Name: Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do N 6 -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda ensaios de retardamento de gel de agarose para análise de interações proteína-RNA usando TcdA e tRNA(UUU). Este método rápido permite caracterizar complexos proteína-tRNA com pequenas quantidades de amostra.

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MCV é membro do programa Intramural CIB &quot;Molecular Machines for Better Life&quot; (MACBET). A pesquisa que conduziu a esses resultados recebeu financiamento do Instituto Espanhol de Saúde Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), o Ministério da Economia e Competitividade (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP para MCV) ), O Governo Regional de Madri (S2010 / BD-2316 a MCV) e o Projeto ComplexINC (Contrato n.º 279039 a MCV) da Comissão Européia (Programa-Quadro 7 (FP7)). Os financiadores não tiveram papel no design do estudo, na coleta e análise de dados, na decisão de publicação ou na elaboração do manuscrito.

Cuidado: consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Vários dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos e corrosivos. Use práticas adequadas ao realizar a extração de ARNt usando fenol, incluindo o uso de uma chaminé e equipamento de proteção pessoal (óculos de segurança, luvas, bata de laboratório, calças completas, sapatos fechados, etc. ). Este protocolo usa uma mancha de ácido nucleico não tóxico. O uso de manchas alternativas pode exigir precauções adicionais e disposição especializada do agente de coloração se for tóxico e / ou cancerígeno ( por exemplo , brometo de etidio). 1. Preparação do Gel de Agarose <ol><li> Pesar 2 g de agarose e adicioná-lo a uma garrafa de vidro para preparar um gel de agarose a 2% p / v. </li><li> Adicione 100 mL de tampão de transição de ácido tris-borato-etilenodiaminotetraacético (EDTA) (TBE) ao frasco contendo agarose. Derreta-se por aquecimento em um microondas. Com intervalos de 30 s, arraste o conteúdo para misturarBem e repita este passo até que a agarose esteja completamente dissolvida. Deixe a solução de agarose arrefecer até aproximadamente 50-60 ° C. </li><li> Tape as bordas abertas de uma bandeja de gel para criar um molde, coloque um pente apropriado para criar os poços e coloque a agarose fundida nele. Evite a formação de bolhas e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. </li><li> Uma vez solidificado, coloque a bandeja de gel em uma unidade de eletroforese e preenchê-lo com tampão TBE até o gel estar completamente coberto. </li></ol> 2. Preparação do ARNt <ol><li> Expresso tRNA (UUU) em E. coli <ol><li> Na parte da manhã, use um frasco de E. coli BL21 (DE3) congelado transformado com o vetor de expressão pET23d-EcUUU 2 (abriga o gene que codifica o tRNA de E. coli (UUU)), para criar um Luria Broth (LB) de baixo teor de sal, Placa suplementada com 100 μg / mL de ampicilina. Inverta a placa e coloque-a em uma incubadora de 37 ° até que as colônias apareçam (tarde da tardeOon). </li><li> Inocular uma colônia única bem cultivada em 5 mL de LB mais 100 μg / mL de ampicilina e crescer durante a noite a 220 rpm a 37 ° C. </li><li> Na manhã seguinte, elimine as células (6.500 xg por 10 minutos a 4 ° C), substitua o meio com 5 mL de LB fresco mais 100 μg / mL de ampicilina e ressuspenda. Use esta suspensão para inocular 200 ml de LB mais 100 μg / mL de ampicilina. Cresça durante 5 h a 220 rpm a 37 ° C. </li><li> Quando a densidade óptica da cultura a 590 nm (OD 590 ) atingiu 0,6 - 0,8, adicione 1 mM de IPTG à cultura para desencadear a expressão do gene tRNA (UUU). Incubar a 37 ° C durante 3 h. </li><li> Colher as células por centrifugação da cultura a 6.500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lise e extração <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 5 mL de tampão de lise (acetato de sódio 0,3 M, EDTA 10 mM). A partir deste ponto, usam buffers autoclavados e mantenham todas as amostras contendo tRNA a 4 ° C para evitar que tDegradação de ARN. </li><li> Adicione 1 volume de fenol ácido (pH 4,3) ao sedimento de células ressuspensas na exaustão. Misture durante 1 min por inversão para lisar as células e centrifugar a 10 000 xg (10 min, 4 ° C). </li><li> Recolher a fase aquosa superior que contém o tRNA solúvel (UUU) (e menores concentrações dos outros grupos de ARNt) usando uma pipeta com o cuidado de não aspirar a fase orgânica (inferior). Descarte a camada inferior e o grânulo, que consiste na fase