Name: Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a rastrear degradação e secreção de plaquetas sob fluxo usando imagens de células vivas. Este método permite investigar conteúdos plaquetários em nível subcelular para pesquisa mecanicista em trombose e hemostasia.

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O CM reconhece o apoio financeiro da Organização Internacional de Pacientes para Deficiências de Inibidores de C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht e a Fundação Landsteiner para Pesquisa de Transfusão de Sangue (LSBR).

O Comitê de Ética Médica local do Centro Médico Universitário de Utrecht aprovou o desenho de sangue para fins de pesquisa ex vivo , incluindo aqueles deste estudo. 1. Preparação da solução <ol><li> Prepare um tampão de Tyrode do ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) por dissolução de HEPES 10 mM, Na2HPO4 0,5 mM, NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgSO4 1 mM e D- Glicose em água destilada. <ol><li> Faça duas variantes do buffer: ajuste os níveis de pH em 6,5 e em 7,4, respectivamente. Faça um novo buffer para cada dia de experimentos. Suplementar com prostaciclina a 10 ng / mL quando indicado. </li></ol></li><li> Prepare solução salina tamisada com TRIS (TBS) dissolvendo Tris 50 mM e NaCl 150 mM em água destilada e ajuste o pH para 9,0. </li><li> Prepare o citrato de ácido dextrose (ACD) dissolvendo citrato de tri-sódio 85 mM, ácido cítrico 71 mM e D-glucose 111 mM nissoÁgua cultivada. </li><li> Prepare uma solução fixadora adicionando 2% (v / v) de paraformaldeído (PFA) ao tampão HEPES Tyrode, pH 7,4. Aquecer para dissolver (50 - 70 ° C) e ajustar o pH para 7,4. Alíquota e armazene a -20 ° C. Descongelar a 37 ° C antes de usar. </li><li> Prepare o tampão de bloqueio dissolvendo albumina de soro humano (HSA) a 1% (m / v) no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4 </li><li> Faça uma solução de álcool polivinílico adicionando 4,8 g de álcool polivinílico a 12 g de glicerol e misture bem. Adicione 12 ml de água destilada e deixe-o em um rotador à temperatura ambiente durante a noite. <ol><li> Adicionar 24 mL de Tris-HCL 0,2 M, pH 8,5. Aquecer até 50 ° C enquanto se mistura durante 30 min. Adicione 1,25 g de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) e misture bem. Centrifugar a 1.500 xg por 5 min. Alíquota do sobrenadante (1 mL é suficiente para lâminas 15-20) e armazene a -20 ° C. Use as alíquotas uma vez. </li></ol></li></ol> 2. Preparação do vidro da tampa <ol><li> Descarte a tampaÓculos (25 x 50 mm 2 ) por incubação durante a noite em ácido cromossulfúrico não diluído. Enxaguar os óculos de cobertura com água destilada e secá-los durante a noite a 60 ° C no forno. </li><li> Aderir a uma tira de uma película de parafina (10 x 15 cm 2 ) em cima de um banco de laboratório com uma gota de água e remover o ar alisando a película de parafina. Pipetar 80 μL de gotas de 10 μg / mL de VWF ou 100 μg / mL de fibrinogênio na película de parafina. Coloque os óculos nas gotas; A solução de proteína se espalhará entre as duas superfícies para cobrir toda a parte traseira do vidro. Incubar durante 1,5 h à temperatura ambiente (RT). </li><li> Remova o filme de parafina e bloqueie os óculos de cobertura colocando-os, com o lado revestido para cima em uma placa de 4 poços com tampão de bloqueio. Incubar durante 1 h a 37 ° C ou durante a noite a 4 ° C. Como controle, bloqueie um copo de cobertura que não tenha sido revestido com VWF ou fibrinogênio. </li></ol> 3. Preparação de Plasma rico em plaquetas (PRP) </p&gt; <ol><li> Recolher sangue total citratado (concentração final: 0,32% de citrato de sódio (M / V)) por punção venosa. </li><li> Centrifugar o sangue por 15 min a 160 xg e RT sem freio. Recolher o sobrenadante ( ou seja, o PRP) com uma pipeta Pasteur de plástico. NOTA: Após a centrifugação, três camadas podem ser observadas (de cima para baixo): PRP, glóbulos brancos e glóbulos vermelhos. Certifique-se de não incluir as células brancas e vermelhas. Tipicamente, 3 mL de PRP podem ser coletados após centrifugação de um tubo de sangue de 9 ml. </li><li> Continue a seção 4 se o experimento for realizado com plaquetas lavadas. Se o PRP for desejado, continue com o próximo passo. </li><li> Após a coleta de PRP, centrifugar o restante do sangue (contendo o sedimento de células vermelhas) novamente por 10 min a 2.000 xg sem freio. Recolher o sobrenadante contendo o plasma pobre em plaquetas (PPP). NOTA: Tipicamente, podem ser coletados 2 mL após este segundo passo de centrifugação. </li><li> Contar o número da pOs anï¿½s do PRP num analisador de cï¿½ulas e diluï¿½-lo com o PPP (passo 3.4) a uma concentraï¿½o de 150 000 plaquetas / uL. NOTA: O volume total de PRP diluído depende da contagem de plaquetas do doador. As contagens de plaquetas variam amplamente entre os doadores e a diluição do PRP exige uma avaliação individual. As contagens de plaquetas são consideradas normais quando dentro de 150.000 e 450.000 plaquetas / μL. </li><li> Continue na seção 5. </li></ol> 4. Preparação de plaquetas lavadas <ol><li> Determine o volume médio de plaquetas (MPV) no PRP usando um analisador de células. NOTA: Este é um indicador de pré-ativação plaquetária 11 . Um MPV normal para plaquetas em repouso é 7.5-11.5 fL 11 . O MPV não deve aumentar em mais de 1,5 fL durante o procedimento de lavagem de plaquetas. </li><li> Adicione um volume 1/10 de ACD ao PRP para evitar a pré-ativação das plaquetas e centrifugue por 15 min a 400 xg e RT sem freio. Remova o suPernatant e re-suspende o grânulo cuidadosamente no tampão de HEPES Tyrode, pH 6,5, ao volume original de PRP. </li><li> Destilar uma alíquota de prostaciclina por adição de TBS a uma concentração de 10 μg / mL; Mantenha-o no gelo. </li><li> Para evitar a ativação plaquetária, adicione prostaciclina em uma concentração final de 10 ng / mL às plaquetas re-suspensas e centrifugue imediatamente por 15 min a 400 xg e RT sem freio. Remova o sobrenadante e volte a suspender o grânulo com cuidado no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. </li><li> Contar o número de plaquetas (passo 3.5) e determinar a alteração no MPV (passo 4.1) (o MPV não deve mudar mais de 1,5 fL). </li><li> Ajuste o número de plaquetas com o tampão HEPES Tyrode, pH 7,4, para uma concentração de 150 000 plaquetas / μL. Deixe as plaquetas se recuperar durante 30 minutos à RT antes dos experimentos. Use plaquetas lavadas para experiências dentro de 4 h após o isolamento. </li></ol> 5. Conjunto da câmara de fluxo 12 . Pode ser utilizada uma variedade de câmaras de fluxo produzidas comercialmente, desde que possam conter uma tampa de vidro, que preferencialmente é removível para análises adicionais. A câmara de fluxo utilizada para as experiências descritas é feita a partir de poli (metacrilato de metilo) para ajustar precisamente uma fase de inserção do microscópio. Contém uma entrada e saída ( Figura 1A - C ; 1, 2), bem como uma conexão a vácuo ( Figura 1A e C ; 3). Uma folha de silicone personalizada ( Figura 1A e D ; 4) é colocada no topo. Dois recortes formam canais de vácuo ( Figura 1A e D ; 5) para fixar firmemente a tampa do vidro ( Figura 1A ; 6). Um corte central forma o canal de fluxo ( Figura 1A </strong&gt; E D ; 7; 2,0 mm de largura e 0,125 mm de altura). A entrada e a saída estão conectadas ao canal de fluxo, e o vácuo está conectado ao canal de vácuo. <ol><li> Cubra a parte superior da câmara de fluxo com água destilada e coloque a folha de silicone personalizada com o lado liso na água. Flutue a folha na posição removendo o excesso de água enquanto mantém a folha na posição. NOTA: Esta folha de silicone é reutilizável (o silicone é conhecido por suas propriedades inertes); Geralmente, as plaquetas não foram observadas para anexar a ela. As folhas podem ser limpas com detergente e reutilizadas até que o material fique danificado ( isto é, rasgando, especialmente na área entre os canais). Geralmente, uma folha pode ser usada por 20 dias com múltiplas experiências por dia. </li><li> Incubar a câmara de fluxo durante 1 h a 60 ° C para evaporar a água residual para aderir firmemente a folha de silicone à câmara de fluxo. </li><li> Com uma pipeta Pasteur de plástico, adicione uma gota deHEPES Tyrode&#39;s buffer, pH 7,4, no canal de fluxo. Coloque o vidro da tampa (consulte a seção 2) com o lado revestido para baixo, no canal de fluxo. Conecte a bomba de vácuo à conexão de vácuo ( Figuras 1A e C ; 3). Aplique uma pressão de ~ 10 kPa. </li></ol> 6. Pré-coloração das plaquetas e preparação dos anticorpos <ol><li> Coloração de plaquetas <ol><li> Incubar as plaquetas lavadas com 10 μg / mL de DAPI durante 30 min a 37 ° C no escuro. Para lavar a DAPI não ligada e prevenir a ativação plaquetária, adicione prostaciclina a uma concentração final de 10 ng / mL e centrifugue imediatamente por 15 min a 400 xg e RT sem freio. </li><li> Reconstitua o sedimento de plaquetas no tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4, a uma concentração de plaquetas de 150 000 plaquetas / μL. </li></ol></li><li> Preparação de anticorpos <ol><li> Misture o anticorpo marcado com biotina com estreptoma marcada com AlexaTavidina numa proporção molar de 1: 1. Incubar durante um mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente antes da utilização (passo 7.6). NOTA: A eficiência da rotulagem da biotina pode variar entre diferentes lotes. Caso haja problemas com a visualização de moléculas alvo, as experiências de controle devem ser realizadas para confirmar a biotinilação bem sucedida, bem como as propriedades de ligação ao alvo do anticorpo biotinilado específico. </li></ol></li></ol> 7. Perfusão <ol><li> Comece o microscópio de fluorescência, bem como o software do microscópio. Use as configurações do microscópio listadas na Tabela 1 . NOTA: Inicie o microscópio e as configurações de gravação para a visualização e registro das plaquetas e os anticorpos e / ou corantes marcados fluorescentemente escolhidos, carregando um experimento apropriado no software do microscópio. Execute experiências de fluxo na RT. </li><li> Bloqueie a tubulação de entrada conectando uma seringa de 10 mL à tubulação e aspirando 1% de HSA bloNo buffer de entrada. Incube durante 15 minutos à TA. Enxaguar o tubo de entrada aspirando o tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4, no tubo de entrada. </li><li> Conecte o tubo de entrada bloqueado e o tubo de saída não tratado, ambos com um diâmetro de 1,02 mm e um comprimento de ~ 20-30 cm para a entrada e saída da câmara. Conecte uma seringa de 10 mL (ou menor volume para mais precisão) ao tubo de saída. Alimentar a bomba da seringa. NOTA: O diâmetro da seringa, em combinação com o caudal ajustado na bomba, determina o caudal volumétrico. Juntamente com a área de superfície do canal de fluxo, a taxa de cisalhamento pode ser calculada de acordo com a fórmula 13 abaixo. Por isso, é possível manipular a taxa de cisalhamento alterando o caudal da bomba da seringa ou alterando as dimensões do canal de fluxo. Uma taxa de cisalhamento de 800-1,600 s -1 tipicamente modelos para o fluxo sanguíneo arterial, enquanto 25 - 100 modelos s-1 para sangue venosofluxo. Para esta configuração, uma taxa de fluxo de 7,5 μL / min resulta em uma taxa de cisalhamento de 25 s -1 . Taxa de cisalhamento = 6Q / h 2 w em s -1 Em que: Q = taxa de fluxo volumétrico (mL / s), h = canal de altura (cm) (0,0125 cm, esta é a espessura