Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

O objetivo deste estudo de biossensor é comparar a capacidade das quatro plataformas de biossensores usadas rotineiramente de fornecer dados cinéticos de qualidade e fornecer insights sobre desafios técnicos e considerações em projetos experimentais para avaliar interações anticorpo-antígeno de alta afinidade. Este estudo responde a questões-chave no campo da descoberta de medicamentos para a seleção de plataformas de biossensores e formatos de ensaio que permitem os resultados mais confiáveis ao avaliar candidatos a anticorpos terapêuticos. A principal vantagem deste estudo é que ele fornece uma comparação direta e abrangente das várias plataformas de biossensores, no que diz respeito à consistência dos dados, qualidade e eficiência operacional.

A demonstração em vídeo dos quatro protocolos é fundamental, pois ajuda novos usuários com pouca experiência prática a aprender como configurar experimentos nesses instrumentos. Para medições cinéticas no Biacore T100, clique em Arquivo, Abrir novo método e abra o arquivo do método. Revise os parâmetros no método.

Em Tipos de ciclo, defina o tempo de contato como 220 segundos para a captura 1 sobre o caminho de fluxo 2, 110 segundos para a captura 2 sobre o caminho de fluxo 3 e 55 segundos para a captura 3 sobre o caminho de fluxo 4. A vazão é de 10 microlitros por minuto para todos os ciclos de captura. Selecione Sample 1 e verifique sample solução como uma variável.

Em seguida, defina o tempo de contato para 600 segundos e o tempo de dissociação para 2.700 segundos no caminho de fluxo 1, 2, 3, 4. A vazão é definida para 30 microlitros por minuto. Em seguida, selecione Regeneração 1, insira glicina HCl pH 1,5 no campo de solução e defina o tempo de contato para 20 segundos no caminho de fluxo 1, 2, 3, 4.

Em Configurações variáveis, insira concentrações de titulação duplas de 100 nanomolares a 6,25 nanomolares para o ciclo 1-3, 50 nanomolares a 3,12 nanomolares para o ciclo 4-8 e 5 nanomolares a 0,323 nanomolares para o ciclo 9-10. Em Setup Run, escolha o caminho do fluxo de detecção 2-1, 3-1, 4-1 e clique em Avançar. Verifique o prime antes de executar e clique em avançar novamente.

Selecione Rack de amostras e reagentes 1 e defina o local para os reagentes. Pipete os reagentes nos frascos de amostra individuais de acordo e insira o rack no instrumento. Clique em Ejetar rack para abrir a porta do compartimento da bandeja de amostras e, em seguida, insira o rack de amostras no instrumento.

Em seguida, clique em Iniciar e insira um nome de experimento a ser salvo para iniciar a execução. Para as medições cinéticas no ProteOn XPR36, comece a imobilização selecionando Protocolos e, em seguida, Amostras. Defina EDC/Sulfo-NHS como ativador nos poços H1-H6, proteína A/G como ligante em G1-G6, etanolamina como desativador em F1-F6, glicina como regenerador em E1-E6, PBS-T-EDTA como branco em D1-D6, amostra de anticorpo monoclonal X como ligante em C1-C6 e PCSK9 humano como analito nos poços B1-B6.

Selecione Etapas e clique duas vezes em Imobilização no editor de protocolo. As etapas incluem três injeções horizontais subsequentes de EDC / Sulfo-NHS, proteína A / G e uma etanolamina molar. Cada injeção deve ter uma vazão de 30 microlitros por minuto e um tempo de contato de 300 segundos.

Em seguida, clique em Regenerar. Injete três pulsos de glicina de 18 segundos a 100 microlitros por minuto nas direções horizontal e vertical. Em seguida, dois pulsos de 60 segundos de PBS-T-EDTA a 25 microlitros por minuto, também em ambas as direções.

Em seguida, clique em Ligante e injete o anticorpo monoclonal 1, anticorpo monoclonal 2 na direção vertical, usando uma taxa de fluxo de 25 microlitros por minuto e um tempo de contato de 160 segundos. Depois de clicar em Analito, injete cinco concentrações de PCSK9 humano em um buffer em branco em seis canais horizontais simultaneamente. Use 40 microlitros por minuto por 600 segundos de tempo de associação, seguidos por 2.700 segundos de tempo de dissociação.

Em seguida, clique em Regenerar e injete dois pulsos de glicina de 18 segundos a 100 microlitros por minuto nas direções horizontal e vertical. Em seguida, prepare as amostras e reagentes em uma placa de 96 poços de acordo com as posições de reagente definidas. Transfira a placa para o instrumento e clique na guia Executar, selecione o protocolo e clique em Iniciar.

A injeção paralela de seis agulhas no registro de dados experimentais ao vivo é demonstrada. Para as medições cinéticas no Octeto RED384, configure o método experimental clicando primeiro em Experimento, seguido por Assistente de Novo Experimento, Novo Experimento Cinético e, em seguida, Cinética Básica no software de aquisição de dados. Em seguida, clique em Modificar placas e altere 96 poços para 384 poços na placa 1 e na placa 2.

Defina os tipos e posições de amostra na placa, conforme descrito no protocolo de texto. Navegue até a definição do ensaio para definir a configuração experimental. A configuração experimental é definida como um tempo de linha de base de 30 segundos, um tempo de regeneração de 30 segundos, um tempo de equilíbrio de 18 segundos, uma carga com um tempo de 200 segundos, um tempo de associação de 500 segundos e um tempo de dissociação de 1.800 segundos.

A velocidade de agitação é definida para 1.000 RPM. Para adicionar as etapas à lista de etapas do ensaio, primeiro clique em uma etapa e, em seguida, clique nos poços localizados na amostra ou na placa de reagente. Primeiro, insira as instruções de regeneração de equilíbrio para pré-condicionar os sensores de captura Fc anti-humanos por três ciclos de mergulhos de 15 segundos na glicina alternados com mergulhos de 15 segundos em 1XKB.

Em seguida, insira as instruções de carregamento para capturar as amostras de anticorpos monoclonais nos sensores de captura Fc anti-humanos por 200 segundos. Em seguida, insira as instruções de linha de base para estabelecer o sinal de interferometria de biocamada por 60 segundos antes da etapa de associação. Insira a etapa de associação para mergulhar os sensores em poços contendo concentrações variadas de PCSK9 humano por um período de associação de 500 segundos.

Entre na etapa de dissociação para mergulhar os sensores ligados a PCSK9 em novos poços de 1XKB por um período de dissociação de 1.800 segundos. Finalmente, para a etapa de regeneração, mergulhe os sensores ligados ao anticorpo monoclonal PCSK9 em poços de glicina com dois pulsos de 18 segundos entre cada ciclo de ligação. Vá para Revisar Experimentos, deslize pelas etapas e clique no botão verde de abertura para abrir o compartimento de amostra.

Transfira as placas de amostra para o instrumento. Navegue até Executar experimentos, insira um tempo de atraso de 60 segundos e agite a placa de amostra enquanto espera. Defina a temperatura da placa para 25 graus Celsius, insira o nome da execução do experimento e pressione Go.Live a coleta de dados é mostrada aqui.

Para medições cinéticas de vários ciclos no IBIS-MX96, instale o chip do sensor no microobservador de fluxo contínuo. Abra o software CFM2.0 e clique em Configurações de carga e 96 Amine Couple. Coloque as duas placas de amostra e reagente na impressora CFM.

Para criar a matriz de anticorpos, pressione Executar para iniciar a impressora e entregar o EDC/Sulfo-NHS na metade superior da placa reagente ao sensor usando 48 microcanais e alterne-os sobre a superfície do sensor por cinco minutos. Entregue as amostras de anticorpos monoclonais na metade superior da placa de origem ao sensor e alterne-as pelas superfícies ativadas por 10 minutos. Em seguida, aplique o tampão de imobilização de um tubo cônico de 50 mililitros sobre a superfície do anticorpo por cinco minutos.

Encaixe o chip do sensor impresso no instrumento. No software de controle, clique em Arquivo, Abrir medição, Medição existente e selecione o arquivo de método. Transfira o chip do sensor impresso para o instrumento.

No menu geral, selecione G-System Prime em Script completo do sistema. Em seguida, selecione G-Quench para desativar as superfícies de anticorpos monoclonais injetando 150 microlitros de etanolamina molar. Em Ciclo de análise, selecione Execução padrão A-AP em Scripts IBIS.

Defina 1,0 minutos para a linha de base, 10,0 minutos para associação e 90 etapas para dissociação na velocidade de oito microlitros por segundo. Dentro dos ciclos, injete PCSK9 humano uma concentração de cada vez, após cinco injeções de tampão. Regenere as superfícies do anticorpo monoclonal com glicina entre cada ciclo de ligação.

Sensorgramas de ligação registrados em sobreposições de ajuste de modelo cinético um para um são mostrados para os anticorpos que interagem com PCSK9 humano em quatro instrumentos. Os perfis de ligação dos anticorpos em densidades múltiplas são semelhantes entre os instrumentos. Embora as constantes de taxa associadas a cada um dos anticorpos variassem entre os instrumentos, suas ordens de classificação permaneceram praticamente as mesmas.

A reprodutibilidade e consistência das afinidades nas taxas cinéticas em múltiplas superfícies de anticorpos foram investigadas. Como mostrado aqui, uma forte linearidade foi observada para todas as constantes de taxa geradas usando o Biacore T100 e o ProteOn XPR36. No entanto, as constantes de taxa geradas pelo Octeto RED384 foram menos lineares devido a flutuações em algumas das taxas off.

Isso foi potencialmente causado por evaporações de amostras ao longo do tempo na microplaca. As constantes de taxa geradas pelo IBIS-MX96 também foram menos lineares devido a flutuações nas heterogeneidades da superfície. As atividades de ligação de anticorpos associadas à maioria dos sistemas foram consistentes, enquanto uma atividade aproximadamente dez vezes menor foi observada para o método acoplado a amina do IBIS-MX96.

Isso foi possivelmente devido à inativação de anticorpos ou à geração de orientações de anticorpos que não eram condutoras para a ligação ao antígeno. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar experimentos em cada uma das quatro plataformas de biossensores e como selecionar a tecnologia de biossensor apropriada para seu próprio propósito de pesquisa. Nosso estudo comparativo mostra que cada plataforma de biossensor tem suas próprias vantagens e desvantagens.

Apesar de certas limitações sistemáticas inerentes à instrumentação, a ordem direta das constantes de taxa de associação e dissociação foi altamente correlacionada entre esses instrumentos. Para efeitos de classificação dos candidatos, partindo do princípio de que o número de amostras e a quantidade de materiais não são factores limitativos, pode ser utilizado qualquer um destes instrumentos, uma vez que podem diferenciar os anticorpos de forma comparável, independentemente do instrumento de importação. Há uma compensação entre a confiabilidade dos dados e a taxa de transferência da amostra.

O Biacore T100, seguido pelo ProteOn XPR36R, exibiu a melhor qualidade e consistência de dados. Considerando que o Octet RED384 e o IBIS-MX96 demonstram alta flexibilidade e taxa de transferência com compromissos na precisão e consistência dos dados. Para estudos que exigem detecção sensível e confiável, o Biacore T100 ou o ProteOn XPR36 são os mais adequados.

Para estudos em que a velocidade é um fator crítico e um grande número de amostras está envolvido, Octet Red384 ou IBIS-MX96 é preferível. Instrumentos com fluido de fluxo contínuo X fornecem dados de alta qualidade para resolver interações com taxas de dissociação lentas. A principal limitação do instrumento BRI fluid ex-a-fray é a evaporação da amostra ao longo do tempo na microplaca, o que pode resultar em desvio para cima, comprometendo a precisão dos dados.