orgânica e nos detritos celulares, num recipiente adequado. </li><li> Precipite o tRNA misturando completamente a fase solúvel (aquosa) com 2,5 volumes de etanol a 100% v / v por inversão durante 1 h a 4 ° C. Centrifugar a mistura a 15 000 xg (30 min, 4 ° C). </li><li> Decantar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento rico em ARNt em 4 mL de tampão de filtração em gel (fosfato de sódio 20 mM ou fosfato de potássio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM). Execute 5 μL do conjunto de ARNt ressuspenso em um gel de agarose a 2% p / v. NOTA:O ARNt de boa qualidade aparece como uma banda única (tamanho molecular entre 50-100 pb). </li></ol></li><li> Purificação do tRNA (UUU) <ol><li> Seguindo a prática cromatográfica padrão 12 , carregue o tRNA ressuspenso (UUU) em uma coluna de filtração de gel preparativa de alta resolução (dimensões: 16 x 600 mm, volume do leito: 120 mL, intervalo de resolução: 1.000-70.000 Da) previamente equilibrado em tampão de filtração em gel (na fase móvel). Defina o caudal para 1 mL / min para eluir as amostras. NOTA: O pico de ARNt (UUU) elui aproximadamente a 75,5 mL. Tipicamente, pode ser obtido um rendimento de 0,5-1,0 mg / L de tRNA de cultura. </li><li> Analisar as amostras em volumes de eluição representativos por eletroforese de 5 a 10 μL de cada amostra em um gel de agarose a 2% p / v. </li></ol></li></ol> 3. Preparação da amostra <ol><li> Expresse e purifique TcdA de acordo com López-Estepa et al . 2 . NOTA: Até 250 μMTcdA pode ser usado para o estudo. </li><li> Pipetar a quantidade correspondente de TcdA conforme a Tabela 1 em tubos de centrífuga de 1,5 mL devidamente rotulados. Adicionar 1,6 mM tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) (concentração final) e misture suavemente com uma pipeta. Feche a tampa e incube a mistura à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar 10 μM de adenosina trifosfato (ATP) e 50 mM de MgCl2 (concentrações finais). Misturar com uma pipeta e incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicione tRNA purificado (UUU) (seção 2.3) de acordo com a Tabela 1 , misture com uma pipeta e incube à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicione solução salina tamponada com fosfato (PBS) até 100 μL de volume final. Misturar adequadamente e adicionar glicerol até uma concentração final de 10% v / v. </li><li> Vortex a amostra e centrifugue brevemente o conteúdo do tubo (10 000 xg, 1 min, 4 ° C). </li></ol> 4. Desenvolvimento de carregamento de gel e eletroforese<ol><li> Coloque a unidade de eletroforese em uma bandeja cheia de gelo triturado para manter a câmara a 4 ° C durante a corrida de eletroforese. </li><li> Com cuidado, pipetar 5 μL de cada amostra no poço correspondente. Adicione um marcador de tamanho de DNA adequado. </li><li> Conecte os eletrodos nas ranhuras correspondentes da fonte de alimentação. Ligue a fonte de alimentação e ajuste a tensão para 100 V e execute o gel por 90 min. </li></ol> 5. Coloração de gel para observar a interação de proteína de ARNt <ol><li> Prepare a solução de coloração misturando 50 mL de TBE com 1x de uma mancha de DNA adequada. Evite expor a solução de coloração à luz solar cobrindo o recipiente de coloração com papel alumínio. NOTA: As manchas de DNA geralmente são armazenadas como ações concentradas de 10.000 ou 20.000x. </li><li> Após 90 min de eletroforese, retire cuidadosamente o gel da bandeja e coloque-o em um recipiente com solução de coloração. Coloque-o em um balancim a baixa velocidade de balanço na temperatura ambienteUre por 30 min. </li><li> Retire o gel de agarose do recipiente de coloração, aperte-o cuidadosamente em um pedaço de tecido de celulose ou papel de filtro para remover o excesso de líquido e coloque-o diretamente em um transiluminador. Ligue a luz UV para visualizar bandas contendo tRNA. Pegue uma fotografia do gel. </li><li> Coloração de proteínas (opcional). <ol><li> Descarte a solução de coloração de DNA de forma segura (de acordo com os procedimentos de segurança) e substitua-a por solução de 50 ml de Blue Brilliant Blue (CBB). Coloque a bandeja em um balancim à temperatura ambiente e coloque durante a noite (&gt; 12 h). Descarte a solução de coloração CBB e substitua-a por 50 mL de PBS para remover o excesso de corante. Destain durante 1 h em um rocker. </li></ol></li><li> Visualize os complexos de ARNt que contêm proteínas sob um transiluminador leve e tirar fotografias do gel para comparar com a imagem de ARN tRNA UV. </li></ol>

