Name: Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a quantificar a co-localização de LC3, p62 e LAMP1 usando citometria de fluxo de imagem multiespectral em células Jurkat. Este método oferece análise objetiva e estatisticamente robusta do fluxo autofágico.

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Gostaria de agradecer meus colegas de trabalho da MilliporeSigma, Philip J. Morrissey e Sherree L. Friend, pelo apoio e orientação ao longo dos anos. Gostaria também de agradecer a Vidya Venkatachalam e Bryan R. Davidson por sua ajuda com o recurso BDC3 no software IDEAS , Ryan P. Jessup por ajudar a editar este manuscrito, Raymond Kong para ajudar no dia do tiro, e um agradecimento especial Para a artista de maquiagem Cynthia Xamonthiene.

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Eu sou empregado por MilliporeSigma, o criador da marca Amnis ImageStream, que foi usado neste estudo.

Ao realizar essa análise, há algumas coisas a considerar. É importante ter amostras de controle apropriadas. Para esta experiência, foram utilizados dois controles diferentes: Controle e Controle + Cloroquina. A amostra de controle foi usada para definir o limite para as regiões. Representa o nível basal de autofagia sem interromper a degradação lisossômica e é o controle da amostra Amimada. No entanto, a amostra de Controle não é um controle apropriado para comparar com os resultados da Amostra de Fome e Chloroquina porque a cloroquina em si influencia a amostra de controle. Portanto, era necessário ter uma amostra de Controle + Cloroquina. Antes de realizar qualquer análise para autofagia, é importante analisar / colocar em células únicas que estão em foco ( ou seja, RMS de gradiente superior a 60), pois os resultados podem ser afetados se houver mais de uma célula ou as imagens forem fora de foco. É crucial que a autofagosomEs e os lisosomas estão em foco para contagem adequada de pontos e análise BDC3. As células apoptóticas devem ser removidas antes da análise de autofagia, uma vez que podem diminuir os resultados e não devem ser incluídas. Deve haver manchas apropriadas para os três marcadores ( ie, LC3, p62 e LAMP1). Por exemplo, os três marcadores são intracelulares e devem ter um sinal pontual; Se o sinal não for pontual, ou se estiver na superfície da célula, a coloração não seria apropriada e a experiência / coloração deve ser refeita. Além disso, para BDC3 ser preciso, é essencial para o portão em células que são brilhantes para os três marcadores fluorescentes de interesse. É necessário ativar eventos positivos para evitar a medição de BDC3 em elementos não vinculativos, artefatos de imagem e / ou ruído. Isso é crucial, pois o BDC3 pode potencialmente amplificar os artefatos que não são sinais verdadeiros. Uma vez que BDC3 só pode ser realizado em eventos positivos brilhantes, muitas células podem não ser incluídas na análise final; Isto é especRealmente é verdade para células de controle que não possuem acumulação de LC3, p62 e / ou LAMP1. Assim, uma limitação deste ensaio é que BDC3 apenas examina as células que são positivas para os três marcadores, o que pode não ser apropriado para todas as experiências de autofagia. Como o BDS, que foi relatado anteriormente 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , o BDC3 sozinho não leva em consideração o número de organelas autofágicas que co-localizam, resultando em grande medida De variabilidade no número de autofagosomas. Portanto, a abordagem bivariada apresentada por Rajan et al. estava empregado. Olhando para as parcelas bivariadas, pode-se perguntar seAs células devem ser positivas para LC3, p62 e LAMP1; Por que existem tantas células que têm 0 pontos? Isso ocorre porque o sinal LC3 pode ser suficientemente brilhante para co-localização, mas pode não atingir o limite definido pela máscara de pico (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) necessário para que seja considerado um local. O protocolo apresentado aqui usou o MIFC para contar LC3 puncta e a co-localização de três marcadores de autofagia para medir o fluxo autofágico. Em condições basais (amostra de controle), o número de autofagosomas foi baixo e poucas células foram encontradas com &quot;Pontos altos&quot;. Com a adição de cloroquina, que inibe a fusão de autofagosoma / lisossoma, houve um aumento no número de manchas de LC3. Uma vez que o lisossoma é incapaz de quebrar o autofagosoma e o p62, que reside no autofagosoma, isso leva a um aumento na co-localização do acúmulo de autolossomosoma LC3, p62 e LAMP1. Este efeito foi amplificado sob Starvat nutrienteIon, que induz a autofagia. No entanto, sem a adição de cloroquina, não houve um aumento significativo no número de autofagosomas, provavelmente devido ao aumento da taxa de rotação autofágica. Quando as células ficaram famintas na presença de cloroquina, houve aumento na co-localização e no número de autofagosomas, o que suporta a conclusão de que a fome aumenta o fluxo autofágico. EBSS é conhecido por ser um poderoso indutor de autofagia. Portanto, espera-se que o aumento seja grande. Se outro método, como indução de fármaco, for utilizado para induzir autofagia, a diferença entre o controle e as amostras tratadas pode ser mais sutil. Este protocolo particular foi projetado para medir a autofagia em linhas celulares humanas, mas o ensaio poderia ser adaptado a outras espécies ao mudar para anticorpos para essa espécie particular. Além disso, o método de análise pode ser usado para qualquer aplicação intracelular que exija a co-localizaçãoDe três sondas / marcadores.

