In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado
17 de dezembro de 2017
Uma técnica altamente promissora para gerar tecido constrói sem usar matriz é a células de cultura em uma condição de microgravidade simulado. Usando um sistema rotativo de cultura, nós examinamos o crescimento do folículo ovariano e a maturação do oócito em termos de função oócito sob a condição de microgravidade simulado, morfologia, crescimento e sobrevivência do folículo.
Crescimento in vitro de folículos pré-antrais de camundongo sob microgravidade simulada. Todo o procedimento pode ser dividido em quatro partes. Parte um, isolar mecanicamente folículos dos ovários utilizando agulhas sob microscópio estereoscópico.
Parte dois, encapsule um único folículo pipetando-o para o centro de cada microgota de alginato. Parte três, transfira as microgotas de alginato contendo os folículos individuais para a gota de meio de cultura no sistema de cultura rotativo, que gera a microgravidade simulada. Parte quatro, pegue as microgotas de alginato e desencapsule os folículos das microgotas de alginato incubando em meio suplementado com alginato liase por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Isolamento e encapsulação de folículos. Colete os ovários em meio de manipulação e, em seguida, coloque os ovários em uma placa de poços centralizada. Sob um microscópio estereoscópico, os folículos são isolados dos ovários com duas agulhas.
Tenha cuidado para não prejudicar a vasomembrana. Prepare um recipiente com gotas de meio e cubra-o com óleo. Transfira os folículos para o recipiente preparado.
Lave os folículos no novo meio e, em seguida, transfira-os para as gotas de meio. Uma gota de meio contém um único folículo. Prepare uma placa de cultura centralizada e adicione a solução de encapsulação ao círculo externo.
Prepare um frasco com a solução de alginato a zero vírgula oito por cento. Adicione zero vírgula cinco microlitro da solução de alginato no centro do recipiente. Adicione gotas da solução de alginato na solução de encapsulação no círculo externo do recipiente.
Transfira o folículo para a solução de alginato no centro da placa. Enxágue os folículos com a solução de alginato. Transfira os folículos para o centro de cada gota de alginato através da superfície macia da solução.
Cada esfera de alginato contém um único folículo. Lave as esferas de alginato com a solução de encapsulação para solidificá-las. Transfira as esferas de alginato para uma nova placa com meio de manipulação.
Cultura in vitro de folículos encapsulados sob tratamento de microgravidade simulada. Para o grupo controle, adicione 150 mililitros de meio de cultura a um novo recipiente e cubra com óleo. Transfira três microesferas de alginato para a gota de meio.
Incube o recipiente em uma incubadora de dióxido para cultura. Para o tratamento de microgravidade simulada, prepare um recipiente com óleo, remova a tampa do orifício, adicione o óleo no vaso através do orifício aberto, até que o vaso esteja quase cheio. Adicione um meio de cultura de 50 mililitros ao óleo.
Transfira três microesferas de alginato para a gota de meio. Substitua a tampa da porta aberta. As bolhas de ar no recipiente devem ser removidas.
Remova a tampa da porta da seringa. Coloque duas seringas com óleo na porta da seringa. Maneje as bolhas de ar sob a porta da seringa.
Puxe as bolhas para dentro da seringa e injete o mesmo volume de óleo para fora da outra seringa. Certifique-se de que não haja bolhas de ar no recipiente. Feche as válvulas, remova as seringas e recoloque a tampa do orifício de seringa.
Já preparamos quatro recipientes com microesferas de alginato. Agora é a hora de fixar os recipientes na base rotativa. Ajuste a taxa de rotação até que a gota de meio esteja em estado de equilíbrio.
Transfira ambos os vasos e a base para um incubador de dióxido para cultura. Troca do meio de cultura. Remova a tampa da porta aberta, colete as microcápsulas de alginato e o óleo em um novo recipiente.
Localize e transfira as microesferas de alginato para uma placa com o meio de manipulação. Reestabeleça o sistema de cultivo em vaso como anteriormente. Coleta de folículos.
Remova a tampa da porta aberta, colete as microesferas de alginato e o óleo em um novo recipiente. Recolha as microesferas de alginato e os folículos desencapsulados a partir das microesferas de alginato mediante incubação em meio de manipulação, suplementado com alginato liase, durante 30 minutos a 37 graus centígrados. Resultados. O ensaio de viabilidade celular mostrou que os folículos isolados cultivados em condição de gravidade normal apresentaram maior número de células vivas e menor número de células mortas em comparação com os folículos cultivados em condições de microgravidade simulada.
O tamanho dos folículos aumentou significativamente sob ambas as condições de gravidade. Conclusão. Nosso método fornece um modelo para estudar os mecanismos envolvidos nos processos de desenvolvimento in vitro de oócitos e células da granulosa sob condição de microgravidade simulada.
Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo para o cultivo de folículos pré-antrais de camundongo em condições de microgravidade simulada, utilizando um sistema de cultivo rotativo. A abordagem envolve o isolamento e a encapsulação de folículos em microesferas de alginato, o cultivo em condições normais e de microgravidade simulada, e a avaliação da sobrevivência, crescimento e ultraestrutura de oócitos. Os resultados destacam o impacto da microgravidade na viabilidade dos folículos e no desenvolvimento dos oócitos, fornecendo um modelo para investigações futuras da foliculogênese in vitro sob gravidade alterada.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia reprodutiva
- Biologia do desenvolvimento
- Engenharia de tecidos
Contexto
- Os ambientes de microgravidade podem afetar o desenvolvimento celular e tecidual.
