Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

O objetivo geral deste estudo é preencher dispositivos microfabricados com células do músculo cardíaco e caracterizar as propriedades bioquímicas e biomecânicas das células desses dispositivos, bem como seu desempenho ao longo do tempo. O assunto descrito aqui pode ser facilmente modificado para outros experimentos que requerem adição de células de alta densidade em dispositivos microfabricados. A principal vantagem do bioatuador desenvolvido neste vídeo é que ele pode ser facilmente adotado para quantificar as forças de contração celular de qualquer outro tipo de célula.

Também pode ser usado para estudar as mudanças nas características biomecânicas das células-tronco à medida que sofrem diferenciação. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de semeadura celular são difíceis de aprender com descrições de textos. Eles devem ser realizados adequadamente para garantir a fixação de células confluentes nos braços cantilever, o que é essencial para a função biológica adequada.

Demonstrando o procedimento estará Neerajha Nagarajan do meu laboratório. Com o biorrobô, comece no frasco T25. Use um ímã para mantê-lo no lugar na parte inferior do frasco.

O ímã não é necessário para os atuadores biológicos, pois eles não se movem devido ao peso do grânulo de vidro na base. Enrole uma pequena folha de plástico quadrada para usar como funil e coloque o funil estéril sobre os atuadores nos biorrobôs. Ajuste o diâmetro na extremidade mais larga para caber no dispositivo e a altura de modo que ele se encaixe perfeitamente quando a parte superior do frasco for apertada.

Utilizar um balão separado para testar e ajustar o ajuste do funil. O ajuste confortável do funil garantirá que não haja vazamento das células, conforme mencionado, para o restante da mídia. Isso é essencial para fornecer cobertura confluente do braço cantilever.

Com o funil no lugar, ressuspenda cardiomiócitos em DMEM completo a uma densidade de 16 milhões de células por mililitro e solte lentamente 400 microlitros da suspensão nos dispositivos através de cada funil. Em seguida, mova lentamente os frascos de volta para a incubadora sem perturbar os dispositivos ou os funis internos. Deixe as células se fixarem por 24 horas a 37 graus Celsius.

Após o período de incubação, remova lentamente o funil. Lave suavemente as amostras com PBS e reabasteça cada frasco com 10 mililitros de DMEM fresco completo. Em seguida, remova o ímã do biorrobô para que eles flutuem e coloque os frascos de volta na incubadora.

Monte uma câmera equipada com uma lente de zoom na incubadora para visualizar os dispositivos em cultura. Em seguida, adicione uma faixa de luz LED para usar como fonte de luz. Em seguida, conecte a câmera a um computador e abra o programa de imagem.

Uma vez no programa, clique na imagem da câmera na guia Arquivo para abrir todas as opções de câmera e escolha a câmera conectada. Na lista de guias, escolha Ao vivo e coloque a imagem em foco manualmente ajustando o dial da lente. Em seguida, selecione o corte da região de interesse no painel superior.

Em seguida, desenhe manualmente um retângulo no quadro de vídeo envolvendo o dispositivo atuador biológico e os braços cantilever para marcar a região de interesse. No caso de biorrobôs, capture a tela inteira para registrar o movimento de natação do dispositivo. Em seguida, selecione Configurações da câmera e defina a taxa de quadros ajustando a exposição e a proporção de pixels da imagem ao vivo.

Defina as taxas de quadros para cerca de 30 quadros por segundo. Por fim, clique no botão de gravação para começar a gravar os vídeos. Abra o software de programação clicando no ícone.

Depois de carregado, clique em Arquivo, Abrir e selecione o arquivo de script m para executar a análise de imagem. Certifique-se de que as imagens TIF gravadas e suas versões AVI estejam na mesma pasta que o arquivo m e clique em Executar para executar o script. Pressione Play para iniciar o programa real.

Depois de executado, clique no botão Abrir e localize o arquivo TIF ou AVI que será analisado. Em seguida, clique no botão base. Selecione o ponto onde o cantilever se conecta à base na parte superior e pressione Enter.

Isso colocará um marcador quadrado na imagem para cada quadro para denotar a localização da base do cantilever. Em seguida, clique no botão de escala e, em seguida, clique manualmente em uma borda da conta de vidro. Traga o ponteiro do mouse para o lado oposto da conta de vidro e pressione Enter.

Isso desenhará uma linha que mede o diâmetro da esfera de vidro e relacionará o diâmetro aos pixels exibidos. Clique no botão Analisar. Em seguida, clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base do cantilever.

Continue a clicar ao longo do cantilever, incluindo a ponta, e pressione Enter quando terminar. Isso colocará um X em cada ponto clicado no balanço. Por fim, verifique se o círculo sobreposto traça corretamente o perfil em balanço.

Se estiver correto, clique no botão do próximo quadro. Isso mudará para o próximo quadro no arquivo TIF. Repita esse processo para todos os quadros.

Depois que todos os quadros forem processados, clique no botão Exportar. Comece abrindo o software de análise de imagem e carregando o arquivo de vídeo do biorobô nadador. Em seguida, abra o software de planilha.

No vídeo do biorobô carregado, localize uma referência de tamanho, como a esfera de vidro. Use a ferramenta Reta para desenhar uma linha na esfera de vidro. Em seguida, clique em Analisar e selecione Definir escala.

Defina o campo Distância conhecida como 3.000 micrômetros e clique em OK. Escolha um ponto em um dispositivo que não oscile entre os quadros para atuar como um marcador e registre as coordenadas X e Y desse ponto na planilha. Volte para a janela do software de análise de imagem e pressione a tecla de seta para a direita para mudar para o próximo quadro. Aponte para o marcador novamente e registre as novas coordenadas X e Y na planilha.

Repita esse processo para todos os quadros e use os dados para analisar o movimento do biorrobô, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. As tensões estáticas e dinâmicas do atuador foram extraídas da tensão superficial a cada dia. O estresse estático é o estresse contrátil que as células exibem na superfície no estado de repouso e o estresse dinâmico é o estresse gerado pelas células na contração máxima.

À medida que as células amadureceram em cultura, um aumento gradual nas tensões estáticas e dinâmicas foi observado ao longo do tempo. Eles exibiram uma força máxima de tração celular de 50 milinewtons por metro e uma força máxima de contração de cerca de 165 milinewtons por metro no sexto dia. Paralelamente aos estresses estáticos e dinâmicos, os marcadores de maturação, crescimento e disseminação de cardiomiócitos e interconectividade celular também aumentam até o sexto dia.

Com base na análise de vídeo, a comparação da velocidade média de natação, frequência de batimentos e distância percorrida por braçada para três biorrobôs com diferentes perfis de natação é mostrada aqui. Embora os biorrobôs verticais tenham a menor frequência de batimentos, eles exibiram a maior velocidade de natação e distância percorrida. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como semear células do músculo cardíaco em dispositivos microfabricados que podem funcionar como atuadores biológicos e biorrobôs.

O processo de aquisição de imagens e análise de dados subsequente descrito neste vídeo demonstra uma maneira conveniente de caracterizar o comportamento da célula, bem como o desempenho do dispositivo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a vida útil dos cardiomiócitos é limitada e a atividade das células atinge o pico no sexto dia. Depois disso, diminui com o tempo.