Name: Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a medir o transporte nucleocitoplasmático em tempo real em células NSC-34 usando microscopia de fluorescência. Este ensaio quantitativo permite detectar alterações sutis na importação nuclear, sendo valioso para estudar doenças neurodegenerativas como a ELA.

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Agradecemos a todos os membros do laboratório AI por seus comentários e sugestões úteis. Gostaríamos de agradecer ao Prof. Mark Hipp (Instituto Max Planck de Bioquímica) por nos fornecer o vetor shuttle-GFP. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Ciência Israelense (ISF # 124/14), a Fundação de Ciência Binacional (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Carreira Integração Grant (CIG # 333794), eo Instituto Nacional de Psicobiologia em Israel NIPI # b133-14 / 15).

1. Preparação da Linha Celular <ol><li> Descongelar aproximadamente 1.000.000 células de medula espinhal de neuroblastoma de rato (células NSC-34) que foram armazenadas num recipiente de azoto líquido. Utilize uma incubadora de água a 37 ° C até as células serem completamente descongeladas. </li><li> Adicionar meio fresco e quente (meio DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de L-glutamina e 1% de antibióticos pen-strep). </li><li> Centrifugar as células descongeladas (SL16R) a 500 xg durante 5 min, formando uma pastilha celular. Descarte o meio e adicione 1 mL de novo meio para a ressuspensão celular. </li><li> Colocar as células ressuspensas num balão de 15 mL e adicionar 5 mL adicionais de meio. Incubar as células durante a noite numa incubadora estéril com 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> Em paralelo, colocar 8 lamínulas não revestidas (tampa de vidro: 12 mm, 0,13-0,17 mm de espessura) em um prato de cultura de 60 mm e esterilizar usando 70% etanol e exposição a 30 minutos de luz UV até que esteja seco. Adicionar meio a cada prato e descartar para lavar o etanol residual.</li><li> Adicionar tampão de tripsina (2,5 g de tripsina e 0,2 g de EDTA em 1 L de Solução de Sal Equilibrada de Hanks) às células depois de atingirem aproximadamente 90% de confluência (cerca de 6 milhões de células por frasco) para permitir que as células aderentes se dissociem. NOTA: As células NSC-34 são sensíveis e requerem apenas 15 s de incubação com tampão de tripsina e 1 minuto adicional de incubação sem tripsina antes da dissociação utilizando o meio. </li><li> Plantar as células nas placas de cultura de 60 mm que já contêm as lamelas com 3 mL de meio, aproximadamente 350.000 por placa. Deixá-los na incubadora por 24 h para permitir a fixação de células para as lamelas. </li></ol> 2. Transfecção celular NOTA: Após aproximadamente 24 h, as células NSC-34 atingem 40% de confluência (aproximadamente 800.000 células) e estarão prontas para transfecção. <ol><li> Preparar meio DMEM puro (300 μL de meio DMEM para cada recipiente de cultura de 60 mm) em uma cuba de microcentrífuga estérilEs. </li><li> Adicionar 2 μg de cada plasmídeo necessário para transfecção a cada tubo de microcentrífuga contendo DMEM. NOTA: O plasmídeo shuttle-GFP é obrigatório em todas as transfecções celulares. </li><li> Adicionar o reagente de transfecção a todos os tubos de microcentrífuga que contêm os seus plasmídeos necessários. Aqui, adicionar 4 μL do reagente de transfecção comercial para cada 2 μg de ADN. </li><li> Vortex os tubos de microcentrífuga contendo DMEM, plasmídeos e o reagente de transfecção e incuba-os à temperatura ambiente durante 25 min. </li><li> Adicionar cada tubo de microcentrífuga a um prato de cultura e agitar suavemente o prato para formar uma solução homogénea. Coloque o prato de volta na incubadora por 48 h. NOTA: Uma vez que a vaivï¿½-GFP deve ser expressa em todas as cï¿½ulas, a eficiï¿½cia de transfecï¿½o de shuttle-GFP pode ser parcialmente examinada e testada previamente utilizando microscopia de fluorescï¿½cia apï¿½ transfecï¿½o durante a noite. Um exame completo de proteínas expressas não fluorescentes pode ser conduzido utilizando uma análise de imunobloté. </li></ol> 3. Microscopia <ol><li> Anexar as lamelas contendo células NSC-34 transfectadas para um suporte de lamela e lave suavemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover as células mortas destacadas. </li><li> Identificar um adesivo celular adequado utilizando um filtro fluorescente verde com um microscópio invertido. NOTA: Um adesivo de célula adequado é definido como um campo de visão de microscópio mostrando um grande número