Macroautophagy, a seguir denominada autofagia, é uma via catabólica em que componentes danificados ou disfuncionais, proteínas de longa vida e organelas são degradados através do lisossoma e são reciclados 1 . Autofagia é um processo dinâmico, de múltiplos passos, que envolve a formação de um autofagaço; A fusão do autofagosoma com o lisossoma, formando o autolisômio; E a degradação dos conteúdos do autolossossoma 2 . O marcador biológico crucial usado para identificar a autofagia em sistemas de mamíferos é a proteína leve 1A / 1B-cadeia leve 3 (LC3) associada aos microtúbulos, que compõe a membrana autofagosomática. Durante a autofagia, o LC3-1 citosólico é conjugado com fosfatidiletanolamina para formar LC3-II; O LC3-II é então incorporado na membrana autofagosomal 3 . Outro marcador amplamente utilizado para o fluxo autofágico é o receptor de autofagia sequestração 1 (SQSTM1, p62) que fisicamente liCarga autofágica nata para a membrana autofágica 4 , 5 . Métodos tradicionalmente utilizados para medir a autofagia são manchas de Western e microscopia de fluorescência 7 . No entanto, nenhum desses métodos é considerado o &quot;padrão-ouro&quot; , 2 , 6 , pois há desafios associados a ambas as técnicas. Western blots apenas dá uma média porque eles usam uma amostra de homogeneizado, de modo que os observadores não podem ver o que está acontecendo em células individuais. Por outro lado, a microscopia de fluorescência dá uma informação de observador no nível de célula única, mas carece de capacidades de produção, dificultando a obtenção de avaliações objetivas e estatisticamente rigorosas. Nos últimos anos, a medição de LC3 e p62 por citometria de fluxo de imagem multiespectral (MIFC, veja a Tabela de Materiais ) vem ganhando popuLaridade devido ao seu poder quantitativo, capacidades de alto rendimento, potencial de multiplexação e capacidade de imagem de cada célula. Um dos métodos mais utilizados para medir autofagia usando MIFC, juntamente com o seu software de análise complementar (ver Tabela de Materiais ), é através da contagem local de LC3 puncta ou autofagosomas 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . No entanto, um aumento nos autofagosomas não significa necessariamente que haja um aumento na autofagia, pois também pode representar um bloqueio no processo 2 . O turnover LC3-II é um parâmetro útil para medir o fluxo autofágico através da análise de células na presença eAusência de um inibidor de degradação lisossômica, como a cloroquina. A cloroquina inibe a fusão do autofagosoma ao lisossoma, permitindo assim a quantificação da formação dos autofagosomas como medida do grau de autofagação ao suspender o fluxo autofágico antes da degradação lisossômica 18 . Além disso, p62 é degradado principalmente por autofagia, e se a degradação lisossômica do autofagosoma e seu conteúdo é bloqueada, espera-se uma acumulação de p62 17 , 19 . Autophagy é um processo de vários passos, e a medida de LC3 ou p62 sozinho não fornece uma imagem completa do que está acontecendo nas células. Publicações recentes enfatizaram a necessidade de examinar a formação simultânea do autolossossoma 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC éApenas capaz de medir a formação do autolossossoma por imagem da co-localização do autofagosoma ao lisossoma 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . Além disso, a co-localização de p62 e LC3 usando MIFC também foi explorada para medir o fluxo autofágico 5 . No software de análise referenciado, o &quot;recurso&quot; que mede a co-localização é chamado de &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) e foi especificamente projetado para comparar os detalhes da imagem pequena e brilhante de duas imagens. BDS é o coeficiente de correlação de Pearson transformado em log de pontos brilhantes localizados com um raio de 3 pixels ou menos; Em outras palavras, o BDS calcula o grau de oVerlapping pixels a partir de dois canais fluorescentes diferentes. Os pontos brilhantes estão correlacionados ( ou seja, a mesma localização espacial) ou não correlacionados ( ou seja, diferentes locais espaciais). Portanto, o coeficiente de correlação varia entre 0 (não correlacionado) e 1 (correlação perfeita). O coeficiente é log-transformado para aumentar o intervalo entre zero e infinito 26 , 27 . BDS sozinho pode não ser suficiente; Rajan et al. Descobriu que usar apenas BDS poderia levar a resultados falsos positivos ou falso-negativo 21 . BDS avalia a co-localização de dois marcadores de autofagia, mas não considera o número de autofagosomas. Para explicar o número de autofagosomas, Rajan et al. Incluiu a contagem local da LC3 puncta 21 . Rajan et al. Proposto usando um gráfico de dispersão bivariada da contagem de pontos LC3 versus BDS. Usando essa trama bivariada, duas populaçõesPrimeiro identificado: um com células com um alto nível de manchas de LC3 e uma com células com baixo nível de manchas de LC3. A população de pontos LC3 foi classificada em duas populações: células com baixa co-localização ( ou seja, acumulação de autofagosomas) e células com alta co-localização ( ou seja, acumulação de autolossossomos). Este gráfico bivariado permite distinguir entre células com muito poucos autofagosomas e células com acumulação de autofagosomas e / ou autolisossomas 21 . Até agora, a co-localização simultânea de LC3, p62 e LAMP1 (marcador lisossômico) não era possível usando um único &quot;Tipo de recurso&quot; no software de análise complementar MIFC (veja a Tabela de Materiais ). No entanto, um novo recurso, recentemente introduzido na versão 6.1, é chamado Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compara as imagens de detalhes brilhantes de cada uma das três imagens (neste caso, LC3, p62 e LAMP1) e quantifica a co-localização das três sondas ( ie, LC3, p62 e LAMP1). O recurso BDC3 calcula o coeficiente de correlação de Pearson modificado para se estender a três imagens. Como os pontos brilhantes nas três imagens estão correlacionados ou não correlacionados, o coeficiente de correlação varia entre 0 (não correlacionado) e 1 (correlação perfeita). O coeficiente é log-transformado para aumentar o intervalo dinâmico entre 0 e infinito. Ao mudar o recurso BDS com o recurso BDC3, o método de análise apresentado por Rajan et al. Agora pode incorporar os três marcadores mais utilizados para medir autofagia em um sistema ao mesmo tempo. A capacidade de co-localizar esses três marcadores de autofagia em um único ensaio pode levar a novos insights sobre a indução e regulação da autofagia. O protocolo a seguir descreve os passos para induzir autofagia em células Jurkat; Rotular as células com anticorpos LC3, p62 e LAMP1; Adquirir dados em um multispCitometro de fluxo de imagem ectral; E analise os dados para avaliar o fluxo autofágico.

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 rotulado como Anti-Rato de burro - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Anticorpo secundário anti-rato IgG (H + L) de burro, Alexa Fluor 647. Confirmação 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>anti-CD107a-PE humano (LAMP1)</td><td>BioLegend</td><td>328607</td><td>Clone H4A3. Concentração 400 &micro; g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>anti-CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>anti-humano CD45- PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>Clone HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>anti-humano CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>Clone HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Humano) clone mAb 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>Clone 4E+12.&nbsp; Concentração 2 mg/mL.&nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 anticorpo [EPR4844] - Marcador de Autofagossomo (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>Clone EPR4844.&nbsp; Concentração 0,5 mg/mL.&nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>Sal de Difosfato de Cloroquina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Encha o recipiente com 200 mL de Cleanser.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI Stain 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Encha o recipiente com 200 mL de Debubbler.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ Grátis&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ Grátis&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de Sal Balanceada Earle's 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído, 10%, sem metanol, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>Isto é o que é usado para a formalina a 4% e 1%. CUIDADO: Formalina/Formaldeído tóxico por inalação e se ingerido.&nbsp; Irritante para os olhos, sistemas respiratórios e pele.&nbsp; Pode causar sensibilização por inalação ou contato com a pele. Risco de danos graves aos olhos.&nbsp; Risco potencial de câncer.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Hanks' Solução de Sal Balanceada 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais MEM 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Foi utilizada uma ImageStreamX Mark II de 2 câmaras equipada com os lasers de 405nm, 488nm e 642nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>software de análise MIFC - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>O software complementar ao MIFC (ImageStreamX MKII).&nbsp; Software IDEAS versão 6.2</td></tr><tr><td>MIFC - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>Este é o software que executa o MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE versão 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-humano CD107a (LAMP-1) Anticorpo clone H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>Solução de penicllin/estreptomicina/glutamina 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>Enxágue - Água ultrapura ou água deionizada</td><td>NA NA</td><td></td><td>Você pode usar qualquer água ultrapura ou água deionizada.&nbsp; Encha o recipiente com 900 mL de enxágue.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Médio 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Bainha - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>Este é o mesmo que o Phosphate Buffered Saline 1X da Dulbecco&nbsp; Ca++MG++ grátis.&nbsp; Encha o recipiente com 900 mL de bainha.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de polipropileno siliconizado</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Tubos de microcentrífuga de baixa retenção siliconizados Fisherbran 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>Solução de piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Esterilizador HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>- 0,4 - 0,7% Hipoclorito</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Este é asseguradamente 10% de alvejante Clorox que pode ser feito deluting o alvejante Clorox com água.&nbsp; Encha o recipiente com 200 mL de Sterilzer.</td></tr><tr><td>Reagente de Calibração do Sistema - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td>400041</td><td>Cada tubo comporta ~10 mL.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>Cantil T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, Detergente de GRAU PROTEICO, Solução a 10%, Filtrado Estéril</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td></tr><tr><td>Água, Grau de Cultura de Células&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliando o fluxo autofágico medindo lc3, p62 e lamp1 co-localization usando a citometria de fluxo de imagem multiespectral

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

A autofagia é uma via catabólica em que os componentes celulares normais ou disfuncionais que se acumulam durante o crescimento e a diferenciação são degradados através do lisossoma e são reciclados. Durante a autofagia, a proteína LC3 citoplasmática é lipidada e recrutada para as membranas autofagosomáticas. O autofagosoma, em seguida, se funde com o lisossoma para formar o autolisômio, onde ocorre a quebra da vesícula autofagosoma e seu conteúdo. A proteína p62 associada à ubiquitina, que se liga ao LC3, também é usada para monitorar o fluxo autofágico. As células submetidas a autofagia devem demonstrar a co-localização de p62, LC3 e marcadores lisossômicos. A microscopia de imunofluorescência tem sido utilizada para identificar visualmente LC3 puncta, p62 e / ou lisossomos por célula. No entanto, uma avaliação objetiva e estatisticamente rigorosa pode ser difícil de obter. Para superar esses problemas, a citometria de fluxo de imagem multiespectral foi utilizada juntamente com uma característica analítica que compara oImagens de cauda de três marcadores de autofagia (LC3, p62 e LAMP1 lisosomal) e quantifica sua co-localização, em combinação com a contagem de pontos LC3 para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Este método de análise utiliza múltiplos recursos para avaliar o fluxo autofágico. A fim de compreender completamente a parcela final bivariada, as características de análise individuais devem primeiro ser investigadas. A contagem de autofagosomas é uma maneira lógica de medir autofagia; No entanto, o tamanho / forma / brilho de LC3 puncta pode variar drasticamente entre as células. A variação pode dificultar a contagem de autofagosomas manualmente ou o uso de um recurso de contagem de pontos no software de análise. Portanto, nenhuma característica de contagem de pontos será perfeita devido a essa grande variabilidade nos autofagosomas. No entanto, um bom recurso de contagem de pontos funcionará na maioria das células 26 . A Figura 3 mostra exemplos de mascaramento em pontos de LC3 puncta em células Jurkat usando diferentes máscaras de pontos. O recurso de contagem de pontos selecionado para este conjunto de dados é Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, o que significa que o recurso de contagem de pontos contou os pontos que o peMáscara ak identificada dentro da máscara do canal 11 padrão (M11) no canal 11 (Ch11-LC3-AF647) com uma relação de fundo de ponto a célula de 4 (Bright, 4). A Figura 4 mostra histogramas de contagem de pontos e imagens representativas para a contagem média de pontos para as células Jurkat de Controle, Controle + Cloroquina, Abandonado e Amido ou Chloroquina, marcadas com anti-LC3-AF647. As contagens de pontos médios controlados e famintos não são significativamente diferentes; Com a adição de cloroquina, há uma grande diferença na média do Controle + Cloroquina em comparação com o Starved + Chloroquine. O próximo recurso a investigar é BDC3. BDC3 é uma medida da co-localização de três marcadores / sondas, neste caso, LC3, p62 e LAMP1. A Figura 5A - 5D mostra os histogramas BDC3 para as células Controk, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat marcadas com anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE e anti-LC3-AF647. Há uma mudança entre a média de Controle para a média de Starved, bem como o significado de Control + Chloroquine para a média de Starved + Chloroquine. No entanto, olhando para as imagens das células dos escores BDC3 médios na Figura 5E - 5H , há uma diferença maior entre as amostras do que os histogramas podem levar a acreditar. Isso ocorre porque o BDC3 não considera o número de organelas autofágicas que co-localizam, resultando em um grande grau de variabilidade no número de autofagosomas para o mesmo escore BDC3. Na maioria dos casos, existe uma sobreposição entre as três sondas porque, mesmo nos níveis basais, p62, LAMP1 e LC3 devem, até certo ponto, co-localizar ou residir em regiões similares nas células. Como contraste, um exemplo de três sondas que não devem co-localizar são anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 e tintura nuclear DAPI para a amostra Starved + Chloroquine, mostrada na Figura 6. &lt;/ P&gt; Quando o recurso de contagem de pontos e o recurso BDC3 são combinados, a presença de diferentes subpopulações que melhoram a capacidade de distinguir entre as várias amostras / condições são evidentes. A Figura 7 mostra o gráfico bivariado de contagem de pontos de LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para as quatro amostras: Controle, Controle + Cloroquina, Abdomina e Morto de Fome + Cloroquina. A amostra de controle foi usada para definir a estratégia de bloqueio para três populações: Pontos baixos, Pontos altos / BDC3 baixo e Pontos altos / Alto BDC3. As amostras de Controle demonstraram que mais de 98% das células tinham 1 ou menos manchas. O limite entre High Spots / Low BDC3 e High Spots / High BDC3 foi ajustado para um escore BDC3 de 1, porque mais de 91% da amostra Control teve um escore BDC3 inferior a 1. Um resumo dos resultados para as parcelas bivariadas É mostrado na Tabela 1 . Idade = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figura 1: Configuração do instrumento MIFC. Uma captura de tela das configurações do instrumento MIFC usadas para esta experiência, delineada na etapa 8 do protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figura 2: Estratégia de Gating de Software de Análise. Uma captura de tela do esquema de controle de software de análise, delineada no passo 9 do protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Mascaramento de pontos LC3. Imagens e máscaras de células Jurkat usadas para criar o recurso de contagem de pontos. Mostra-se BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) e Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). A máscara que funcionou melhor para todas as células mostradas foi Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figura 4: Histogramas de contagem de pontos LC3. Usando o recurso de contagem local Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 e os histogramas de contagem de pontos LC3-AF647 para Controle ( A , azul claro), Controle + CloroquinoE ( B , azul), faminto ( C , rosa) e Starved + Cloroquina ( D , vermelho). O ponto médio conta para Controle, Controle + Cloroquina, Fome e Fome + Cloroquina são 0,07, 1,13, 0,10 e 2,77, respectivamente. BF, LC3-AF647 (vermelho), tintura nuclear DAPI (azul) e um composto das imagens LC3-AF647 e DAPI de células representativas para a contagem média de pontos são mostrados para Controle ( E , 0 pontos), Controle + Cloroquina ( F , 1 ponto), faminto ( G , 0 pontos) e Starved + Chloroquine ( H , 3 pontos). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figura 5: Histogramas BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. Histogramas BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 paraControle ( A , azul claro), Controle + Cloroquina ( B , azul), Abatido ( C , rosa), e Fome + Cloroquina ( D , vermelho). O escore BDC3 médio para Controle, Controle + Cloroquina, Fome e Fome + Cloroquina é 0,57, 0,82, 0,74 e 0,98, respectivamente. BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (amarelo); LC3-AF647 (vermelho); E um composto das imagens p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 de células representativas para o BDC3 médio são mostrados para Controle ( E ), Controle + Cloroquina ( F ), Starved ( G ) e Starved + Cloroquina ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figura 6: Histogramas BDC3 de p62 / LC3 / DAPI para Amostragem + Chloroquina Amostra. ( A ) O histograma BDC3 p62 / LC3 / DAPI para a amostra Starved + Chloroquine é mostrado. O resultado médio do BDC3 é de 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LC3-AF647 (vermelho); DAPI (azul); E um composto das imagens p62-AF488, LC3-AF647 e DAPI de células representativas para o BDC3 médio é mostrado para a amostra Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figura 7: Gráficos Bivariados de LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parcelas bivariadas da contagem de pontos LC3 versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para células ControK, Control + Chloroquine, Starved e Starved + Chloroquine Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1-PE (amarelo); LC3-AF647 (vermelho); E um composto das imagens p62-AF488, LAMP1-PE e LC3-AF647 de três regiões (por exemplo , Pontos baixos, Pontos altos / BDC3 baixo e Pontos altos / Alto BDC3) são mostrados para a amostra Starved + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Contagem de células </td><td> Colocalização brilhante de detalhes 3 significa </td><td> Contagem de pontos LC3 Mean </td><td> % Low Spot </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Ao controle </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Controle + Cloroquina </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19,5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Morrendo de fome </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0,10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Abatido + Cloroquina </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Resumo do Jurkat LC3 Spot Count versus BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariada Trama