da folha de silicone), w = largura do canal (cm) (0,2 cm nesta câmara). </li><li> Coloque uma gota de óleo de imersão em um objetivo de 100X (amplificação total de 1.000X) e monte a câmara no microscópio com a superfície de vidro para baixo. </li><li> Coloque a tubulação de entrada em um tubo contendo tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. Puxe manualmente o êmbolo da seringa conectado ao tubo de saída e puxe a solução através da câmara para remover o ar do sistema. Coloque a seringa na bomba de seringa ( Figura 1B e C ; 8) e execute a bomba brevemente para apertar o êmbolo e garantir um fluxo estável. </li><li> Adicionar anticorpos e / ou corantes à suspensão de plaquetas ou PRP, cuidadosamenteMisture com uma pipeta de plástico e transfira a mistura para um tubo de 1,5 mL. NOTA: Para uma perfusão típica de 30 min a taxa de cisalhamento 25 s-1 (7,5 μL / min), é necessário um mínimo de 225 μL de suspensão de plaquetas. Os anticorpos utilizados para os resultados representativos são mostrados na Tabela 2 . </li><li> Mova o tubo de entrada, enquanto aperta, do tampão HEPES Tyrode, pH 7,4, para um tubo de 1,5 mL contendo PRP ou as plaquetas lavadas e os anticorpos e / ou corantes ( Figura 1B e C ; 9). NOTA: É importante que, ao transferir a tubulação, a tubulação seja espremida (pressionando o ar) para evitar que o ar entre na tubulação. É possível tratar plaquetas aderentes com uma variedade de reagentes em um passo subsequente, movendo o tubo de entrada para outro tubo de maneira semelhante. Uma lista de reagentes potencialmente úteis é fornecida na Tabela 3 . </li><li> Selecione a &quot;visualização ao vivoN &quot;no software, focalize o microscópio na superfície do vidro revestido revestido e inicie a bomba a uma taxa de cisalhamento de 1.600 s-1 (484 μL / min) até que as plaquetas atinjam a câmara de fluxo. Neste momento, Reduzir a taxa de cisalhamento de volta para 25 s-1 alterando as configurações da bomba da seringa para um caudal de 7,5 μL / min. </li><li> Monitore a superfície do lado revestido do vidro da tampa, espere até que a primeira plaquetas comece a aderir, aponte o microscópio para esta plaquetas e comece a gravar iniciando a experiência no software. Consulte a Tabela 1 para as configurações de gravação usadas aqui. </li><li> Siga a gravação ao vivo visualmente. Após 30 min, pare a bomba da seringa. NOTA: Certifique-se de que as plaquetas permanecem em foco durante o curso da experiência. Normalmente, 20-30 plaquetas se ligam no campo de visão com uma ampliação de 1.000X; Isto é cerca de 2.000-3.000 plaquetas em todo o canal de fluxo. </li><li> Fixação usandoA câmara de fluxo (opcional). <ol><li> Quando o fluxo parou depois que a bomba da seringa é parada, transfira a tubulação de entrada (sem ar) para a solução fixadora. Reinicie a bomba e circule o tampão de fixação através do canal por um mínimo de 10 minutos com o mesmo caudal mencionado no passo 7.8. </li></ol></li><li> Remova a câmara do microscópio, limpe o óleo de imersão do vidro, desconecte o vácuo e remova cuidadosamente o vidro da tampa com uma agulha de 18 G. NOTA: Evite que o vidro da tampa quebre e danifique a folha de silicone. </li><li> Coloque o slide da tampa (com as células direcionadas para cima) em uma placa de 4 poços em cima de um tecido, pré-molhado com água destilada. NOTA: Isso evita que o vidro da tampa adira à superfície do poço e evita a secagem. </li><li> Pipetar 750 μL de solução fixadora no topo do vidro da tampa e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Caso as amostras não possam ser analisadas diretamente,Guarde-os em 0,5% de PFA (diluído pelo tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4) a 4 ° C para garantir uma fixação estável. Proceda à seção 8 para processar o vidro da tampa para imagens. </li><li> Após o uso, enxágue a câmara, a tubulação e a folha com água destilada e incube durante a noite em uma solução detergente. Antes da reutilização da câmara e de outros componentes, enxaguar com água destilada. </li><li> Salve os arquivos de dados brutos do microscópio contendo todos os metadados. Quando necessário, exporte os filmes para .MOV, h.264 comprimido ou .AVI descompactado. Guarde quadros separados como arquivos JPEG ou TIF. </li></ol> 8. Preparação de Amostras para Microscopia de Fluorescência Confocal <ol><li> Transfira os óculos de cobertura para placas novas de 4 poços e enxágue 5 vezes com 3 mL de tampão de HEPES Tyrode, pH 7,4. Adicione 3 mL / poço de tampão de bloqueio e incube durante 1 h à TA. </li><li> Remova o buffer de bloqueio; Adicionar 3 mL / poço de 0,15% de glicina (M / V) no tampão HEPES Tyrode, pH 7,4; E incubar durante 15 minutos em RT. </li><li> Retire a solução de glicina e lave 5 vezes em 3 mL / poço de tampão de bloqueio. Opcionalmente, adicione anticorpos conjugados com fluoróforos diluídos em tampão de bloqueio para coloração adicional. Incube durante 1 h à RT no escuro. </li><li> Lavar 5 vezes com tampão de bloqueio e 2 vezes com água destilada. Secar o vidro removendo o excesso de líquido com um tecido (das bordas para dentro), sem tocar nas células. </li><li> Pipetar 60 μL de solução de álcool polivinílico em uma lâmina de microscópio. Coloque a tampa de vidro, com as células para baixo, em cima da gota e deixe o álcool polivinílico se espalhar entre as duas superfícies. Incube durante a noite na RT no escuro. </li><li> Analisar as células por microscopia confocal 14 . </li><li> Salve os arquivos de dados brutos dos dados da pilha gravada contendo todos os metadados. Quando necessário, processe os arquivos de dados brutos nos arquivos MOV, h.264 comprimidos ou .AVI descompactados. Guarde pilhas separadas como arquivos JPEG ou TIF. </li></ol>

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<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Em todo o mundo, a trombose é uma das principais causas de morte e morbidade, e as plaquetas desempenham um papel central no seu desenvolvimento. Este trabalho descreve um método para a imagem de células vivas de degranulação de plaquetas sob fluxo. Em geral, assume-se que, quando as plaquetas se ativam, todos os conteúdos granulares são liberados diretamente na solução. Os resultados que acompanham sugerem que este não é necessariamente o caso. Durante a adesão e degranulação, as plaquetas retêm uma quantidade signific...

As plaquetas são células anucleadas que circulam na corrente sanguínea. Sua principal função é selar as rupturas vasculares em locais de lesão e prevenir a perda de sangue. Nesses locais de lesão, as fibras subendoteliais de colágeno tornam-se expostas e são posteriormente cobertas pela proteína multimérica, o fator von Willebrand (VWF). O VWF interage com as plaquetas em circulação em um mecanismo que depende do complexo de glicoproteína Ibα-IX-V na superfície celular 1 , diminuindo a velocidade das plaquetas. Isto é particularmente importante a altas taxas de cisalhamento. As plaquetas subseqüentemente sofrem alterações morfológicas enquanto recebem impulsos ativadores do colágeno. Isso leva a disseminação irreversível e, eventualmente, a agregação de plaquetas. Ambos os processos dependem da secreção de conteúdos de grânulos para facilitar a interferência plaquetária-plaquetas. Entre outros, os grânulos α plaquetários contêm fibrinogênio e VWF para auxiliar a adesão plaquetária e a ponteAs plaquetas juntas de uma maneira dependente da integrina. Os grânulos densos de plaquetas contêm compostos inorgânicos 2 , incluindo o difosfato de adenosina e cálcio (ADP), que ajudam a reforçar a ativação plaquetar. Além disso, as plaquetas contêm mediadores da inflamação (alérgica) 3 , proteínas de controle do complemento 4 e fatores de angiogênese 5 , 6 , aumentando as questões de se e como esses conteúdos são diferencialmente liberados em condições variáveis. Desde a década de 1980, o estudo da função plaquetária em modelos de fluxo tem sido valioso para a investigação de mecanismos trombóticos 7 . Desde então, muitos progressos técnicos foram feitos e os modelos de fluxo que incluem a formação de fibrina são atualmente desenvolvidos para testar o potencial hemostático de concentrados de plaquetas terapêuticas ex vivo 8 ou paraInvestigar a influência de distúrbios nas taxas de cisalhamento na morfologia do trombo 9 . As diferenças nos mecanismos moleculares e biológicos celulares que conduzem a adesão estável e formação de trombo fisiológico (hemostasia) versus formação de trombo patológico (trombose) podem ser muito sutis e motivar o desenvolvimento de modelos de fluxo que permitam a visualização em tempo real desses sub-celulares Processos. Um exemplo de um processo para o qual essa configuração seria valiosa é a (re) distribuição de polifosfato intracelular e o recrutamento de fatores de coagulação para descobrir o impacto dependente do tempo que isso tem na ultraestrutura da fibrina 10 . Os estudos geralmente são limitados a análises de ponto final. O objetivo principal do método descrito é habilitar a pesquisa visual em tempo real de processos subcelulares dinâmicos que ocorrem durante a ativação plaquetária sob fluxo.

