Name: Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a cultivar cardiomiócitos em dispositivos microfabricados para caracterizar propriedades biomecânicas e bioquímicas ao longo do tempo. Este método permite quantificar forças de contração celular e estudar diferenciação de células-tronco.

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MT Holley é apoiado pelo programa Graduate Fellows da Louisiana Board of Regents, e C. Danielson é apoiado pelo Programa de Professores do Instituto Médico Howard Hughes. Este estudo é apoiado pelo NSF Grant No: 1530884.

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados utilizando um protocolo aprovado e de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame. 1. Semente e Cultura de Células <ol><li> Antes de iniciar, prepare os itens necessários: um pequeno funil, pipetas e meio de Eagle modificado Dulbecco morno (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico penicilina (DMEM completo). </li><li> Tome frascos T-25 juntamente com o dispositivo funcionalizado (atuador biológico ou biorobot) dentro dele. Consulte a seção 4 da Parte 1 deste manuscrito em duas partes para obter detalhes sobre a preparação do dispositivo, a funcionalização e o armazenamento antes da semeadura celular. </li><li> Prepare um funil, que pode ser feito rolando uma pequena folha quadrada de plástico. Coloque-o sobre o atuador biológico ou biorobot dentro do frasco T-25. Ajuste o diâmetro da extremidade mais larga para ajustar o dispositivo inteiroE a altura de modo a que encaixe confortavelmente quando o topo do balão é apertado. <ol><li> Para os biorobôs, use um íman para manter o dispositivo no lugar no fundo do frasco durante todo o processo de semeadura. Nota: Aqui, um único ímã de disco de neodímio (1,26 &quot;de diâmetro) foi usado, mas qualquer ímã de tamanho e força semelhantes também pode ser usado para manter o biorobot com a base compósita magnética de níquel-PDMS. </li><li> UV esterilizar a folha de plástico por pelo menos 30 min antes da utilização. </li></ol></li><li> Certifique-se de que não haja um grande espaço entre a base do funil eo balão. </li><li> Ressuspender os cardiomiócitos em DMEM completo a uma densidade de 1,6 x 10 7 células / mL e deixar cair lentamente 400 μL de suspensão para o dispositivo através do funil. Use um hemocitômetro ou qualquer outro contador de células para determinar o número de células obtidas. </li><li> Lentamente mover o sistema de volta para a incubadora sem perturbar o dispositivo eo funil witHin. Cultura durante 24 h a 37 ° C. </li><li> Após o período de incubação, retire lentamente o funil, lave cuidadosamente a amostra com PBS, e reabasteça o balão com 10 mL de DMEM fresco completo. Nota: Para os biorobôs, remova o íman para que o dispositivo flutue. </li></ol> 2. Caracterização bioquímica <ol><li> Ensaio de fluxo de cálcio Nota: O ensaio de fluxo de cálcio é realizado para avaliar a interconectividade das células. O procedimento para carregar as células com o corante fluorescente, específico do ião cálcio, segue o processo descrito num protocolo previamente estabelecido 11 . <ol><li> Primeiro, prepare os materiais requeridos, éster de fluo-4-acetometil (AM) de cálcio, poliol surfactante não iónico (ver Tabela de Materiais ) e solução de sal de Tyrode. </li><li> Usando pinças longas, transferir suavemente o dispositivo do frasco de cultura para uma placa de Petri de 35 mm com 2 mL de solução salina de Tyrode<html> Ção. </li><li> Em um tubo de centrífuga separado, tomar 1 mL de solução de Tyrode quente (aquecida a 37 ° C) e adicionar 3-5 μL de corante de cálcio fluo-4 AM (concentração de trabalho: 3-5 μM) e uma parte igual de surfactante não iónico Poliol (concentração de trabalho: 0,2%). Substituir a solução da amostra por uma solução quente de Tyrode suplementada com o corante indicador de cálcio, fluo-4 e 0,2% de surfactante não iónico. Incubar durante 25 - 30 min a 37 ° C. </li><li> Remover a solução de corante e lavar cuidadosamente a amostra com a solução fresca de Tyrode. Re-incubar a amostra em 2 mL de DMEM fresco completo durante mais 30 min a 37 ° C antes da imagem. Nota: Os resultados deste ensaio e vídeo relacionados são fornecidos no trabalho publicado anteriormente 7 . </li></ol></li><li> Imunofluorescência Nota: A imunocoloração dupla de