de expressão gênica e a validação de alvos, em células cancerígenas altamente purificadas. Assim, este método pode fornecer informações sobre as características das células-tronco cancerígenas.

Também podemos usar este método para caracterizar sistemas compostos por populações que expressam transportadores de medicamentos do tipo ABC, como a medula óssea. A demonstração do procedimento será feita por Elisabeth Hoflehner, técnica do meu laboratório. Para começar, cultive a linhagem celular de câncer humano desejada a 37 graus Celsius em 10 a 30 mililitros de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 2 milimolar de L-glutamina e antibióticos.

Quando as células atingirem aproximadamente 70 a 90% de confluência, remova o meio e adicione dois mililitros de tripsina-EDTA 0,05% para destacar as células da superfície da placa de cultura. Em seguida, lave as células com 10 mililitros de meio de cultura, transfira a suspensão para um tubo limpo de 15 mililitros e centrifugue a 250 × g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a formação do pellet celular, descarte o sobrenadante e reconstitua o pellet em um mililitro de meio de cultura.

Misture uma pequena alíquota da suspensão celular com solução de azul de tripano e conte as células utilizando um hemocitômetro. Para preparar as amostras de teste, suspenda as células em meio de cultura fresco para obter uma suspensão celular de um vezes dez à sexta potência de células por mililitro. Após ajustar a densidade celular, transfira três mililitros da amostra para um tubo cônico de 15 mililitros identificado como teste.

Em seguida, adicione 10 micromolar de corante violeta à amostra e vórtex suavemente a suspensão. Depois, prepare controles de inibição transferindo 500 microlitros da suspensão celular contendo o corante para dois tubos de citometria de fluxo identificados como controle. Adicione 50 micromolar de Verapamil ao primeiro.

E 20 micromolares de Fumitremorgin C ao segundo tubo. E misture as soluções pipetando suavemente. Tampe todos os tubos e incube-os a 37 graus celsius no escuro durante 90 minutos.

Agite suavemente as amostras a cada 15 minutos. Após a conclusão da coloração, lave os controles de inibição com três a quatro mililitros de PBS gelado. E prepare alíquotas da amostra-teste para posterior coloração dupla com anticorpos.

Lave também essas alíquotas e filtre todas as amostras através de peneiras com corte de 70 microns para remover agregados celulares potenciais. Em seguida, centrifugue as suspensões a 250 × g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Após a ressuspensão do pellet resultante em 100 µL de PBS, mantenha as células em gelo, protegidas da luz.

Em seguida, adicione um painel apropriado de anticorpos conjugados a fluorocromos às células previamente coradas com corante violeta. Vortexe as suspensões e incube-as a quatro graus Celsius, no escuro, por 20 a 30 minutos. Após a incubação, lave as células com três a quatro mililitros de PBS gelado, filtre a amostra se desejado.

Em seguida, centrifugue a 250 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em pellet em 100 microlitros de PBS. Por fim, adicione 7-AAD às células previamente coradas com corante violeta.

E incube as amostras por cinco a 10 minutos no escuro. Para analisar as células utilizando o citômetro de fluxo, selecione uma população celular apropriada em um gráfico de dispersão FSC SSC. Em seguida, utilizando diferentes sinais de FSC, exclua da população selecionada todos os agregados celulares.

Exclua as células que apresentam coloração positiva para 7-AAD para obter a população de células viáveis. Para criar um gráfico de dispersão para a emissão dos corantes azul e vermelho, exiba o canal fluorescente azul no eixo y e o canal fluorescente vermelho no eixo x. Altere ambos os canais para o modo linear e ajuste a tensão do detector adequadamente para que a população lateral esteja localizada na parte inferior esquerda do gráfico.

Em seguida, selecione a população lateral. E interrompa a aquisição. Depois, carregue os controles de inibição e adquira os dados.

Por fim, crie um gráfico de pontos exibindo a fluorescência vermelha do corante violeta no eixo x e um canal de fluorescência apropriado no eixo y plotado em modo logarítmico. Carregue a amostra, ajuste as tensões dos detectores conforme necessário e identifique a fração de células da população lateral que expressam a superfície investigada. Em seguida, registre os dados.

Apresentam-se aqui resultados representativos da análise da população lateral realizada em células de câncer de ovário humano. A população lateral distinguida pela análise da emissão azul e vermelho-violeta foi identificada no quadrante inferior esquerdo do gráfico de dispersão e constituiu 0,70% da população total analisada. O uso posterior de inibidores de efluxo resultou no desaparecimento do sinal de fluorescência observado nas células previamente identificadas, confirmando seu fenótipo de população lateral.

Por fim, as células ovarianas humanas também foram caracterizadas quanto à expressão de ABCG2. A coloração positiva para ABCG2 foi observada em 0,67% das células, correspondendo à população lateral identificada. Uma vez dominado, este procedimento pode ser realizado em aproximadamente duas a três horas, se executado corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o fenótipo de população lateral depende estritamente de uma relação ideal entre a concentração do corante e a densidade celular. A hidratação dessas duas variáveis é, portanto, altamente recomendada antes do experimento. Após este procedimento, outros métodos, como o perfilhamento da expressão gênica, podem ser realizados para caracterizar ainda mais as células da população lateral e, assim, identificar novos alvos específicos de células-tronco cancerígenas para o desenvolvimento futuro de fármacos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área da biologia de células-tronco explorarem as características de células-tronco de tecidos e células-tronco cancerígenas, tanto em camundongos quanto em humanos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise de população lateral induzida por corante violeta e de como detectar células-tronco cancerígenas putativas em amostras biológicas no seu próprio laboratório. Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas pode ser extremamente perigoso e de que precauções, como o uso de EPIs e cabines de segurança biológica, devem ser tomadas ao realizar este procedimento.