<ol><li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gel+retardation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li>
<li>López-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL%2FTcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB%2FE1+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606(2015).</li>
<li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li>
<li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li>
<li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase%2C+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li>
<li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li>
<li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein%3A+RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li>
<li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-filtration+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O teste de retardamento de gel de proteína-ARNt de agarose aqui descrito pode ser modificado de várias maneiras. Primeiro, a porcentagem de agarose no gel pode ser reduzida para permitir a separação e visualização de complexos proteína-ARNt significativamente maiores que os analisados ​​aqui (120 kDa). Em segundo lugar, se a proteína alvo for termolábil, devem ser tomadas precauções adicionais para garantir que a temperatura seja mantida abaixo da temperatura máxima aceitável, movendo o aparelho de eletroforese para uma...

<html> O teste de retardamento de gel 1 (também conhecido como ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, EMSA) é um método eletroforético projetado para estudar e caracterizar interações proteína-ácido nucleico. Ele permite a análise do DNA da proteína e das interações proteína-ARN e, em particular, as interações entre as proteínas de ligação de ARNt e ARNt, utilizando componentes purificados ou misturas complexas de proteínas ( por exemplo , lisados ​​celulares) ou ácidos nucleicos ( por exemplo , tRNA Piscinas). Nós aplicamos ensaios de retardamento de gel ao estudo da interação entre ARNt purificado (UUU) e TcdA, uma N6-teronilcarbamoiladenosina (t 6 A) desidratase, que cicliza a cadeia lateral de treonilcarbamoílo anexada a A37 no anel de tronco anticodon (ASL) De tRNAs para t 6 cíclico (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA também é conhecido como CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. O gene tcdA / csdL forma um cluster com os genes csdA e csdE 5 , que codificam a dessulfurase de cisteína e o aceitador de enxofre do sistema de desulfinato de cisteína sulfinase (CSD) e é necessário para manter a função TcdA in vivo 3 . O raciocínio por trás dos ensaios de retardamento de gel é que, enquanto as moléculas de ácido nucleico livres migram rapidamente para a frente da acrilamida ou géis de agarose em virtude da sua grande carga negativa, a mobilidade eletroforética de complexos de proteína dos mesmos ácidos nucleicos é dramaticamente reduzida. A redução da mobilidade é visualizada como uma &quot;mudança&quot; nos complexos de ácido nucleico-proteína, que se resolvem como bandas discretas. O complexo de ácido nucleico e proteína positivamente carregado e maior apresenta uma maior mudança ou redução na mobilidade em um gel. Uma vez que a neutralização da carga do complexo é um fenômeno universalPara os complexos proteína-ácido nucleico, o teste de retardamento do gel pode ser aplicado a uma ampla gama de complexos e tipos de ácidos nucleicos. O método é simples, barato e pode ser realizado em laboratórios com equipamentos mínimos. Requer apenas pequenas quantidades de proteínas e ARNt. Esta é uma vantagem em relação às técnicas biofísicas alternativas, que geralmente consomem maiores quantidades de amostra. O teste de retardamento de gel tem sido amplamente utilizado para o estudo de fatores de transcrição. O ensaio tem sido utilizado para analisar a cinética de ligação, a força e a especificidade dos fatores de transcrição para muitas seqüências de DNA diferentes. Foi nesse campo que a EMSA foi desenvolvida pela primeira vez 6 , 7 . Os ensaios de retardamento de gel com moléculas de ARN 8 , 9 , 10 , 11 e tRNA também foram utilizados na pesquisa de ribossomosE analisar, como fazemos aqui, as enzimas que modificam os nucleósidos de tRNA pós-transcrição. Muitos parâmetros diferentes afetam o resultado de um teste de retardamento de gel, como temperatura, qualidade da proteína e amostra de tRNA, e a força da ligação. O planejamento cuidadoso ea execução do experimento são cruciais para a interpretação dos resultados do ácido nucleico livre e das espécies ligadas a proteínas. Aqui, usamos o gene sintético que codifica tRNA (UUU) clonado em um vetor de expressão cujo promotor não possui o local de ligação do ribossoma Shine-Dalgarno, levando à síntese de grandes quantidades do tRNA 2 . Este protocolo detalhado destina-se a fornecer um guia claro para realizar experiências de retardamento de gel de ARNt, evitando erros comuns.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen contém T7 polimerase após indução de IPTG.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confere resistência à ampicilina; T7.</td></tr><tr><td>Caldo LB, baixo teor de sal (caldo Lennox L), granulado</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Caldo LB convencional, alto teor de sal, também pode ser usado.</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Shaker (Termostada)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&nbsp;</td><td>Qualquer incubadora agitadora com controle de temperatura pode ser usada.</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), > = 99%</td> <td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio, anidro, >99%</td> <td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sal dissódico, >99%</td> <td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Nocivo se inalado.</td></tr><tr><td>Centrífuga (refrigerada)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga (refrigerada)</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de fenol, saturada com tampão citrato 0,1 M, pH 4,3 &plusmn; 0,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalatória), corrosivo</td></tr><tr><td>Absoluto de etanol para análise, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico di-hidratado, Na2HPO4, >=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrogenofosfato de potássio, KH2PO4</td><td>Merck</td><td>48.730.250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris (hidroximetil) aminometano HCl]</td> <td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Cloridrato de Tris (2-carboxietil) fosfina]</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosivo para metais e pele.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosina 5&prime;-trifosfato disódico sal hidratado], Grau I, >=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2), anidro, >=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl), >99%</td><td>Fisher Biorreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl), >99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de eletroforese</td> Real <td>Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe coloração de ácido nucleico</td> Real <td>Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20.000X estoque</td></tr><tr><td>Transiluminador UV (G: Box / EF)</td> <td>Syngene</td><td></td> 2216498 <td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brilhante G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&nbsp;</td><td>Marca Fisher</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios de retardamento de gel de agarose protein-trna para análise do<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -treonilcarbamoyladenosina tcda function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Demonstramos métodos para a expressão e purificação de tRNA (UUU) em Escherichia coli e a análise por ensaios de retardamento de gel da ligação de tRNA (UUU) a TcdA, uma N6-teronilcarbamoil-videina (t 6 A) desidratase, que cicliza o treonilcarbamoílo Cadeia lateral anexada a A37 no circuito anticodon (ASL) de tRNAs para t 6 A cíclico (ct 6 A). A transcrição do gene sintético que codifica tRNA (UUU) é induzida em E. coli com β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico 1 mM (IPTG) e as células contendo tRNA são colhidas 24 h após a indução. A fração de ARN é purificada usando o método de extração de fenol ácido. O ARNt puro é obtido por cromatografia de filtração em gel que separa eficientemente as moléculas de tRNA de tamanho pequeno de ácidos nucleicos intactos ou fragmentados maiores. Para analisar a ligação TcdA ao tRNA (UUU), TcdA é misturado com tRNA (UUU) e separado em um gel de agarose nativo a 4 ° C.O tRNA livre (UUU) migra mais rápido, enquanto os complexos TcdA-tRNA (UUU) sofrem um retardo de mobilidade que pode ser observado após a coloração do gel. Demonstramos que TcdA é uma enzima de ligação de tRNA (UUU). Este ensaio de retardamento de gel pode ser usado para estudar mutantes de TcdA e os efeitos de aditivos e outras proteínas na ligação.