todas as amostras foi realizada seguindo o protocolo previamente estabelecido&gt; 12. <ol><li> Primeiro, preparar 10% de soro de cabra (GS) em solução salina tamponada com fosfato (PBS), paraformaldeído a 4% (PFA) em diH2O, 0,1% de detergente de lise celular (ver Tabela de Materiais ) em PBS, anticorpos primários Anticorpos monoclonais de murganho monoclonal cardíaco troponina I e anticorpos monoclonais anti-coelho conexinas 43), anticorpos secundários (conjugado Alexa 594 e conjugado de cabra anti-IgG de rato anti-IgG de rato (Alexa 488) e DAPI. Cuidado: Paraformaldeído é cancerígeno. </li><li> Remover a amostra de interesse do balão e lavá-la suavemente duas vezes com PBS. Consulte a seção 4 na Parte 1 deste manuscrito em duas partes para obter detalhes sobre a preparação da amostra e a sua funcionalização. </li><li> Adicione uma gotícula de PBS em uma pequena lamela (diâmetro: 12 mm ou 15 mm). Segure delicadamente a base do dispositivo com uma pinça e corte os braços PDMS finos (cantilever, Figura 1 ) usando tesouras da extremidade onde se conecta ao topo da baseE. Transfira os braços cantilever para a gotícula com o lado aderente à célula voltado para cima. A gota de PBS impedirá que as células seque. </li><li> Fixar as amostras com PFA a 4% e realizar a imunomarcação dupla das amostras, como descrito anteriormente 12 . </li><li> Após a imunocoloração, montar as amostras em uma lâmina de vidro limpo usando anti-fade montagem reagente e reservado, sem ser perturbado, no escuro por 24 h. </li><li> Repita o procedimento para todas as amostras. Nota: Os resultados deste ensaio e as imagens relacionadas são discutidos em profundidade no trabalho previamente publicado 7 . </li></ol></li></ol> 3. Imagens <ol><li> Colocar o frasco T-25 ereto numa incubadora de CO 2 e preparar o sistema de imagem dentro da incubadora. Grave o dispositivo usando uma câmera (consulte a Tabela de Materiais ) com uma lente de zoom (consulte a Tabela de Materiais ). Para uma fonte de luz,Use uma faixa de luzes LED. Nota: Uma tira de LEDs de luz branca foi usada aqui, mas qualquer LED normal também funcionará. </li><li> Conecte a câmera a um sistema operacional e abra o software específico da câmera (consulte a Tabela de Materiais ). Clique na imagem da câmera embaixo da guia &quot;Arquivo&quot;, no painel superior, para abrir todas as opções da câmera e escolha a câmera correta. </li><li> Escolha &quot;live&quot; na lista de guias no painel superior dentro do software. </li><li> Coloque manualmente a imagem em foco, ajustando o mostrador da lente. Selecione &quot;Cortar para a região de interesse (ROI)&quot; no painel superior. Em seguida, desenhe manualmente um retângulo na moldura de vídeo, encerrando o dispositivo de atuador biológico e os braços em consola, para marcar o ROI. Nota: Escolher um ROI adequado minimiza o tamanho dos ficheiros de imagem. <ol><li> No caso de biorobots, capturar toda a tela, a fim de gravar o movimento de natação do dispositivo. NOTA: Não há necessidade de desenhar um ROI para os biorobôs </li></ol></li><li> Antes de iniciar a gravação, selecione &quot;Configurações da câmera&quot; em uma das guias no painel superior da tela. Defina a taxa de quadros ajustando a relação de exposição e pixel da imagem ao vivo, deslizando a barra para cada um ou inserindo manualmente os valores. Defina as taxas de quadros para cerca de 30 ± 2 fps. Nota: Alterar a relação de exposição e pixel altera o brilho eo contraste da imagem ao vivo. </li><li> Clique no botão &quot;Gravar&quot; do painel superior do software para começar a gravar os vídeos dos atuadores com resolução de 1.000 x 1.000 pixels para precisamente 30 s. Repita o processo para todas as amostras. </li></ol> 4. Análise de imagem dos atuadores biológicos em uma base estacionária <ol><li> Analise as imagens usando um software de programação ( por exemplo, Matlab) executando o script personalizado. Veja a Tabela de Materiais </stRong&gt; eo Arquivo Suplementar para mais detalhes. Nota: O script exibe cada quadro dos vídeos gravados, recebe a entrada do mouse do usuário para registrar a coordenação dos pontos do cantilever nas imagens, calcula o diâmetro e o centro do círculo que passa os pontos introduzidos por meio do encaixe pelo menos quadrado e Exporta todos os dados introduzidos e calculados para