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

O objetivo geral deste experimento é quantificar a colocalização de três marcadores de autofagia em conjunto com a quantificação de pontos LC3, para a medição da autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta. Este método permite que a colocalização de três marcadores de autofagia seja medida em um único ensaio, potencialmente levando a novas descobertas sobre a indução e regulação da autofagia. A principal vantagem desta técnica é que três marcadores de autofagia podem ser medidos simultaneamente de maneira objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.Inicie adicionando duas vezes 10 à sexta células Jurkat em tubos individuais de centrífuga de 15 mililitros rotulados com os nomes apropriados das amostras. Em seguida, adicione quantidade suficiente de tampão de lavagem a cada tubo para elevar o volume final de cada amostra até 15 mililitros e centrifugue para obter o pellet das amostras. Re-suspenda os pellets em 100 microlitros de formalina 4%, depois transfira as amostras para tubos de microcentrífuga de polipropileno silanizados e rotulados.Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave as amostras em um mililitro de tampão de lavagem fresco. Re-suspenda os pellets em 100 microlitros do primeiro anticorpo de interesse em tampão de permeabilização para uma incubação de 30 minutos no escuro, em temperatura ambiente, protegidos da luz. Lave as células marcadas e permeabilizadas em um mililitro de tampão de permeabilização fresco e marque-as com o próximo anticorpo de interesse, conforme acabou de ser demonstrado.Após todas as amostras terem sido marcadas com o anticorpo final, re-suspenda os pellets em solução de formalina a 1%, seguido pela adição de 10 microlitros de corante nuclear DAPI 10x. Misture as células com vortex leve, depois incube as amostras por 10 minutos à temperatura ambiente, protegidas da luz. Ao final da incubação, carregue o modelo padrão no citômetro de fluxo de imagem multiespectral e selecione os lasers apropriados.Digite a potência desejada do laser na janela ao lado de cada botão de laser, depois clique no botão carregar para colocar o tubo de 1,5 mililitro no instrumento. Crie um gráfico de dispersão de área M01 versus razão de aspecto M01 para toda a população e desenhe uma região ao redor das células. Nomeie esta região como Célula.Defina os parâmetros de aquisição. Especifique a pasta de destino e o nome do arquivo e altere o número de eventos para 5.000; em seguida, selecione a população celular e clique em adquirir para obter o arquivo e executar o restante das amostras conforme demonstrado, mantendo as mesmas configurações de laser. Após coletar o arquivo, clique em retornar para recuperar o tubo da amostra.Para analisar os dados de citometria de fluxo com imagem multiespectral, clique em iniciar análise para executar o assistente de abertura de arquivo no software de análise de imagem, depois clique no ícone do assistente de apoptose e no botão selecionar assistente para abrir o assistente de apoptose. Após todas as células apoptóticas terem sido removidas da análise, crie uma região ao redor das células não apoptóticas e rotule esta população como células. Em seguida, clique no ícone de blocos de construção.Selecione as fluorescências positivas em uma cor e selecione a população de células e a intensidade no canal MC três. Rotule o eixo X como intensidade da lâmpada um e desenhe uma região que inclua as células com intensidades maiores que 10.000. Rotule esta região como lâmpada um positiva.Após selecionar as células positivas para P62 e LC3 da mesma maneira, clique na guia análise e selecione máscara. Clique em novo e depois em função. Em função, selecione pico.Na máscara, selecione M11. No canal, selecione o canal 11. Defina a proporção entre ponto e fundo celular como quatro.Em seguida, clique em OK para fechar a janela da função de máscara definida e depois em OK para adicionar a máscara à lista de máscaras. Clique em fechar para sair do gerenciador de máscaras, então clique novamente na guia análise e selecione características. Clique em novo.Em tipo de característica, selecione contagem de pontos e selecione a máscara de pico que foi criada. Insira LC3 contagem de pontos como nome e clique em ok. Clique em novo novamente.Em tipo de característica, selecione