Grandes quantidades de ARNt (UUU) podem ser obtidas expressando o gene de ARNt em E. coli sob o controle de um forte promotor de T7 indutível. O tRNA expresso (UUU) se acumula no citoplasma e é enriquecido sobre o conjunto de tRNAs naturalmente abundantes. Um processo de purificação em duas etapas consistindo em um passo de captura / extração e um passo de filtração / polimento de gel foi utilizado para obter o ARNt da classe EMSA. O passo de captura / extração usa pH 4.3 fenol ...

Um protocolo é apresentado para a produção de tRNA (UUU) e a análise de tRNA (UUU) em complexo com a enzima TcdA por ensaios de retardamento de gel de agarose.

Ensaios de Retardamento de Gel de Agarose Protein-tRNA para Análise do<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -Treonilcarbamoyladenosina TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um ensaio de retardamento em gel de RNA projetado para a descoberta e caracterização de proteínas que se ligam ao RNA. A aplicação deste ensaio é utilizada para investigar a interação entre TcdA e RNA de transferência. O método de retardamento em gel de agarose pode fornecer respostas para questões fundamentais na área da biologia do RNA.Por exemplo, se uma determinada proteína interage com RNA, se a interação é específica por sequência e a força dessa interação. As principais vantagens desta técnica são o uso de pequenas quantidades de amostras de proteína e RNA, além de gerar resultados muito informativos sobre as interações proteína-RNA de forma bastante rápida. Embora este método possa fornecer informações sobre complexos proteína-tRNA, ele também pode ser aplicado a muitos outros sistemas, como RNA ribossômico, RNA mensageiro e quaisquer outros tipos de molécula de RNA.No período da manhã, retire um frasco com E. coli BL21 DE3 congelada transformada com o vetor de expressão pET-23D EC triple-U. Risque uma placa de caldo luria de baixo teor de sal ou placa LB suplementada com 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Inverta a placa e coloque-a em um incubador a 37 graus Celsius até que colônias apareçam no final da tarde.Inocule uma colônia única bem desenvolvida em cinco mililitros de LB acrescido de 100 microgramas por mililitro de ampicilina e cultive durante a noite. Na manhã seguinte, recolha as células em pellet. Após a centrifugação, substitua o meio por cinco mililitros de LB fresco acrescido de 100 microgramas por mililitro de ampicilina e re-suspenda.Use esta suspensão para inocular 200 mililitros de LB acrescido de 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as células por cinco horas a 220 rpm e 37 graus Celsius. Quando a densidade óptica do cultivo a 590 nanômetros atingir entre 0,6 e 0,8, adicione 1 milimolar de IPTG ao cultivo para induzir a expressão do gene de tRNA triplo-U.Após incubação das células a 37 graus Celsius por três horas, colete as células centrifugando o cultivo a 6500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para realizar a lise, primeiro re-suspenda o pellet celular em cinco mililitros de tampão de lise. Adicione um volume de fenol ácido ao pellet celular re-suspenso na capela e misture por um minuto por inversão para lisar as células.Em seguida, centrifugue a 10 mil vezes g durante 10 minutos a 4 graus Celsius. Colete a fase aquosa superior contendo o tRNA triplo-U solúvel utilizando uma pipeta. Tenha cuidado para não aspirar a fase orgânica inferior.Precipite o tRNA misturando completamente a fase solúvel com 2,5 volumes de etanol a 100% volume por volume por inversão durante uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a 15 mil vezes g durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Decante cuidadosamente