utilização posterior. <ol><li> Abra o software de programação clicando no ícone. Clique em &quot;Arquivo&quot; -&gt; &quot;Abrir&quot; na barra de menu na parte superior e selecione o arquivo de script .m para análise de imagem. Verifique se as imagens TIFF gravadas estão na mesma pasta que o arquivo .m. Clique em &quot;Executar&quot; para executar o script. Nota: Uma tela interativa aparecerá para alterar. </li><li> Pressione &quot;play&quot; para iniciar o programa real. Clique no botão &quot;abrir&quot; e localize o arquivo TIFF que vai ser analisado. </li><li> Clique no botão &quot;base &amp; #34; Botão e, em seguida, clique no ponto onde o cantilever atribui à base no topo; Pressione Enter. Isto irá colocar um marcador quadrado na imagem para cada quadro para denotar a localização da base cantilever. </li><li> Clique no botão &quot;Escala&quot; e, em seguida, clique manualmente em uma borda do grânulo de vidro. Traga o ponteiro do mouse para o lado oposto da conta de vidro e pressione &quot;Enter&quot;. Nota: Isto deve traçar uma linha que mede o diâmetro do cordão de vidro. Uma vez que o rebordo de vidro tem 3 mm de diâmetro, isto irá relacionar 3 mm com os pixels apresentados. </li><li> Clique no botão &quot;Analisar&quot;. Clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base cantilever. </li><li> Clique no botão &quot;Analisar&quot;. Em seguida, clique ao longo do cantilever a uma curta distância do primeiro marcador quadrado que representa a base cantilever. Continue a clicar ao longo do cantilever, incluindo a ponta, e pressione enter quandofeito. Isto colocará um &quot;x&quot; em cada ponto clicado no cantilever. Nota: Com base na coordenação do marcador quadrado e nos marcadores x, o centro e o diâmetro de um círculo serão calculados usando uma função de encaixe pelo menos quadrada (consulte o arquivo suplementar anexado para o script utilizado). O círculo, que passa os marcadores x eo criador de quadrados, será sobreposto automaticamente à imagem. </li><li> Verifique se o círculo sobreposto traça corretamente o perfil do cantilever. Nota: Quando o cantilever é muito plano, é difícil julgar se o perfil do cantilever é traçado corretamente. Consulte a Figura 3 . </li><li> Clique no botão &quot;próximo quadro&quot;. Isto irá mudar para o próximo quadro no ficheiro TIFF. A base ea escala já estão definidas a partir da etapa anterior. </li><li> Repita as etapas 4.1.5 até 4.1.7 até que todos os quadros no arquivo TIFF tenham sido concluídos. Uma vez que todos os quadros foram proceSsed, clique no botão &quot;Exportar&quot;. Nota: Isso fará um arquivo de planilha com o nome do arquivo TIFF para o cantilever que acabou de ser analisado. Edite o nome do arquivo para incluir qual lado (esquerdo ou direito) do cantilever foi analisado. </li></ol></li><li> Calculando o estresse na planilha. <ol><li> Calcule a tensão superficial &quot;σ&quot; no cantilever usando a seguinte equação: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/55643/55643eq1.jpg" /> Onde E, R, v e h são o módulo de Young, o raio de curvatura, a razão de Poisson ea espessura em consola, respectivamente. Nota: A espessura do cantilever pode ser alterada para alterar a sensibilidade. Neste estudo, os valores foram os seguintes: E = 750 kPa, v = 0,49 e h = 25 μm 13 , 14 . </li><li> Calcular a tensão superficial utilizando a equação do passo 4.2.1. Abra o .Xls arquivo de planilha. Observe que a saída tem várias colunas mostrando primeiro as coordenadas x e y de base e círculo e, em seguida, o raio de curvatura. Calcule as coordenadas xey de cada ponto clicado com base nestes. Nota: A representação gráfica das tensões sobre os quadros de imagem de intervalo de tempo mostra mudanças na força exercida sobre o cantilever ao longo do tempo. As depressões mostram o estresse sobre o cantilever durante o relaxamento dos cardiomiócitos ou a tensão estática exercida sobre o cantilever devido às forças de tração celular. Os picos mostram o estresse dinâmico no cantilever, que foi exercido pelo batimento dos cardiomiócitos. Este valor corresponde à quantidade máxima de força gerada pela contracção dos cardiomiócitos. </li></ol></li></ol> 5. Análise de Natação Biorobots <ol><li> Registre a posição do biorobot usando o software de análise de imagens. Nota: Consulte a lista de Materiais para o softwareÉ seção. <ol><li> Abra o software de análise de imagem ( por exemplo, ImageJ). Pressione &quot;Arquivo&quot; e &quot;Abrir&quot; e selecione o arquivo de vídeo biorobot natação. Clique em &quot;OK&quot; e deixe o programa carregar o arquivo. Abra o software da folha de cálculo. </li><li> No vídeo biorobot carregado, encontre uma referência de dimensões conhecidas ( por exemplo, o rebordo de vidro de 3 mm de diâmetro que foi incorporado no atuador biológico). Nota: Qualquer objeto com dimensão conhecida funcionará. Isso determinará as proporções de pixel para comprimento em cada vídeo. </li><li> Use a ferramenta &quot;Straight&quot; para desenhar uma linha em toda a pérola de vidro. Clique em &quot;Analisar&quot; e selecione &quot;Definir escala&quot;. Defina o campo &quot;Distância conhecida&quot; para &quot;3.000 μm&quot; e clique em &quot;Ok&quot;. Nota: Isto irá definir as coordenadas x e y para micrômetros. </li><li> Escolha um ponto no dispositivo que não oscila entre quadros para agir como um marcador. Nota:Recomenda-se escolher um canto da base. </li><li> Aponte para o ponto selecionado em 5.1.4 no primeiro quadro. Registre as coordenadas x e y na planilha. </li><li> Volte para a janela do software de análise de imagem e pressione a tecla de seta para a direita para mudar para a próxima moldura. Aponte novamente para o marcador (a partir do passo 5.1.4) e registre as coordenadas x e y na planilha. </li><li> Repita o passo 5.1.6 para todos os quadros. </li></ol></li><li> Calcule os parâmetros de natação do biorobot usando a planilha de coordenadas 7 . <ol><li> Calcule o período entre quadros a partir da taxa de quadros conhecida de cada vídeo. </li><li> Calcule a mudança nas coordenadas x e y entre quadros para encontrar a distância movida, incluindo a distância total. </li><li> Calcule a amplitude de contração da mudança máxima ao longo do eixo y. Determine a frequência de batimento para cada biorobot do inverso do período entre duas contrações. </li><li> CCalcular a velocidade de natação de cada dispositivo a partir do tempo total e da distância movida na direção x. </li><li> Repita o passo 5.2 para cada vídeo biorobot que foi analisado. </li><li> Normalize cada parâmetro medido. Nota: Normalize todos os valores para melhor visualizar as diferenças. Este protocolo demonstra normalização com relação a um biorobot de modo horizontal com contrações de baixa frequência (LF horizontal) ( Figura 4 ) 7 . </li></ol></li></ol> 6. Análise da Expressão de Proteína Nota: As amostras montadas preparadas nos passos 2.2.4 e 2.2.5 foram visualizadas utilizando um microscópio confocal. As imagens foram adquiridas em amplificação 20X, 40X e 60X sequencialmente em três canais simultaneamente: 460 nm, 488 nm e 594 nm. Um conjunto de 5 imagens foram capturadas a uma ampliação de 40X, a partir de posições diferentes para cada amostra, e cada canal foi guardado como um indivíduo.Arquivo. O ajuste de exposição foi determinado pela ampliação do objectivo utilizado e foi fixado constante para todas as capturas nessa ampliação. <ol><li> Abra o software de análise de imagem e selecione &quot;Arquivo&quot; -&gt; &quot;Abrir&quot; para carregar as imagens. </li><li> Desenhe um polígono retangular na moldura da imagem para marcar o ROI. Selecione &quot;Analisar&quot; -&gt; &quot;Medir&quot; para medir a intensidade fluorescente média. </li><li> Repita o passo 6.2 para coletar medições de intensidade de todas as amostras e calcular a respectiva intensidade média para cada condição. Nota: Aqui, uma condição diferente refere-se a diferentes pontos de tempo, como em, dia 1, dia 2 e até dia 6. </li><li> Exporte os resultados em uma planilha para análise estatística adicional e para a produção de gráficos de dados. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O procedimento descrito aqui descreve um método de sementeira bem sucedido para actuadores e biorobots baseados em PDMS, o que facilita a ligação de cardiomiócitos. Além disso, foi descrito o processo de aquisição de imagem e a subsequente análise que caracteriza o comportamento das células eo desempenho dos dispositivos. Observamos a contração espontânea de células nos braços cantilever após 24 h; A intensidade das contrações continuou a aumentar de forma constante ao longo do tempo e ating...

Biorobots são dispositivos baseados em células vivas que são incorporados dentro de um backbone mecânico que é geralmente composto de materiais macios, elásticos, como PDMS ou hidrogéis 1 . As células sofrem contrações rítmicas, espontaneamente ou em resposta a estímulos, e assim funcionam como um atuador. A energia gerada a partir da célula de contração drives vários biorobots. As células do coração de mamíferos (cardiomiócitos) e as células do músculo esquelético são frequentemente utilizadas para a actuação biorobot devido às suas propriedades contrácteis. Além de cardiomiócitos e células musculares esqueléticas, foram utilizados outros tipos de células, tais como tecidos musculares de insectos 2 e tecidos musculares explantados 3 . Os tecidos musculares de insetos permitem a operação de atuadores biológicos à temperatura ambiente. A função eo desempenho de um biorobot são determinados principalmente pela força e consistência do atuador biológico ( ie. Células musculares), enquanto que a estrutura principal mecânica determina os mecanismos de locomoção, estabilidade e potência. Uma vez que estes dispositivos são exclusivamente movidos por forças geradas por células, não existem poluentes químicos ou ruídos operacionais. Portanto, eles formam uma alternativa de energia eficiente para outros robôs convencionais. Várias fontes da literatura discutiram os diferentes métodos para integrar células vivas e tecidos em biorobots 1 , 4 , 5 . Os avanços na microfabricação e técnicas de engenharia de tecidos permitiram o desenvolvimento de biorobôs que podem andar, segurar, nadar ou bombear 5 , 6 . Em geral, as células são cultivadas directamente sobre o esqueleto mecânico (polimérico) como uma folha de células confluentes ou são moldadas em estruturas de actuação tridimensionais dentro de andaimes tais como anéis e tiras. Na maioria das vezes, biorobots sãoFabricadas utilizando folhas de cardiomiócitos 6 , 7 , uma vez que estas células têm uma capacidade inata para exibir uma contracção espontânea sem estímulos externos. Por outro lado, os relatos sobre as folhas de células do músculo esquelético são limitados devido à sua necessidade de estímulos para iniciar as contrações in vitro , a fim de iniciar a despolarização da membrana 8 . Este protocolo descreve, em primeiro lugar, como semear cardiomiócitos num actuador biológico funcionalizado feito de um cantilever PDMS fino. Em seguida, descreve em detalhes a semeadura e análise dos perfis de natação. O cantilever é funcionalizado com uma proteína adesiva celular tal como a fibronectina e é semeado confluentemente com cardiomiócitos. À medida que as células semeadas no dispositivo se contraem, elas fazem com que o cantilever se dobre e assim actue como um actuador. Ao longo do tempo, à medida que as células se amadurecem, rastreamos as mudanças no estresse superficial no dispositivo, analisando vídeosDobra em cantilever. O actuador biológico desenvolvido aqui pode ser utilizado para determinar as propriedades contrácteis de qualquer tipo de célula, tal como os fibroblastos ou células de caules pluripotentes induzidas, à medida que sofrem diferenciação. Grande parte da pesquisa anterior sobre biorobôs foi focada no desenvolvimento de atuadores biológicos, enquanto a otimização da arquitetura biorobot e capacidades funcionais foram largamente negligenciadas. Recentemente, alguns estudos têm demonstrado a implementação de modos de natação em biorobôs que são inspirados pela natureza. Por exemplo, os biorobots de natação com movimento baseado em flagelos 6 , propulsão de água-viva 9 e raios bio-híbridos 4 foram projetados. Ao contrário de outros trabalhos na literatura, aqui nos concentramos em variar as propriedades da espinha dorsal mecânica para criar uma estrutura de auto-estabilização. O biorobot desenvolvido neste estudo é capaz de manter um passo constante, roll, e imMersion como ele nada. Estes parâmetros podem ser modificados variando a espessura de cada composto de base. Os passos de fabricação envolvidos no desenvolvimento do atuador PDMS, o biorobot submergível e a funcionalização do dispositivo são descritos detalhadamente na Parte 1 deste artigo em duas partes, bem como em nosso recente trabalho 7. A técnica desenvolvida aqui pode pavimentar o Para o desenvolvimento de novos, altamente eficientes biorobots para várias aplicações, tais como entrega de carga. O processo de isolamento seguido neste estudo é semelhante ao processo descrito em um trabalho anterior 10 , bem como em trabalhos recentemente publicados 7 . Os métodos de microfabricação utilizados para fabricar os actuadores PDMS e os dispositivos biorobot são descritos em pormenor na Parte 1 deste manuscrito de duas partes. A seção de protocolo deste manuscrito descreve os passos envolvidos na semeadura de cardiomiócitos no PDMS fabricado aE o biorobot após a sua funcionalização com proteínas adesivas celulares.