colocalização de detalhe brilhante três ou BDC3. Em máscara, selecione MC. Em imagem um, selecione canal dois para P62. Em imagem dois, selecione canal três para lamp1.Na imagem três, selecione o canal 11 para LC3. Digite BDC3p62/LAMP1/LC3 como nome e clique em OK e depois em fechar para sair do gerenciador de características. Clique no novo ícone de gráfico de dispersão e selecione a população positiva para LAMP1, positiva para p62 e positiva para LC3.Selecione BDC3/p62/LAMP1/LC3 para o eixo X e o recurso de contagem de pontos LC3 para o eixo Y e clique em ok. No menu arquivo, selecione salvar arquivo de análise de dados e clique em salvar e sim para salvar os dados de jejum mais cloroquina como um arquivo de análise de dados e para substituir a versão anterior do arquivo. Agora abra o arquivo de controle e selecione a matriz de compensação apropriada e o arquivo de análise de dados de jejum mais cloroquina como modelo.Clique em OK. Para criar regiões para o acúmulo de autofagossomos e o acúmulo de autofagolisossomos, abra a amostra controle e desenhe uma região retangular das coordenadas do eixo X de 0,1 a 3 e das coordenadas do eixo Y de 1,5 a 0,3. Nomeie esta região como pontos baixos.Em seguida, desenhe uma região das coordenadas 0,1 a um do eixo X e das coordenadas 17,5 a 1,5 do eixo Y e nomeie esta região como ponto alto, baixo BDC3; depois, desenhe uma região das coordenadas um a três do eixo X e das coordenadas 17,5 a 1,5 do eixo Y e nomeie esta região como pontos altos/alto BDC3. Salve o arquivo de controle para que possa ser usado como modelo, então abra os outros arquivos, incluindo o arquivo de células privadas mais cloroquina, utilizando o arquivo de controle como modelo, conforme demonstrado anteriormente. O tamanho, a forma e o brilho dos pontos LC3 podem variar drasticamente entre células, conforme observado nestas máscaras de pontos de agregados LC3 em células Jurkat utilizando diferentes máscaras de pontos.A máscara que funcionou melhor para este experimento foi a de pico, com uma razão entre ponto e fundo celular de quatro. Nestas contagens representativas de pontos em células Jurkat marcadas com anti-LC3, as médias de pontos nas condições controle e em jejum não diferem significativamente. Quando a cloroquina é adicionada, observa-se uma grande diferença entre a média do controle mais cloroquina e a média do jejum mais cloroquina.Neste experimento, houve uma mudança entre a média de colocalização do controle BDC3 e a média em condições de privação, bem como entre a média do controle com cloroquina e a média em privação com cloroquina. O BDC3 não considera o número de organoides de autofagia que colocalizam, resultando em um alto grau de variabilidade no número de autofagossomos para o mesmo valor de pontuação BDC3. De fato, na maioria dos casos há sobreposição entre as três sondas, pois mesmo nos níveis Beyza, p62, LAMP1 e LC3 devem, até certo ponto, colocalizar em regiões semelhantes das células.Como contraste, aqui há um exemplo da característica BDC3 em três sondas que não deveriam apresentar colocalização: P62, LC3 e DAPI. Quando a contagem de pontos e as características BDC3 são combinadas, torna-se evidente a presença das diferentes subpopulações que aprimoram a capacidade de distinguir entre as diversas amostras e condições.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em aproximadamente oito horas se realizada corretamente. No entanto, se for necessário um recurso diferente de contagem de pontos, será necessário tempo adicional de análise. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar os controles apropriados.Por exemplo, utilize a amostra controle para definir os limiares de intensidade de Beyza e a amostra controle mais cloroquina como controle para a amostra em jejum mais cloroquina. Este procedimento também pode ser usado para outras aplicações intracelulares que exijam a colocalização de três marcadores diferentes, bastando alterar para os anticorpos apropriados de interesse. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como rotular células com marcadores de autofagia, adquirir dados em um citômetro de fluxo com imagem multiespectral e analisar os dados para avaliar o fluxo autofágico.Não se esqueça de que trabalhar com formalina pode ser extremamente perigoso e que precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.