- A cultura de folículos in vitro é uma ferramenta valiosa para o estudo do desenvolvimento de ovócitos e células da granulosa.
- Sistemas de microgravidade simulada permitem investigar o papel da gravidade na foliculogênese.
- A encapsulação em alginato sustenta a cultura de folículos tridimensionais.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo para o cultivo de folículos pré-antrais de camundongo sob microgravidade simulada.
- Comparar a sobrevivência e o desenvolvimento folicular entre condições de gravidade normal e microgravidade simulada.
- Avaliar os efeitos da microgravidade no desenvolvimento do ovócito e das células da granulosa.
Métodos Utilizados
- Isolamento mecânico de folículos pré-antrais de ovários de camundongos de 14 dias de idade utilizando agulhas sob microscópio estereoscópico.
- Encapsulamento de folículos individuais em microesferas de alginato 0,8%.
- Cultivo de folículos encapsulados em um sistema de vaso rotativo para simular microgravidade, com culturas controle paralelas em gravidade normal.
- Recuperação e desencapsulamento de folículos utilizando alginato liase.
- Avaliação da sobrevivência dos folículos, medição dos diâmetros dos folículos e dos ovócitos, e análise ultraestrutural dos ovócitos.
Resultados Principais
- Folículos cultivados sob gravidade normal apresentaram maior viabilidade celular em comparação com aqueles sob microgravidade simulada.
- O tamanho dos folículos aumentou significativamente sob ambas as condições de gravidade.
- A microgravidade simulada levou à redução da sobrevivência folicular e à downregulação da expressão do antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA) e do fator de diferenciação do crescimento 9 (GDF9).
- Oócitos do grupo submetido à microgravidade exibiram anormalidades ultraestruturais.
Conclusões
- O método descrito permite o estudo do desenvolvimento folicular e ovocitário in vitro sob microgravidade simulada.
- A microgravidade simulada afeta negativamente a sobrevivência folicular e a qualidade do ovócito.
- É necessária uma maior otimização do sistema de cultura para modelar melhor a foliculogênese in vitro sob condições de gravidade alterada.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O cultivo sob microgravidade simulada de folículos pré-antrais de camundongo fornece um sistema controlado para investigar o impacto mecanicista de forças físicas alteradas na folículoogênese inicial. Este modelo permite a avaliação quantitativa da sobrevivência folicular, do crescimento do ovócito e de marcadores moleculares, reforçando a confiança preditiva em estudos de biologia do desenvolvimento. A abordagem orienta decisões ajustadas ao risco em pesquisas translacionais nas áreas de reprodução e engenharia de tecidos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a desmistificação mecanicista do desenvolvimento de folículos e ovócitos sob condições de gravidade alterada.
- Apoia a validação funcional de marcadores moleculares como PCNA e GDF9 na maturação de células da granulosa e ovócitos.
- Oferece uma plataforma quantitativa para testes de hipóteses em biologia reprodutiva e engenharia de tecidos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Estabelece um sistema reprodutível de cultura 3D para avaliação da viabilidade folicular e métricas de crescimento.
- Facilita a padronização de leituras quantitativas, incluindo diâmetros foliculares e do óvulo.
- Permite análise comparativa de sobrevivência e expressão molecular sob condições físicas variáveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Oferece um modelo para estudar mecanismos relevantes à doença que afetam a qualidade do ovócito e a sobrevivência do folículo.
- Apoia a integração de achados in vitro com o desenvolvimento translacional de biomarcadores na saúde reprodutiva.
- Informa estratégias pré-clínicas para otimizar sistemas de cultura de tecidos em ambientes não padronizados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir estudos mecanicistas em estágios iniciais e o desenvolvimento de ensaios quantitativos em biologia reprodutiva e engenharia de tecidos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses sobre o efeito da gravidade na foliculogênese e na maturação do oócito.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de viabilidade e crescimento sob condições controladas.
- Análises: Oferece pontos finais mensuráveis, como taxas de sobrevivência, expressão de marcadores moleculares e análise ultraestrutural.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos em medicina reprodutiva e regenerativa.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudos mecanicistas em diversos tipos de tecidos e células.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em modelos de biologia do desenvolvimento e reprodução.
- Valor Operacional: Promove a padronização e reprodutibilidade em protocolos de cultura 3D e avaliação quantitativa.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento de programas de engenharia de tecidos e saúde reprodutiva.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de iniciativas de pesquisa mecanicista e translacional.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em isolamento de folículos, encapsulação e técnicas de cultivo tridimensional.
- Requer acesso a sistemas de cultivo rotativos especializados e infraestrutura analítica para avaliação quantitativa.
- Necessita padronização entre equipes para ensaios de viabilidade e análise de marcadores moleculares.
- Pode exigir adaptação para diferentes tipos de tecidos ou espécies, dependendo do foco da pesquisa.
- A otimização dos parâmetros de simulação de microgravidade é essencial para a confiabilidade e reprodutibilidade do modelo.