de células (20-30 células num campo) e em que os núcleos estão claramente definidos nas células. Os núcleos celulares dentro do remendo de células são primeiro identificados por olho e são marcados manualmente pelo software de imagem. </li><li> Adicionar 200 μL de um tampão de leptomicina B (LMB) inibidor da exportina-1 contendo 10 ng / mL de LMB em PBS aos lamínulas por gotejamento do tampão nos lamínulas sob o microscópio. NOTA: Este ponto no tempo é definido como intervalo zero. </li><li> Quantificar a intensidade fluorescente dos núcleos marcados em intervalos de 3 s por cerca de 400-500 s. </li><li&gt; Teste entre 3 e 5 lamínulas para cada grupo de transfecção em cada experiência individual. </li></ol> 4. Análise NOTA: Uma vez que diferentes células expressam diferentes níveis de transferência de GFP fluorescente, é importante normalizar a intensidade fluorescente nuclear de cada célula para a sua própria intensidade fluorescente inicial. <ol><li> Normalize a intensidade fluorescente dos núcleos marcados dividindo o intervalo fluorescente de 3 de cada núcleo com a média dos seis intervalos iniciais desse núcleo. </li><li> Após a normalização de cada núcleo, produzir uma curva de intensidade fluorescente representando a mudança na fluorescência dos núcleos em função do tempo para cada remendo de célula. Para fazer isto, calcule a média de todas as pilhas em cada remendo da pilha (que consiste em aproximadamente 20-30 pilhas em cada remendo). NOTA: A curva de intensidade de fluorescência dos núcleos se assemelha a uma curva de saturação de Michaelis-Menten, que é melhor observadaMe períodos. Isto é devido a uma diminuição nas quantidades citosólicas de shuttle-GFP com o tempo devido ao transporte nuclear. Esta diminuição diminui estatisticamente a probabilidade de uma vaivém-GFP se transportar para o núcleo, atingindo assim a saturação na fluorescência nuclear. A inclinação derivada da taxa inicial linear da curva produz a taxa de entrada de Vmax no núcleo. </li><li> Analise as inclinações de Vmax de cada remendo de célula, derivadas de três a cinco experimentos independentes, usando o software gráfico para produzir uma inclinação que representa cada grupo experimental. Realize a quantificação usando análise estatística ANOVA unidirecional. </li></ol> 5. Validação de Expressão de Proteína <ol><li> Colocar recipientes de cultura de 60 mm contendo as células residuais (não utilizadas na experiência anterior) de cada grupo experimental em gelo. </li><li> Eliminar o meio e lavar as células duas vezes com PBS para diluir e lavar o meio restante. </li><li> Tratar as células com 200-400ML de tampão de lise contendo PBS, 0,5% de Triton e comprimido de cocktail de inibidor de protease (PI). Raspe usando um raspador de células. </li><li> Recolher as células em tampão de lise num tubo de microcentrífuga e homogeneizar com um homogeneizador a 4000 rpm durante 1 min sob gelo. </li><li> Centrifugar as células homogeneizadas a 2.500 xg durante 10 min. Recolher o sobrenadante, quantificar a concentração de proteína utilizando um ensaio de Bradford e armazenar até à utilização a -20 ° C. </li><li> Recolher entre 30 e 70 μg de proteína total (dependendo da proteína) e carregá-lo em um gel de SDS-PAGE para testar a expressão da proteína usando um ensaio de imunoblot. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , 4th edn, Garland Science. (2002).</li>
<li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li>
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<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li>
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<li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+frontotemporal+dementia+and%2For+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li>
<li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li>
<li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li>
<li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li>
<li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS%2FFTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo demonstra um ensaio altamente sensível e quantitativo novo para avaliar mudanças minuciosas no transporte nucleocytoplasmic. Utilizando este sistema, é possível observar e medir o transporte nucleocitoplasmático e sua disfunção em tempo real, não só grandes defeitos que resultam em mudanças dramáticas na distribuição de proteínas. Este ensaio não só tem uma vantagem de sensibilidade, mas também requer pouca preparação, é barato e é um ensaio muito fácil e de baixo engajamento. ...