<table><tbody><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostaciclina&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Citrato Tri-ssódico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Óculos de Cobertura</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, nº 1 = 0,13 - 0,16 mm de espessura.</td></tr><tr><td>Ácido cromossulfúrico (2% CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Fator de Von Willebrand (VWF)</td> <td>purificado</td><td></td><td></td>internamente</tr><tr><td>Fibrinogênio</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr> prato <tr><td>de 4 poços, não tratado</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Fração de Albumina de Soro Humano V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Tubos de coleta de sangue, 9 mL, 9NC Coagulação Citrato de Sódio 3.2%</td>Analisador <td>de células 455322</td><td></td> <td>Greiner Bio-One</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN analisador</td><td></td>de hematologia</tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>Aparelho Harvard, Holliston, MA</td><td>Aparelho Harvard 22</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL com 14,5 mm de diâmetro</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Seringa Luer-Lok</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotina&nbsp;</td><td>Abcam&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anti-CD62P-biotina&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de imersão</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de detergente</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Álcool polivinílico</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Cloridrato de Tris</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octano (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Ovino Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Filme Parafinn</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 in. x 125 ft. Rolo.</td></tr><tr><td>Folha de silicone não reforçada</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0,125 mm.</td></tr><tr><td>Folha de silicone cortada personalizada com canais de perfusão e vácuo</td><td>feita</td><td></td> internamente <td>Feita de folha de silicone não reforçada (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td> Microscópio fluorescente <td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>Equipado com luzes de excitação LED.</td></tr><tr><td>Software de microscópio</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>edição</td><td></td>azul</tr> agulha <tr><td>18 G (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de pasteur de plástico</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 mL não estéreis, graduados até 3 mL.</td></tr><tr><td>Tubo de silicone</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Diâmetro interno. x Diâmetro externo x Espessura da parede = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, bordas retificadas 45 °, extremidade fosca.</td></tr></tbody></table>

imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

As plaquetas são jogadores essenciais na hemostasia, a formação de trombos para selar as violações vasculares. Eles também estão envolvidos em trombose, a formação de trombos que obstruem a vasculatura e ferem órgãos, com conseqüências que ameaçam a vida. Isso motiva a pesquisa científica sobre a função plaquetária e o desenvolvimento de métodos para rastrear processos biológicos celulares, pois ocorrem em condições de fluxo. Uma variedade de modelos de fluxo estão disponíveis para o estudo da adesão e agregação de plaquetas, dois fenômenos-chave na biologia das plaquetas. Este trabalho descreve um método para estudar a degranulação de plaquetas em tempo real sob fluxo durante a ativação. O método faz uso de uma câmara de fluxo acoplada a uma configuração de bomba de seringa que é colocada sob um microscópio de fluorescência à base de LED de campo largo e invertido. A configuração descrita aqui permite a excitação simultânea de múltiplos fluoróforos que são administrados por anticorpos marcados com fluorescência ou fluorescentesCorantes. Após experiências de imagem de células vivas, os óculos de cobertura podem ser processados ​​e analisados ​​usando microscopia estática (por exemplo , microscopia confocal ou microscopia eletrônica de varredura).

A Figura 1 mostra imagens da câmara de fluxo e configuração experimental; A posição e as dimensões da folha de silício; E conexões de tubulação. A Figura 2 fornece detalhes sobre as dimensões da câmara de fluxo. A Figura 3 eo Filme 1 mostram uma série de imagens de adesão plaquetária e propagação em VWF imobilizado. CD63 é uma proteína transmembranar que é inserida na membrana de gr...

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

O objetivo geral deste experimento é acompanhar a desgranulação e a secreção de plaquetas sob fluxo utilizando imagem em tempo real de células vivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia das plaquetas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma investigação versátil do conteúdo plaquetário ao nível subcelular em células vivas.Embora este método possa fornecer informações sobre a função plaquetária, ele também pode ser aplicado a outros tipos celulares, como os mastócitos. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido a problemas com o isolamento de plaquetas na forma de pré-ativação. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método quando percebemos que a secreção plaquetária só poderia ser avaliada em estágios finais.Imagens em tempo real fornecem informações sobre a cinética de liberação dos grânulos plaquetários. O procedimento de isolamento de plaquetas será demonstrado por Silvia Pignatelli, aluna do nosso instituto. Em seguida, Arjan Barendrecht demonstrará os experimentos de imageamento em tempo real.Para começar, remova a gordura de lamínulas incubando-as durante a noite em ácido cromossulfúrico não diluído. No dia seguinte, enxágue-as com água destilada. Em seguida, coloque-as durante a noite a 60 graus Celsius em uma estufa, para secar.Em seguida, coloque uma gota de água sobre uma bancada de laboratório e adira uma tira de filme de parafina de 10 centímetros por 15 centímetros sobre a gota, removendo o ar entre a bancada e o filme. Em seguida, pipete gotas de 80 microlitros de fator de von Willebrand a 10 microgramas por mililitro ou de fibrinogênio a 100 microgramas por mililitro sobre o filme de parafina. Coloque as lamínulas secas sobre as gotas e incube-as por uma hora e meia à temperatura ambiente.Em seguida, adicione três mililitros de tampão bloqueador em cada poço de uma placa de quatro poços. Transfira as lamínulas com o lado revestido voltado para cima para poços individuais da placa. Incube-as durante a noite a quatro graus Celsius.Centrifugue nove mililitros de sangue total citratado por 15 minutos a 160 ×g sem freio. Em seguida, use uma pipeta de Pasteur de plástico para coletar o sobrenadante contendo o plasma rico em plaquetas. Adicione uma parte de dextrose ácida citrato a nove partes de plaquetas por volume para prevenir a pré-ativação plaquetária.Em seguida, centrifugue as plaquetas por 15 minutos a 400 vezes G sem freio. Depois, remova o sobrenadante, deixando um pellet de plaquetas. Em seguida, ressuspenda cuidadosamente o pellet em tampão HEPES-Tyrode com pH de 6,5 até o volume original da amostra de plaquetas.Em seguida, adicione prostaciclina às plaquetas ressuspendidas. Centrifugue imediatamente a amostra e, então, remova o sobrenadante. Ressuspenda cuidadosamente o pellet em tampão HEPES-Tyrode com pH de 7,4.Em seguida, coloque as plaquetas lavadas em um analisador de células e conte o número de plaquetas. Ajuste o número de plaquetas na amostra para uma concentração de 150.000 plaquetas por microlitro com tampão HEPES Tyrode em pH 7,4. Após a ressuspensão, deixe as plaquetas recuperarem por 30 minutos à temperatura ambiente antes do experimento.Cubra a parte superior da câmara de fluxo com água destilada e coloque uma folha de silicone personalizada com o lado liso voltado para baixo sobre a água. Posicione a folha flutuando, removendo a água em excesso sem deslocar a folha. Incube a câmara de fluxo por uma hora a 60 graus Celsius para evaporar a água residual e aderir firmemente a folha de silicone à câmara de fluxo.Com a pipeta de Pasteur de plástico, adicione uma gota de tampão HEPES Tyrode com pH de 7,4 sobre o canal de fluxo. Em seguida, posicione o cubre-objetos preparado com o lado revestido voltado para baixo sobre o canal de fluxo. Ligue a bomba de vácuo até uma pressão de aproximadamente 10 quilopascal e conecte a bomba de vácuo à entrada de vácuo da câmara de fluxo.Adicione 10 microgramas por mililitro do corante DAPI aos plaquetas lavadas e envolva o tubo contendo as plaquetas com papel alumínio. Em seguida, incube-as por 30 minutos a 37 graus Celsius. Para prevenir a ativação plaquetária, adicione prostaciclina numa concentração final de 10 nanogramas por mililitro e centrifugue imediatamente as plaquetas por 15 minutos a 400 vezes G sem usar a frenagem, para remover o DAPI não ligado.Reconstitua o pellet de plaquetas e o tampão HEPES-Tyrode com pH de 7,4 até o volume original, com uma concentração de 150.000 plaquetas por microlitro. Em seguida, ligue o microscópio de fluorescência e carregue o software do microscópio. Configure os parâmetros de imagem conforme descrito na tabela um do protocolo textual complementar.Bloqueie o tubo de entrada conectando uma seringa de 10 mililitros e aspirando o tampão de bloqueio para dentro do tubo de entrada. Incube por 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, lave o tubo de entrada aspirando tampão HEPES Tyrode 7,4 para dentro do tubo de entrada. Conecte o tubo de entrada bloqueado e o tubo de saída não tratado às entradas e saídas da câmara.Em seguida, conecte a seringa de 10 mililitros ao tubo de saída. Coloque uma gota de óleo de imersão em uma objetiva de 100 vezes e monte a câmara no microscópio com a superfície de vidro voltada para baixo. A seguir, coloque o tubo de entrada em um tubo contendo tampão HEPES Tyrode com pH de 7,4.Puxe manualmente o êmbolo da seringa conectada à tubulação de saída para fazer a solução passar pela câmara e remover o ar do sistema. Em seguida, coloque a seringa na bomba de infusão e acione a bomba brevemente para firmar o êmbolo e garantir um fluxo estável. Com o sistema de fluxo agora pronto, adicione os anticorpos e/ou corantes à suspensão de plaquetas e misture cuidadosamente.Em seguida, comprima o tubo de entrada e mova-o do tampão para o tubo contendo as plaquetas marcadas. Selecione a visualização em tempo real no software. Foque o microscópio na superfície do lamínula e inicie a bomba a 484 microlitros por minuto.Execute a bomba até que as plaquetas alcancem a câmara de fluxo. Em seguida, reduza a taxa de fluxo para 7,5 microlitros por minuto. Monitore a superfície do lamínula.Uma vez que a primeira plaqueta comece a aderir, foque o microscópio nessa plaqueta e inicie a gravação ativando o experimento no software. Grave por 30 minutos e, em seguida, pare a bomba de seringa. Salve os arquivos brutos do microscópio contendo todos os metadados.Quando necessário, exporte os vídeos no formato MOV H 264 comprimido ou AVI não comprimido. Salve quadros separados como arquivos JPEG ou TIF. Após concluir a aquisição de imagens, remova a câmara do microscópio, limpe o óleo de imersão do vidro, desconecte o vácuo e remova cuidadosamente o lamínula da câmara com uma agulha de 18 gauge.Coloque a lamínula com as células voltadas para cima em uma nova placa de quatro poços, sobre um papel de filtro pré-umedecido com água destilada. Em seguida, pipete 750 microlitros de uma solução fixadora sobre a lamínula e incube por uma hora à temperatura ambiente, no escuro. Caso as amostras não possam ser analisadas diretamente, armazene-as em paraformaldeído 0,5% a quatro graus Celsius para garantir uma fixação estável.Isso mostra a série temporal da adesão e expansão de plaquetas em lâminas de vidro revestidas com fator de von Willebrand imobilizado. Mostrado em verde está o CD63, uma proteína transmembranar que é mobilizada para a superfície plaquetária de maneira dependente do tempo. De forma semelhante, mostrado em laranja, a P-selectina também é uma proteína transmembranar inserida na membrana dos grânulos alfa intracelulares que retém plaquetas.Após um experimento de fluxo, a microscopia de fluorescência confocal pode ser utilizada para produzir uma série de inclinação da adesão plaquetária. Aqui, observa-se que o CD63 está localizado principalmente no granulomero central, enquanto a P-selectina está distribuída por todo o corpo celular e parece concentrada nas bordas. Nestes experimentos, plaquetas, que não possuem DNA nuclear, foram pré-incubadas com DAPI, que aparece em azul.Neste caso, o DAPI cora os polifosfatos e os grânulos densos. A coloração verde que aparece posteriormente indica a mobilização dependente do tempo do CD63 para a superfície das plaquetas. Apesar dos sinais claros de liberação dos grânulos densos, a análise em nível de célula única mostra que o polifosfato é retido dentro ou na superfície externa dessas plaquetas.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em seis horas para quatro experimentos de fluxo individuais. Ao tentar este procedimento, é importante prevenir a pré-ativação das plaquetas. Isso pode ser alcançado por meio da manipulação cuidadosa da suspensão celular.Após este procedimento, outros métodos, como a microscopia confocal, podem ser utilizados para obter uma compreensão adicional da distribuição tridimensional de moléculas-alvo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a função plaquetária sob fluxo em nível de célula única.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A cascata de adesão de plaquetas ocorre na presença de fluxo de cisalhamento, não um fator contabilizado em convencional (estática) bem-placa ensaios. Este artigo relata um ensaio de agregação plaquetária, utilizando um formato de prato bem-microfluídicos para emular condições fisiológicas do fluxo de cisalhamento.

Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

Aqui descrevemos uma técnica experimental de microscopia de fluorescência intravital para visualizar heterotípicos plaquetas neutrófilos interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos. Esta tecnologia microscópico será valiosa para estudar o mecanismo molecular da doença vascular e para testar agentes farmacológicos, em condições fisiopatológicas.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Nós descrevemos um método da em-solução para aplicar a tesoura uniforme aos receptores de superfície da plaqueta usando o viscometry da cone-placa. Esse método também pode ser usado de forma mais ampla para aplicar cisalhamento a outros tipos de células e fragmentos de células e não precisa direcionar um par de receptor de ligante específico.

Um ensaio de cisalhamento uniforme para receptores de superfície de células e plaquetas humanas através de Viscometry de cone-Plate

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

A formação de plaquetas pró-coagulantes tem sido correlacionada com um risco aumentado de trombose. Apresenta-se aqui um protocolo preciso para isolar plaquetas lavadas do sangue humano, destinado a quantificar a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas, que são características distintivas das plaquetas pró-coagulantes.

Caracterização de plaquetas pró-coagulantes medindo a exposição à fosfatidilserina e a liberação de microvesículas de plaquetas purificadas humanas

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

A citometria de fluxo multicolorida para plaquetas pode identificar novos subtipos de plaquetas dentro de subpopulações clássicas de plaquetas, como plaquetas em repouso, agregatórias, pró-coagulantes e apoptóticas. Isso permite a comparação de diferentes padrões de subpopulação induzidos por vários agonistas plaquetários. Aqui, um procedimento para estabelecer um painel de citometria de fluxo multicolorido é descrito em detalhes.

Análise de subpopulações plaquetárias por citometria de fluxo multicolorida

Aprenda a rastrear degradação e secreção de plaquetas sob fluxo usando imagens de células vivas. Este método permite investigar conteúdos plaquetários em nível subcelular para pesquisa mecanicista em trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

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