Análise Quantitativa de Autophagy usando microscopia de fluorescência avançada 3D

Microscopia de lapso de tempo de marcadores autofagia fluorescente etiquetado permite o monitoramento da resposta autofagia dinâmico com alta resolução temporal. Usando autofagia organela específica e marcadores numa combinação de três cores diferentes, pode-se seguir a contribuição de uma proteína para a formação autophagosome num contexto espacial e temporal robusta.

Imagens de células vivas dos primeiros autofagia Eventos: Omegasomes and Beyond

A autofagia ativa está associada à regeneração muscular produtiva, que é essencial para a ativação da célula tronco (MuSC). Aqui, fornecemos um protocolo para a detecção in situ de LC3, um marcador de autofagia em MuSCs MyoD-positivos de seções de tecido muscular de ratos controlados e feridos.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Nós descrevemos nosso protocolo para medir ritmos biológicos no catabolismo da proteína através do autofagia e do Proteassoma no fígado do rato.

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

A mitofagia é o principal mecanismo de controle de qualidade mitocondrial. No entanto, a avaliação da mitofagia in vivo é dificultada pela falta de ensaios quantitativos confiáveis. Apresenta-se aqui um protocolo para a observação da mitofagia em células vivas usando um corante de mitocôndrias verde-fluorescente per-celular e um corante lisossomático vermelho-fluorescente.

Visualizando a mitofagia com corantes fluorescentes para mitocôndrias e lisossomos

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.

FCM-IP: Imunoprecipitação Detectado por citometria de fluxo

Aprenda a quantificar a co-localização de LC3, p62 e LAMP1 usando citometria de fluxo de imagem multiespectral em células Jurkat. Este método oferece análise objetiva e estatisticamente robusta do fluxo autofágico.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

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