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos e reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cardiomiócitos (células cardíacas primárias)</td><td>Charles River</td><td>NA</td><td>Isolado de ratos Sprague Dawley neonatais de 2 dias de idade</td></tr><tr><td>Dulbecco' s águia modificada' s media (DMEM)</td><td>Hyclone Laboratories</td><td>16750-074</td><td>com 4500 mg/L de glicose, 4,0 mM de L-glutamina e 110 mg/L de piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Soro de Fetalclone III</td><td>Hyclone industries, GE</td><td>16777-240</td><td>Soro fetal de bovino (FBS)</td></tr><tr><td>Dulbecco' s tampão fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-G sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocolreto em pó (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>Solução (1 mg/ ml)</td></tr><tr><td>Kit de calceína-AM e homodímero de etídio-1 (ensaio vivo/morto)</td><td>Sondas moleculares</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Cálcio Fluo-4, AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14217</td><td>corante indicador de cálcio</td></tr><tr><td>Solução salina de Tyrodes</td><td>Solução tampão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td></tr><tr><td>Sondas moleculares</td><td>Plurônicas F-127</td><td>P3000MP</td><td>solução de surfactante não iônico-20% em dimetilsiloxano (DMSO)</td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica</td><td>15710</td> <td>do parafomaldeído de 16%</td><td>Cuidado: Tritão irritante e combustível</td></tr><tr><td>x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100 100 mL</td><td>de detergente de lise celular, (4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilenoglicol, t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol éter terc-octilfenílico)</td></tr> <tr><td>ProLong reagente antidesbotamento de ouro</td><td>Sondas moleculares</td><td>P10144</td><td>Agente de montagem</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td><td>Molecular Probes</td><td>A12381</td><td>Marcador de filamento de actina</td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho IgG (H + L) anticorpo secundário, Alexa Fluor 594 conjugado</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>pha</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conexina 43 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Marcador de junção gap</td></tr><tr><td>Troponina anticardíaca I anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab10231</td><td>Proteína contrátil</td></tr><tr><td>16% solução de paraformaldeído de grau EM</td><td>Microscopia eletrônica</td><td>100503-916</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Elsevier</td><td></td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Materiais e Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Thor Labs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>LED light tira</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Qualquer LED branco sem emissão de espectro</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Nikkon C2</td><td>NA</td><td>Microscópio confocal com conjunto de três filtros.</td></tr><tr><td>Lente de zoom</td><td>Infinity</td><td>Modelo# 252120</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>NA</td><td>Usado na Seção 4) para análise de atuadores biológicos.</td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>National Institute of Health</td><td>NA</td><td>Software de processamento de imagem baseado em Java. Usado na Seção 5) para análise de biorobôs. Software gratuito de processamento e análise de imagens em java. (https://imagej.nih.gov/ij/)</td></tr><tr><td>Thor Cam</td><td>Thor Labs</td><td>NA</td><td>Software operacional da câmera</td></tr></tbody></table>

atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante biorobot - parte 2

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Nos últimos anos, foram desenvolvidos dispositivos híbridos que consistem numa célula viva ou componente de tecido integrado com uma espinha dorsal mecânica sintética. Estes dispositivos, chamados biorobots, são alimentados apenas pela força gerada a partir da atividade contrátil do componente vivo e, devido às suas muitas vantagens inerentes, poderia ser uma alternativa aos robôs convencionais totalmente artificiais. Aqui, descrevemos os métodos para semear e caracterizar um atuador biológico e um biorobot que foi projetado, fabricado e funcionalizado na primeira parte deste artigo em duas partes. O actuador biológico fabricado e os dispositivos biorobot compostos por uma base de polidimetilsiloxano (PDMS) e um cantilever de película fina foram funcionalizados para ligação de células com fibronectina. Após a funcionalização, os cardiomiócitos de ratos neonatais foram semeados no braço cantilever PDMS a uma densidade elevada, resultando numa folha de células confluentes. Os dispositivos foram visualizados todos os dias eo movimento do cantiBraços de alavanca foi analisada. No segundo dia após a semeadura, observamos a flexão dos braços em consola devido às forças exercidas pelas células durante as contrações espontâneas. Após análise quantitativa da dobra em cantilever, observou-se um aumento gradual no stress superficial exercido pelas células à medida que amadureciam ao longo do tempo. Da mesma forma, observamos o movimento do biorobot devido à atuação do braço cantilever PDMS, que atuou como uma aleta. Após a quantificação dos perfis de natação dos dispositivos, foram observados vários modos de propulsão, que foram influenciados pelo ângulo de repouso da barbatana. A direção do movimento e a freqüência de batimento também foram determinadas pelo ângulo de repouso da barbatana, e observou-se uma velocidade máxima de natação de 142 μm / s. Neste artigo, descrevemos o procedimento para preencher os dispositivos fabricados com cardiomiócitos, bem como para a avaliação do atuador biológico e atividade biorobot.

O atuador biológico feito de um cantilever PDMS fino (25 μm de espessura) e cardiomiócitos constitui o núcleo do biorobot de natação, conforme mostrado na esquemática e captura de tela dos dispositivos na Figura 1 . As células começam a apresentar contracções após 24 h em cultura e a flexão dos braços em consola foi observada até ao dia 2. O perfil lateral do dispositivo foi registado todos os dias e o stress superficial foi quantificado a partir da dobra dos braços em c...

Neste estudo, um atuador biológico e um biorobot de natação auto-estabilizante com braços elastoméricos em cantilever funcionalizados são semeados com cardiomiócitos, cultivados e caracterizados por suas propriedades bioquímicas e biomecânicas ao longo do tempo.

Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

O objetivo geral deste estudo é povoar dispositivos microfabricados com células musculares cardíacas e caracterizar as propriedades bioquímicas e biomecânicas dessas células nesses dispositivos, bem como seu desempenho ao longo do tempo. O método descrito aqui pode ser facilmente modificado para outros experimentos que exijam adição de células em alta densidade em dispositivos microfabricados. A principal vantagem do bioatuador desenvolvido neste vídeo é que ele pode ser facilmente adaptado para quantificar forças de contração celular de qualquer outro tipo celular.Ele também pode ser utilizado para estudar as alterações nas características biomecânicas de células-tronco enquanto elas passam por diferenciação. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de semeadura celular são difíceis de aprender apenas por meio de descrições textuais. Elas precisam ser realizadas corretamente para garantir a adesão confluinte das células nos braços do cantilever, o que é essencial para a adequada função biológica.Quem demonstrará o procedimento será Neerajha Nagarajan do meu laboratório. Com o biorrobô, comece no frasco T25. Utilize um ímã para mantê-lo fixo na parte inferior do frasco.O ímã não é necessário para os atuadores biológicos, pois eles não se moverão devido ao peso da esfera de vidro na base. Enrole uma pequena folha de plástico quadrada para usar como funil e coloque o funil estéril sobre os atuadores nos biorrobôs. Ajuste o diâmetro na extremidade mais larga para encaixar no dispositivo e a altura para que se encaixe firmemente quando a tampa do frasco for apertada.Utilize um frasco separado para testar e ajustar o encaixe do funil. Um encaixe firme do funil garantirá que não haja vazamento das células para o restante do meio, conforme mencionado. Isso é essencial para proporcionar uma cobertura confluente do braço em balanço.Com o funil no lugar, ressuspenda os cardiomiócitos em DMEM completo em uma densidade de 16 milhões de células por mililitro e adicione lentamente 400 microlitros da suspensão sobre os dispositivos através de cada funil. Em seguida, mova lentamente os frascos de volta para o incubador sem perturbar os dispositivos ou os funis no interior. Deixe as células aderirem por 24 horas a 37 graus Celsius.Após o período de incubação, remova lentamente o funil. Lave suavemente as amostras com PBS e reponha cada frasco com 10 mililitros de DMEM completo fresco. Em seguida, remova o ímã do biorrobô para que fiquem flutuando e coloque os frascos de volta no incubador.Instale uma câmera equipada com uma lente zoom no incubador para visualizar os dispositivos em cultura. Em seguida, adicione uma fita de luz LED para usar como fonte de iluminação. Depois, conecte a câmera a um computador e abra o programa de imagem.Uma vez no programa, clique na imagem da câmera na guia Arquivo para abrir todas as opções da câmera e escolha a câmera conectada. Na lista de guias, selecione Visualização e foque manualmente a imagem ajustando o anel da lente. Em seguida, selecione o recorte da região de interesse no painel superior.Em seguida, desenhe manualmente um retângulo no quadro do vídeo delimitando o dispositivo atuador biológico e os braços em balanço para marcar a região de interesse. No caso de biorrobôs, capture toda a tela para registrar o movimento de natação do dispositivo. Em seguida, selecione Configurações da Câmera e defina a taxa de quadros ajustando a exposição e a proporção de pixels da imagem ao vivo.Defina as taxas de quadros em cerca de 30 quadros por segundo. Por fim, clique no botão de gravação para iniciar a gravação dos vídeos. Abra o software de programação clicando no ícone.Uma vez carregado, clique em Arquivo, Abrir e selecione o arquivo de script m para executar a análise de imagem. Certifique-se de que as imagens TIF gravadas e suas versões AVI estejam na mesma pasta do arquivo m e, em seguida, clique em Executar para rodar o script. Pressione Reproduzir para iniciar o programa real.Uma vez em execução, clique no botão Abrir e localize o arquivo TIF ou AVI que será analisado. Em seguida, clique no botão base. Selecione o ponto onde a alavanca se prende à base na parte superior e pressione Enter.Isso colocará um marcador quadrado na imagem para cada quadro, indicando a posição da base do cantilever. Em seguida, clique no botão de escala e depois clique manualmente em uma borda da esfera de vidro. Leve o ponteiro do mouse até o lado oposto da esfera de vidro e pressione Enter.Isso traçará uma linha que mede o diâmetro da esfera de vidro e relacionará o diâmetro aos pixels exibidos. Clique no botão Analisar. Em seguida, clique ao longo do cantiléver a uma pequena distância do primeiro marcador quadrado que representa a base do cantiléver.Continue clicando ao longo da alavanca, incluindo a ponta, e pressione Enter ao finalizar. Isso colocará um X em cada ponto clicado na alavanca. Por fim, verifique se o círculo sobreposto traça corretamente o perfil da alavanca.Se estiver correto, clique no botão do próximo quadro. Isso alternará para o próximo quadro no arquivo TIF. Repita este processo para todos os quadros.Após processar todos os quadros, clique no botão Exportar. Comece abrindo o software de análise de imagem e carregando o arquivo de vídeo do biorrobô nadador. Em seguida, abra o software de planilha eletrônica.No vídeo do biorrobô carregado, localize uma referência de tamanho, como a esfera de vidro. Use a ferramenta Reta para desenhar uma linha atravessando a esfera de vidro. Em seguida, clique em Analisar e selecione Definir Escala.Defina o campo Distância conhecida como 3.000 micrômetros e clique em OK. Escolha um ponto em um dispositivo que não oscile entre os quadros para servir como marcador e registre as coordenadas X e Y desse ponto na planilha. Volte à janela do software de análise de imagem e pressione a tecla de seta para a direita para avançar para o próximo quadro. Indique novamente o marcador e registre as novas coordenadas X e Y na planilha.Repita este processo para todos os quadros e utilize os dados para analisar o movimento do biorrobô conforme descrito no protocolo textual complementar. As tensões estáticas e dinâmicas do atuador foram extraídas da tensão na superfície a cada dia. A tensão estática é a tensão contrátil que as células exercem sobre a superfície no estado de repouso, e a tensão dinâmica é a tensão gerada pelas células na contração máxima.À medida que as células amadureciam em cultura, observou-se um aumento gradual das tensões estáticas e dinâmicas ao longo do tempo. Elas exibiram uma força máxima de tração celular de 50 milinewtons por metro e uma força máxima de contração de cerca de 165 milinewtons por metro no sexto dia. Paralelamente às tensões estáticas e dinâmicas, marcadores de maturação de cardiomiócitos, crescimento e expansão celular, e interconectividade celular também aumentaram até o sexto dia.Com base na análise do vídeo, aqui é apresentada a comparação da velocidade média de nado, frequência de batimento e distância percorrida por movimento para três biorrobôs com diferentes perfis de nado. Embora os biorrobôs verticais apresentem a menor frequência de batimento, eles exibiram a maior velocidade de nado e distância percorrida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como semear células musculares cardíacas em dispositivos microfabricados que possam atuar como atuadores biológicos e biorrobôs.O processo de aquisição de imagens e análise subsequente de dados descrito neste vídeo demonstra uma maneira conveniente de caracterizar o comportamento celular bem como o desempenho do dispositivo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a vida útil dos cardiomiócitos é limitada e que a atividade das células atinge seu pico no sexto dia. Após isso, ela diminui ao longo do tempo.

cardiac-muscle-cell-based-actuator-self-stabilizing-biorobot-part

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

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