O complexo de poros nucleares (NPC) controla a importação e exportação de grandes moléculas dentro e fora do núcleo da célula. Em contraste com pequenas moléculas, que podem entrar no núcleo sem a regulação 1 , o transporte de moléculas maiores é fortemente controlado pelo NPC. Essas grandes moléculas, como proteínas e RNA, associam-se a fatores de transporte, incluindo importações e exportações, para serem importadas e exportadas do núcleo 2 . Para serem importados, as proteínas devem conter um pequeno motivo peptídico, geralmente chamado de sinal de localização nuclear (NLS), que é limitado por importinas 2 . Estas sequências de aminoácidos actuam como um marcador e são diversas na composição 3 , 4 . As proteínas podem ser exportadas do núcleo para o citoplasma devido à sua associação com aS, que ligam uma seqüência de sinal, geralmente chamada de sinal de exportação nuclear (NES) 2 . Ambos importins e exportins são capazes de transportar sua carga devido à regulação da pequena proteína nuclear relacionada Ras GTPase (Ran) 2 . Ran demonstrou-se que existem em diferentes estados conformacionais dependendo se está ligado a GTP ou GDP. Quando ligado a GTP, Ran pode vincular a importins ou exportins. Após a vinculação ao RanGTP, importins liberar sua carga, enquanto exportins deve vincular RanGTP para formar um complexo com sua carga de exportação. O estado de ligação de nucleótidos dominante de Ran depende da sua localização no núcleo (RanGTP) ou do citoplasma (RanGDP). Recentemente, vários estudos têm demonstrado uma ligação entre deficiências na via nucleocitoplasmática e tanto a esclerose lateral amiotrófica (ELA) quanto a demência frontotemporal (FTD) 5 , 6 </sup7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . A ELA é uma doença neurodegenerativa progressiva e fatal que afeta os neurônios motores superiores e inferiores (MNs) 13 e resulta em paralisia e, em última instância, na morte, em média de 2 a 5 anos. A maioria dos casos de ELA é classificada como esporádica (SALS), sem qualquer ligação genética aparente, mas 10% são herdados de forma dominante (ALS familiar, FALS). Recentemente, foram identificadas as expansï¿½s de repetiï¿½o de hexanucleï¿½idos (HREs) no gene 72 de leitura aberta do cromossoma 9 (C9orf72) 14 , 15 como uma causa genï¿½ica de ALS e FTD. Esses mutantes respondem por 30-40% dos casos FALS 16 , e diferentes estudos alegaramQue causam toxicidade por afetar o transporte nucleocitoplasmático 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Estes estudos mostram principalmente os resultados finais e manifestações de HREs sobre o transporte nucleocytoplasmic, mas eles não demonstram disrupção nucleocytoplasmic em tempo real. Como resultado, apenas a deficiência grave de transporte nucleocitoplasmático foi avaliada 11 , 17 , 18 . