Name: Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Aprenda a medir a cinética de ligação anticorpo-antigénio de alta afinidade utilizando quatro plataformas de biosensor. Este estudo compara Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384 e IBIS-MX96 para descoberta de fármacos.

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Os autores agradecem Noah Ditto e Adam Miles de assistência técnica no IBIS MX96.

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</ol>

taxas de publicação do video-artigo foram pagos pela Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Nosso estudo de comparação head-to-head mostra que cada plataforma biosensor tem suas próprias forças e fraquezas. Embora os perfis de ligação dos anticorpos são semelhantes por comparação visual (Figuras 3 - 6), e a ordem de classificação das constantes cinéticas adquiridos são altamente consistentes entre os instrumentos (Figura 7), os nossos resultados mostram que os instrumentos SPR-base com fluidos de fluxo contínuo) são melhores em resolver interacções de elevada afinidade com taxas de dissociação lentas. Deriva para cima durante a fase de dissociação é observado em conjuntos de dados (por exemplo, mAb 2, 5 mAb, e o mAb 9; Figura 5) gerado pelo BLI fluídica-livres instrumento. Esta descoberta pode ser atribuído, em grande parte para a evaporação da amostra ao longo do tempo na microplaca, que é uma limitação principal do sistema. Com esta limitação inerente, o tempo experimental é também restringido a menos de 12 h; os ensaios foram, por conseguinte, programado com shvezes Orter (associação 500 s e 30 min de dissociação) em comparação com os das outras plataformas (10 min de associação e de dissociação de 45 min). No entanto, o encurtamento do tempo experimental não pareceu atenuar o impacto da evaporação sobre a qualidade dos dados / consistência, como as constantes de velocidade gerado pelo instrumento baseado no BLI mostrar menos linearidade como um resultado de flutuações em alguns dos off-rates (Figura 8C ). Além disso a evaporação de exemplo, diferenças nos reagentes de captura utilizados podem ter também contribuiu para as diferenças entre os resultados obtidos. Enquanto protea A / G foi utilizada em todas as três plataformas SPR fluídicos baseada, sensores AHC foram usadas na plataforma BLI não-fluidos. Uma vez que a proteína A / G é provável que tenha uma afinidade mais fraca para os mAbs que se o AHC, uma superfície de biossensor baseado em anticorpos, os off-rates do complexo mAb-antigénio a partir das / superfícies proteína A G pode artificialmente aparece mais rapidamente do que aqueles obtida a partir da superfície de AHC. Esta possibilidade é suportado by os dados experimentais que mostram que os valores de taxa de dissociao gerados pela plataforma BLI foram consistentemente mais baixos do que os obtidos a partir de outros instrumentos (Figura 7, linha vermelha). No entanto, a plataforma BLI tem vantagens diferentes sobre as outras plataformas. Por exemplo, é altamente flexível no que diz respeito à escolha do sensor e a configuração do ensaio devido às diferentes sensores pré-revestido para uso imediato. Nas nossas experiências, a utilização dos sensores AHC eliminou a necessidade de etapas de imobilização de ligando, reduzindo o tempo de preparação. Além disso, a plataforma BLI requer muito menos manutenção em comparação com as outras plataformas fluidos SPR, que apresentam configurações de tubos e interruptor valor complicados. Esta característica é uma vantagem para as experiências envolvendo amostras em bruto, que podem causar problemas de entupimento e de contaminação. Como a demanda para a identificação eficiente, rápida, e precisa de candidatos terapêuticos aumenta, a necessidade de biosensor rendimento está também a aumentar. Entre as quatro plataformas de biossensor, a taxa de transferência do biossensor capaz de 96-ligando de impressão de matriz é o mais elevado, seguido pelo biossensor acoplado a um formato de 36-ligando de entrecruzamento e o biossensor baseado no BLI com leitura simultânea de 16 canais, que em última análise aumentar o número de interacções medidos num único ciclo de atadura para 96, 36 e 16, respectivamente. Estas capacidades são rendimento significativamente mais elevado do que a da plataforma SPR tradicional, que é limitada por ter apenas quatro células de fluxo ligadas por um único fluxo de série. Uma vez que as nossas experiências envolveram um conjunto relativamente pequeno de amostra de 10 mAbs avaliados em várias densidades de superfície com tempos de dissociação longa, os débitos instrumentais desempenhou um papel moderado na determinação da eficiência das experiências. Não houve diferenças significativas nos tempos experimentais das três plataformas de alto rendimento, e em todos os casos, os ensaios foram concluídos em um dia. Por outro lado, os experimentos tradicionais SPR fluxo de série necessário 3 dias para ser concluído, apesar da automação pé-away de aquisição de dados após a instalação. Em outros estudos que envolvem um grande número de amostras (isto é, na ordem das centenas ou milhares), para fins de classificação off-rate / rastreio cinética ou binning epitopo, a taxa de transferência torna-se um factor crítico. Embora a taxa de transferência no IBIS MX96 é ordens de magnitude mais elevada do que a dos outros biossensores e é portanto uma escolha ideal para esses fins, ele tem alguns inconvenientes. Em particular, a impressão de matriz pelo CFM mostra grandes inconsistências na superfície (Figura 1) e reduzida reprodutibilidade dos dados (Figura 8D e 8E). Para as medições cinéticas exactas, a quantidade de ligando na superfície do biossensor é um parâmetro crítico que deve ser controlado para assegurar que as respostas de ligação não são perturbados por factores secundários tais comotransferência de massa ou impedimento. Para o Biacore T100 e Proteon XPR36, os níveis óptima R L foram determinadas com base no cálculo de valores padrão no máximo conjunto R, tal como descrito no artigo de investigação 17. Por outro lado, para as plataformas Octeto RED384 e IBIS MX96, os níveis de captura de mAb foram obtidos empiricamente utilizando uma série de anticorpos 2 vezes diluídas em série em tempos constantes. A falta de conhecimentos ou de controlo do passo de captura resultou em uma superfície de alta densidade e os sinais de altos de ligação de resposta (Figura 2) que pode ter comprometido a precisão das constantes cinéticas. Além disso, a separação da impressora a partir do detector de SPR também apresenta um desafio ao realizar várias medições de ciclo de ligação envolvendo regenerações. A única maneira de fazer a configuração multi-cinética do ciclo foi através de acoplamento de amina directa dos mAbs, em oposição a capturar pelo mAb Fc pela proteína A imobilizada / Lsuperfície nas outras três plataformas de biossensor. Como resultado, uma experiência de regeneração de aferição adicional foi necessário para determinar as condições de regeneração óptimas. O resultado desta configuração foi associada a uma actividade de superfície observado 90% inferior ~ em comparação com o método de captura de Fc (Figura 9), para além de um tempo mais longo experimental. Para executar o método de captura de Fc, foi adoptada uma abordagem cinética de ciclo único alternativa. Esta abordagem envolve a injecção sequencial de analito em concentrações crescentes, sem regeneração entre cada injecção (Figura 2). Esta abordagem altamente conveniente, mas menos vulgarmente aplicados não só reduziu o tempo experimental e a redução do consumo de reagente, mas também produzido constantes cinéticas altamente semelhantes aos de outros biossensores (Figura 7). Portanto, a aplicação desta abordagem cinética de ciclo único ultrapassa a limitação inerente configuração do instrumento e apresenta umaoportunidade para a obtenção de alta resolução das constantes cinéticas de um modo de elevado rendimento. Apesar do rendimento ser uma grande limitação no Biacore T100, nossos resultados mostram coletivamente que gerou os dados mais consistentes com a mais alta qualidade. Isto foi seguido pela Proteon XPR36, que tem ~ 10 vezes maior rendimento. A sua capacidade para gerar dados de alta qualidade torna-se uma vantagem ao caracterizar interacções anticorpo-antigénio de alta afinidade que podem ser tecnicamente difícil quando os limites de detecção dos instrumentos são atingidos. Enquanto as limitações sistemáticas na instrumentação do octeto RED384 dificultam a medição precisa das constantes de velocidade de dissociação (ou seja, ficar aquém da sensibilidade para resolver decaimento de sinal suficiente para lenta off-rates), tanto o Biacore T100 e Proteon XPR36 pode fornecer sensível e confiável detecção para a diferenciação.

A aquisição de parâmetros cinéticos confiáveis para caracterizar as interações anticorpo-antígeno é um componente essencial do processo de descoberta e desenvolvimento de medicamentos1. Os biossensores de Ressonância Plasmônica de Superfície Óptica (SPR), o "padrão ouro" para detecção em tempo real dessas interações, têm sido usados por aproximadamente duas décadas para permitir a seleção precoce de candidatos a anticorpos terapêuticos que atendem aos critérios2,3. Além de fornecer uma classificação de afinidade de candidatos a anticorpos pela triagem de ligação rápida de sobrenadantes brutos4, e determinações cinéticas rigorosas de preparações purificadas5, os biossensores podem diferenciar ainda mais a atividade funcional dos candidatos líderes por meio de estudos de binning de epítopos6,7. 
Para atender à crescente demanda de produtos à base de anticorpos para várias indicações terapêuticas8, uma ampla variedade de instrumentos biossensores inovadores foi desenvolvida nos últimos anos que aumentam a eficiência da identificação e caracterização de candidatos9,10. Esses instrumentos diferem no projeto de configuração de canais microfluídicos e/ou nos princípios ópticos envolvidos na detecção de interações biomoleculares. Especificamente, o Octeto RED38411, ProteOn XPR3612 e IBIS MX967 expandiram o número de interações medidas em um único ciclo de ligação para 16, 36 e 96, respectivamente, representando melhorias significativas na taxa de transferência em relação à plataforma Biacore tradicional. Embora essas várias plataformas de biossensores forneçam dados cinéticos essenciais para caracterizar as interações anticorpo-antígeno, elas diferem na configuração experimental e nos procedimentos operacionais devido a variações nas configurações instrumentais. Por exemplo, na plataforma de matriz de imagem SPR do IBIS MX96, a etapa de imobilização do ligante multiplex é realizada em modo off-line em um dispositivo de impressão externo separado do detector7,13; Em contraste, as outras três plataformas de biossensores utilizam uma configuração "tudo-em-um", onde a adição de componente na superfície do sensor, seja o reagente de ativação, ligante ou analito, é registrada em tempo real e por meio de comandos pré-programados em ordem sequencial. No Octeto RED384, uma característica única desta plataforma baseada em Interferometria BioLayer (BLI) é a disponibilidade de biossensores de fibra óptica pré-revestidos para uso imediato de "dip-and-read14, eliminando a necessidade de preparação da superfície do ligante e etapas de iniciação/condicionamento, que geralmente são necessárias para os chips sensores em plataformas baseadas em SPR. O design livre de fluidos deste instrumento também simplifica a mecânica e evita preocupações com entupimento e contaminação ao lidar com amostras brutas. Com o novo design fluídico cruzado 6 x 6 no ProteOn XPR36, uma abordagem cinética "one-shot" pode ser implementada alternando os canais de fluxo entre as direções horizontal e vertical para criar 36 pontos de interação15. Em vez de avaliar a cinética de ligação uma concentração de ligante ou analito por vez, como é feito na plataforma tradicional de fluxo serial Biacore T100, essa abordagem oferece a capacidade de monitorar até 36 interações diferentes simultaneamente em um único ciclo de ligação. 
Apesar de suas diferenças, essas quatro plataformas de biossensores são amplamente utilizadas por muitos laboratórios em todo o mundo. Para novos usuários com pouca experiência prática em biossensores, decidir qual instrumento usar pode ser uma tarefa desafiadora, dadas as diferenças no design instrumental. Para determinar o instrumento mais apropriado para seus propósitos de pesquisa, fatores como qualidade dos dados, consistência de desempenho, rendimento, facilidade de operação e consumo de material precisam ser considerados coletivamente. Embora vários estudos de referência tenham explorado a variabilidade das constantes de taxa cinética obtidas de vários laboratórios e biossensores5,16, um estudo comparativo comparativo publicado recentemente aborda ainda mais os fatores sistemáticos que influenciam a confiabilidade dos dados do ponto de vista do desempenho instrumental17,18. Os protocolos fornecidos neste vídeo enfocam a configuração e os procedimentos experimentais em detalhes e são acompanhados pelo artigo de pesquisa intitulado "Comparação de plataformas de biossensores na avaliação da cinética de ligação anticorpo-antígeno de alta afinidade" 17. Esses protocolos destinam-se não apenas a ajudar novos usuários de biossensores a implementar esses instrumentos para fins de pesquisa, mas também a fornecer informações adicionais para os usuários atuais de biossensores em relação aos desafios técnicos e considerações em projetos experimentais para avaliar interações anticorpo-antígeno de alta afinidade.

<table><tbody><tr><td>Sistema Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>O sistema T100 foi atualizado para o chip sensor T200</td></tr><tr><td>CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAavaliação&nbsp;</td>Software de Controle Biacore T100 <td>Versão 4.1</td> <td>da GE Healthcare</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>O software de controle T100 foi atualizado para o Kit de Acoplamento de Amina T200</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>Contém: 750 mg de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), 115 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS), 10,5 mL de 1,0 M de etanolamina-HCl pH 8,5&nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ Buffer 10 &vezes;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Solução de estoque concentrado&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de plástico, diâmetro externo 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de borracha, tipo 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Frascos e tampas de plástico, o.d. 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Interação de Proteínas ProteOn XPR36</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>Software Gerenciador ProteOn&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Versão 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM Sensor Chip</td> Kit de Acoplamento <td>de Amina 1765012</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td></td><td></td><td>1762410</td><td>Inclui EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanolamina HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de Regeneração e Condicionamento e Tampões</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Inclui 1 tampão glicina (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), e NaOH, SDS, HCl, ácido fosfórico, NaCl; 50 mL cada solução&nbsp;</td></tr><tr><td>2 L de tampão PBS/Tween/EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Inclui solução salina tamponada com hosfato (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Octeto RED384 Sistema</td><td>Fort&eacute; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de dados</td> biológicos <td>Fort&eacute; </td><td></td> Bio <td>Versão 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>Uma bandeja de 96 biossensores&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Fundo Inclinado de 384 Poços&nbsp;</td><td>Forte&eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de Biossensor</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Buffer 10x</td><td>Forte&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>concentração de 10x. Contém ProClin 300.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema IBIS MX96 SPRi</td><td>Wasatch Microfluídica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluídica Microfluídica Fluxo Contínuo Microspotter (CFM) Impressora</td><td>Wasatch Microfluídica</td><td></td><td>Versão 2.0</td></tr><tr><td>Chip SensEye COOH-G</td><td>Wasatch Microfluídica</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Software de Análise de Dados</td><td>Wasatch Microfluídica</td><td></td><td>Versão 6.19.3.17</td></tr><tr><td>Software</td> <td>de Análise de Dados SPRintWasatch Microfluídica</td><td></td><td>Versão 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Purificador 2</td><td>Software</td><td></td> Biológico <td>Versão 2</td></tr><tr><td>Pierce Proteína Recombinante A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio cinética de ligação utilizando quatro plataformas biosensor

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

biossensores ópticos, livre de marcador são ferramentas poderosas para a descoberta de drogas para a caracterização de interacções biomoleculares. Neste estudo, descrevemos o uso de quatro plataformas de biossensor utilizados rotineiramente no nosso laboratório para avaliar a afinidade de ligação e da cinética de dez anticorpos de elevada afinidade monoclonais (mAbs) contra pró-proteína humana convertase subtilisina Kexin tipo 9 (PCSK9). Embora ambos Biacore T100 e Proteon XPR36 são derivados a partir da tecnologia (SPR) bem estabelecida ressonância plasmónica de superfície, o primeiro tem quatro células de fluxo ligados por configuração de fluxo em série, enquanto que o último presentes 36 pontos de reacção em paralelo, através de um improvisado 6 x 6 cruzado configuração do canal microfluídico. O MX96 IBIS também opera com base na tecnologia de sensor de RPS, com uma característica adicional de imagem que proporciona detecção de orientação espacial. Esta técnica de detecção, juntamente com o fluxo contínuo Microspotter (CFM) expande-se o rendimento de forma significativa por enabling impressão matriz multiplex e de detecção de 96 desportos de reacção simultaneamente. Em contraste, o octeto RED384 baseia-se no princípio BioLayer interferometria (BLI) óptico, com sondas de fibra óptica agindo como o biossensor para detectar o padrão de interferência muda em cima de interacções de ligação na superfície da ponta. Ao contrário das plataformas baseadas em SPR, o sistema BLI não dependem de fluidos de fluxo contínuo; em vez disso, as pontas de sensor recolher leituras enquanto eles estão imersos em soluções de analito de uma microplaca de 384 cavidades durante a agitação orbital. Cada uma dessas plataformas biossensor tem suas próprias vantagens e desvantagens. Para proporcionar uma comparação directa da capacidade desses instrumentos para fornecer dados cinéticos de qualidade, os protocolos descritos ilustram experiências que utilizam o mesmo formato de ensaio e os mesmos reagentes de alta qualidade para a caracterização cinética de anticorpo-antigénio que se encaixam a simples 1: modelo de interacção molecular 1 .

A Figura 1 mostra a imagem matriz de anticorpo a partir do CFM e os níveis de mAbs manchado pelos dois métodos de imobilização, e a Figura 2 mostra os sensogramas de ligao correspondentes geradas na MX96 do multi-ciclo cinético e medidas cinéticas a-ciclo único nestas matrizes mAb . O curvas cineticamente embutidos de várias superfícies revestidas com anticorpos gerados nos quatro plataformas de biossensores de ligação e em tempo real são mostrados nas Figuras 3 - 6. A Figura 7 mostra a comparação das taxas cinéticas e de equilíbrio de ligação finais constantes obtidas a partir da análise global destas curvas de ligação. A associação indivíduo (ka), a dissociação (K d) e de equilíbrio (K D) As constantes de ligação são apresentados na Tabela 1. Para demonstrar a variabilidade de conjuntos de dados gerados no mesmo instrumento, <stRong&gt; A figura 8 mostra gráficos de k, k d, e K D a diferentes densidades de superfície de mAb, e A Figura 9 compara ainda as actividades de ligação das superfícies calculadas de mAb através das plataformas de biossensor. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figura 1. Multiplex Ligando de matrizes de Amina-acoplado (A) e Fc-capturado (B) Anticorpo superfícies dos CFM impressão no IBIS MX96. Imagens das matrizes impressas estão apresentados nos painéis da esquerda, onde as áreas cinzentas fechados por quadrados vermelhos indicar a presença de anticorpo. Os interspots mais escuras localizadas entre os pontos de anticorpo activos são utilizados para a subtracção de referência. Cada coluna contém um anticorpo impresso nas concentrações de titulação identificadas abaixo e para o lado esquerdo da imagem. As quantidades dos anticorpos impressos quantificadas calculando o difference em turnos granel entre os locais activos e de referência são mostradas nos painéis da direita. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figura 2. Comparação de Tempo Real Binding sensorgramas de multi-ciclo (A) e de ciclo único (B) Experiências cinéticas em IBIS MX96. As injecções sequenciais de PCSK9 humano em concentrações crescentes em toda as 10 x 8 matrizes de anticorpo são anotados acima de cada segmento sensorgrama correspondente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <st1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na Biacore T100: Rong&gt; Figura 3. sensorgramas dos anticorpos capturados Interagem com PCSK9 Humana e Ligação 1. As interacções são avaliadas sobre alto (painéis superiores), médio (pains do meio), e baixa (painéis inferiores) superfícies de densidade. As linhas pretas sobrepostas lisas representam o ajuste cinética dos sinais de resposta de ligação com diferentes concentrações de PCSK9 humanas (linhas coloridas) a um modelo 1: 1 interacção. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figura 4. Ligação sensorgramas dos anticorpos capturados Interagem com PCSK9 Humana e 1: 1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na Proteon XPR36. As interacções são avaliadas sobre alto (painéis superiores), medium- (pains do meio), e baixa (painéis inferiores) superfícies de densidade. As linhas pretas sobrepostas lisas representam o ajuste cinética dos sinais de resposta de ligação com diferentes concentrações de PCSK9 humanas (linhas coloridas) a um modelo 1: 1 interacção. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figura 5. Ligação sensorgramas dos anticorpos capturados Interagem com PCSK9 Humana e 1: 1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na Octeto RED384. As interacções são avaliadas sobre alto (painéis superiores), médio (pains do meio), e baixa (painéis inferiores) superfícies de densidade. As linhas vermelhas sobrepostos representam o ajuste cinética dos sinais de resposta de ligação em diferentes concentrações PCSK9 humanas (linhas coloridas) para uma mistura 1:<html> Um modelo de interacção. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figura 6. Ligação sensorgramas dos (B) Antibodies Amina-acopladas (A) e Fc-capturados Interagem com PCSK9 Humana e 1: 1 cinéticos modelo de ajuste sobreposições na IBIS MX96. Os perfis de ligação são organizadas como 10 x 8 painéis que se seguem o mapa da placa de matriz na Figura 1. As linhas pretas representam os sinais de resposta de ligação gravados em diferentes concentrações PCSK9 humanos, e as linhas vermelhas sobrepostos representam as curvas ajustadas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> gura 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7. Comparação da Associação de k a (A), dissociação K d (B), e Equilíbrio K D (C) As constantes de ligação gerado pelo Plataformas Quatro biossensor. Os parâmetros cinéticos são obtidos a partir de análise global das curvas de ligação nas Figuras 3 - 6. Os instrumentos são representados como se segue: Biacore T100 (azul), Proteon XPR36 (verde), Octeto RED384 (vermelho), IBIS MX96, acoplado-amina (roxo), e IBIS MX96, Fc-capturado (laranja). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figura 8. Comparação da Consistência cinético constantes ao longo de várias densidades de superfície anticorpo na Biac<html> minério T100 (A), Proteon XPR36 (B), Octeto RED384 (C), a IBIS MX96, acoplado-amina (D), e IBIS MX96, Fc-capturado (E). Os parâmetros cinéticos K a (sub-painéis de topo), k d (média sub-painéis), e K D (inferior subpainéis) são derivados a partir de análise de grupo a densidade de superfície do anticorpo individuais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figura 9. Actividades de ligação do anticorpo Superfícies e suas (barras de erro) desvios-padrão nas plataformas Quatro biossensor. Os valores são calculados utilizando equações descritas nos artigos de pesquisa 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k um </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M-1s-1) </td><td> (s -1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Modelo de Interação 1: Kinetic Tarifas e Equilibrium Constantes de 10 mAbs obtidas pelo ajuste global de curvas de ligação de quatro instrumentos Biosensor ao 1 Encadernação.

Nós descrevemos aqui os protocolos para a medio de anticorpo-antigénio de afinidade e cinética utilizando quatro plataformas de biossensores de ligação geralmente usados.

Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

O objetivo deste estudo com biossensores é comparar a capacidade das quatro plataformas de biossensores rotineiramente utilizadas em fornecer dados cinéticos de qualidade e oferecer insights sobre desafios técnicos e considerações nos delineamentos experimentais para avaliação de interações anticorpo-antígeno de alta afinidade. Este estudo responde perguntas fundamentais no campo da descoberta de fármacos sobre a seleção de plataformas de biossensores e formatos de ensaio que permitem resultados mais confiáveis ao avaliar candidatos a anticorpos terapêuticos. A principal vantagem deste estudo é que ele fornece uma comparação direta e abrangente das diversas plataformas de biossensores, em relação à consistência, qualidade dos dados e eficiência operacional.A demonstração em vídeo dos quatro protocolos é essencial, pois ajuda novos usuários com pouca experiência prática a aprender como configurar experimentos nesses instrumentos. Para medições cinéticas no Biacore T100, clique em Arquivo, Abrir Novo Método e abra o arquivo de método. Revise os parâmetros no método.Em Tipos de Ciclo, defina o tempo de contato como 220 segundos para a captura 1 pelo percurso de fluxo 2, 110 segundos para a captura 2 pelo percurso de fluxo 3 e 55 segundos para a captura 3 pelo percurso de fluxo 4. A taxa de fluxo é de 10 microlitros por minuto em todos os ciclos de captura. Selecione a Amostra 1 e marque a solução da amostra como uma variável.Em seguida, defina o tempo de contato como 600 segundos e o tempo de dissociação como 2.700 segundos ao longo dos caminhos de fluxo 1, 2, 3, 4. A taxa de fluxo é ajustada para 30 microlitros por minuto. Depois, selecione Regeneração 1, insira glicina HCl pH 1,5 no campo de solução e defina o tempo de contato como 20 segundos ao longo dos caminhos de fluxo 1, 2, 3, 4.Em Configurações Variáveis, insira concentrações tituladas em dobramento de 100 nanomolar a 6,25 nanomolar para os ciclos 1-3, 50 nanomolar a 3,12 nanomolar para os ciclos 4-8 e 5 nanomolar a 0,323 nanomolar para os ciclos 9-10. Em Configurar Execução, escolha o caminho de detecção 2-1, 3-1, 4-1 e, em seguida, clique em próximo. Marque a opção de purgação antes da execução e clique novamente em próximo.Selecione a amostra e o Suporte de Reagentes 1 e defina a localização dos reagentes. Pipete os reagentes nos frascos individuais da amostra conforme necessário e insira o suporte no instrumento. Clique em Ejetar Suporte para abrir a porta do compartimento da bandeja de amostras e, em seguida, insira o suporte de amostras no instrumento.Em seguida, clique em Iniciar e insira um nome de experimento a ser salvo para começar a execução. Para as medições cinéticas no ProteOn XPR36, inicie a imobilização selecionando Protocolos e depois Amostras. Defina EDC/Sulfo-NHS como ativador nas poças H1-H6, proteína A/G como ligante nas poças G1-G6, etanolamina como desativador nas poças F1-F6, glicina como regenerador nas poças E1-E6, PBS-T-EDTA como branco nas poças D1-D6, amostra do anticorpo monoclonal X como ligante nas poças C1-C6 e PCSK9 humano como analito nas poças B1-B6.Selecione Etapas e, em seguida, clique duas vezes em Imobilização no editor de protocolo. As etapas incluem três injeções horizontais subsequentes de EDC/Sulfo-NHS, proteína A/G e etanolamina um molar. Cada injeção deve ter uma taxa de fluxo de 30 microlitros por minuto e um tempo de contato de 300 segundos.Em seguida, clique em Regenerar. Injete três pulsos de 18 segundos de glicina a 100 microlitros por minuto nas direções horizontal e vertical. Em seguida, aplique dois pulsos de 60 segundos de PBS-T-EDTA a 25 microlitros por minuto, também em ambas as direções.Em seguida, clique em Ligante e injete o anticorpo monoclonal 1, anticorpo monoclonal 2 na direção vertical, utilizando uma taxa de fluxo de 25 microlitros por minuto e um tempo de contato de 160 segundos. Após clicar em Analito, injete cinco concentrações de PCSK9 humano em um tampão sem componente em seis canais horizontais simultaneamente. Utilize 40 microlitros por minuto durante 600 segundos de tempo de associação, seguido por 2.700 segundos de tempo de dissociação.Em seguida, clique em Regenerar e injete dois pulsos de 18 segundos de glicina a 100 microlitros por minuto nas direções horizontal e vertical. Depois, prepare as amostras e os reagentes em uma placa de 96 poços de acordo com as posições definidas para os reagentes. Transfira a placa para o instrumento e, em seguida, clique na guia Executar, selecione o protocolo e clique em Iniciar.A injeção paralela com seis agulhas na gravação de dados experimentais em tempo real é demonstrada. Para as medições cinéticas no Octet RED384, configure o método experimental clicando primeiro em Experimento, seguido por Assistente para Novo Experimento, Novo Experimento Cinético e, em seguida, Cinética Básica no software de aquisição de dados. Em seguida, clique em Modificar Placas e altere 96 Poços para 384 Poços tanto na Placa 1 quanto na Placa 2.Defina os tipos de amostra e as posições na placa conforme descrito no protocolo textual. Navegue até a definição do ensaio para configurar a montagem experimental. A montagem experimental é definida como um tempo de linha de base de 30 segundos, um tempo de regeneração de 30 segundos, um tempo de equilíbrio de 18 segundos, uma carga com duração de 200 segundos, um tempo de associação de 500 segundos e um tempo de dissociação de 1.800 segundos.A velocidade de agitação é ajustada para 1.000 RPM. Para adicionar as etapas à lista de etapas do ensaio, primeiro clique em uma etapa e, em seguida, clique nos poços localizados na placa de amostra ou na placa de reagente. Primeiro, insira as instruções de equilíbrio e regeneração para condicionar os sensores de captura anti-IgG humana por meio de três ciclos de mergulhos de 15 segundos em glicina alternados com mergulhos de 15 segundos em KB 1X.Em seguida, insira as instruções de carregamento para capturar as amostras de anticorpo monoclonal em sensores de captura anti-Fc humano por 200 segundos. Depois, insira as instruções de linha de base para estabelecer o sinal de interferometria da biocamada por 60 segundos antes da etapa de associação. Insira a etapa de associação para mergulhar os sensores em poços contendo concentrações variadas de PCSK9 humano por um período de associação de 500 segundos.Insira a etapa de dissociação mergulhando os sensores ligados ao PCSK9 em novas placas de KB 1X por um período de dissociação de 1.800 segundos. Por fim, na etapa de regeneração, mergulhe os sensores ligados ao anticorpo monoclonal PCSK9 em poços de glicina com dois pulsos de 18 segundos entre cada ciclo de ligação. Vá até Revisar Experimentos, percorra as etapas e clique no botão verde aberto para abrir o compartimento da amostra.Transfira as placas de amostra para o instrumento. Navegue até Executar Experimentos, insira um tempo de atraso de 60 segundos e agite a placa de amostra enquanto espera. Ajuste a temperatura da placa para 25 graus Celsius, insira o nome do experimento e, em seguida, pressione Iniciar. A coleta de dados em tempo real é mostrada aqui.Para medições cinéticas de múltiplos ciclos no IBIS-MX96, instale o chip sensor no microspotter de fluxo contínuo. Abra o software CFM2.0, clique em Carregar Configurações e em Acoplamento de Amina 96. Coloque as duas placas de amostra e reagente na impressora CFM.Para criar o arranjo de anticorpos, clique em Executar para iniciar a impressora e entregar o EDC/Sulfo-NHS na metade superior da placa de reagentes ao sensor usando 48 microcanais e ciclá-los sobre a superfície do sensor por cinco minutos. Entregue as amostras de anticorpos monoclonais na metade superior da placa de origem ao sensor e ciclá-las sobre as superfícies ativadas por 10 minutos. Em seguida, entregue o tampão de imobilização de um tubo cônico de 50 mililitros sobre a superfície do anticorpo por cinco minutos.Encaixe o chip sensor impresso no instrumento. No software de controle, clique em Arquivo, Abrir medição, Medição existente, e selecione o arquivo de método. Transfira o chip sensor impresso para o instrumento.No menu geral, selecione G-System Prime em Full system script. Em seguida, selecione G-Quench para desativar as superfícies de anticorpos monoclonais mediante a injeção de 150 microlitros de etanolamina um molar. No Ciclo de Análise, selecione A-AP Standard Run em IBIS Scripts.Defina 1,0 minuto para a linha de base, 10,0 minutos para a associação e 90 etapas para a dissociação, a uma velocidade de oito microlitros por segundo. Dentro dos ciclos, injete a PCSK9 humana uma concentração por vez, após cinco injeções de tampão. Regenere as superfícies do anticorpo monoclonal com glicina entre cada ciclo de ligação.Os sobreposições de ajuste dos sensorgramas de ligação registrados em modelo cinético um para um são mostrados para os anticorpos interagindo com a PCSK9 humana em quatro instrumentos. Os perfis de ligação dos anticorpos em múltiplas densidades são semelhantes entre os instrumentos. Embora as constantes de taxa associadas a cada um dos anticorpos tenham variado entre os instrumentos, suas ordens de classificação permaneceram principalmente as mesmas.A reprodutibilidade e consistência das afinidades nas taxas cinéticas em múltiplas superfícies de anticorpos foi investigada. Como mostrado aqui, uma forte linearidade foi observada para todas as constantes de taxa geradas utilizando o Biacore T100 e o ProteOn XPR36. No entanto, as constantes de taxa geradas pelo Octet RED384 foram menos lineares devido a flutuações em algumas das taxas de dissociação.Isso foi potencialmente causado pela evaporação das amostras ao longo do tempo na microplaca. As constantes de taxa geradas pelo IBIS-MX96 também foram menos lineares devido a flutuações nas heterogeneidades da superfície. As atividades de ligação do anticorpo associadas à maioria dos sistemas foram consistentes, enquanto uma atividade cerca de dez vezes menor foi observada para o método de acoplamento por amina no IBIS-MX96.Isso possivelmente ocorreu devido à inativação do anticorpo ou à geração de orientações de anticorpos que não favoreciam a ligação ao antígeno. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar experimentos em cada uma das quatro plataformas de biossensores e de como selecionar a tecnologia de biossensor apropriada para sua própria finalidade de pesquisa. Nosso estudo comparativo direto mostra que cada plataforma de biossensor possui suas próprias vantagens e desvantagens.Apesar de certas limitações sistemáticas inerentes aos instrumentos, a ordem direta das constantes de taxa de associação e dissociação foi altamente correlacionada entre esses instrumentos. Para fins de classificação de candidatos, assumindo que o número de amostras e a quantidade de materiais não sejam fatores limitantes, qualquer um desses instrumentos pode ser utilizado, pois são capazes de diferenciar os anticorpos de forma comparável, independentemente do instrumento empregado. Existe um compromisso entre a confiabilidade dos dados e o rendimento de amostras.O Biacore T100, seguido pelo ProteOn XPR36R, apresentou a melhor qualidade e consistência dos dados. Enquanto isso, o Octet RED384 e o IBIS-MX96 demonstram alta flexibilidade e produtividade, com compromissos na precisão e consistência dos dados. Para estudos que exigem detecção sensível e confiável, o Biacore T100 ou o ProteOn XPR36 são os mais adequados.Para estudos em que a velocidade é um fator crítico e um grande número de amostras está envolvido, é preferível utilizar o Octet Red384 ou o IBIS-MX96. Instrumentos com fluxo contínuo de fluido X fornecem dados de alta qualidade para resolver interações com taxas lentas de dissociação. A principal limitação do instrumento BRI fluid ex-a-fray é a evaporação da amostra ao longo do tempo na microplaca, o que pode resultar em uma deriva ascendente, comprometendo a precisão dos dados.

determination-high-affinity-antibody-antigen-binding-kinetics-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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