o sobrenadante e, então, ressuspenda o pellet rico em tRNA em quatro mililitros de tampão de filtração em gel.Seguindo a prática cromatográfica padrão, carregue o tRNA triplo-U re-suspenso em uma coluna preparativa de filtração em gel de alta resolução previamente equilibrada com tampão de filtração em gel. Ajuste a taxa de fluxo para 1 mililitro por minuto para eluir as amostras. Para iniciar o preparo da amostra, pipete a quantidade correspondente de TcdA conforme indicado no protocolo descrito no texto em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro devidamente identificados.Adicione uma concentração final de 1,6 milimolar de TCEP e misture suavemente usando uma pipeta. Feche a tampa e incube a mistura à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, adicione trifosfato de adenosina e cloreto de magnésio.Misture com uma pipeta antes de incubar a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione o tRNA triplo-U purificado conforme descrito no protocolo e misture a amostra com uma pipeta. Após incubar a amostra em temperatura ambiente por cinco minutos, adicione solução salina tamponada com fosfato até um volume final de 100 microlitros.Agite bem e adicione glicerol até uma concentração final de 10%. Vortexe a amostra antes de centrifugar brevemente para sedimentar o conteúdo do tubo. Prepare o gel de agarose conforme descrito no protocolo no texto. Coloque o equipamento de eletroforese em uma bandeja contendo gelo picado para manter a câmara a quatro graus Celsius durante a corrida eletroforética.Pipete cuidadosamente cinco microlitros de cada amostra no poço correspondente. Adicione também um marcador de tamanho de DNA apropriado. Em seguida, conecte os eletrodos nas respectivas fendas da unidade de fonte de alimentação.Após ligar a unidade de fonte de alimentação, ajuste a voltagem para 100 volts e execute o gel por 90 minutos. Em seguida, prepare a solução de coloração misturando 50 mililitros de TBE com 1X de um corante para DNA apropriado. Após 90 minutos de eletroforese, remova cuidadosamente o gel da bandeja e coloque-o em um recipiente com a solução de coloração.Coloque o recipiente em um agitador com velocidade baixa e agite à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova o gel de agarose do recipiente de coloração e bata cuidadosamente sobre um pedaço de papel de celulose para remover o líquido em excesso. Em seguida, coloque o gel diretamente sobre um transiluminador.Ligue a luz UV para visualizar as bandas contendo tRNA. Por fim, tire uma fotografia do gel. Aqui são mostrados resultados representativos da purificação de tRNA para ensaios de retardo em gel.No cromatograma, é registrada a absorbância das frações de eluição a 254 nanômetros. O pool de tRNA, enriquecido no tRNA superexpresso triplo-U, elui no pico mais alto. A qualidade e a quantidade do pool de tRNA são examinadas por eletroforese em gel de agarose.O ensaio de retardo em gel de RNA revela que a TcdA forma um complexo estável com o tRNA triple-U de maneira dependente da concentração de tRNA, o que resulta em uma banda proteína-tRNA que migra mais lentamente do que o tRNA livre na frente do gel. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas. Ao tentar este protocolo, é importante lembrar-se de seguir técnicas laboratoriais rigorosas para garantir a estabilidade química do tRNA.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o ensaio de retardo em gel de agarose para investigar a interação da sua proteína de interesse com tRNA, como no caso da TcdA, ou com qualquer outro tipo de RNA.

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Bioquímica

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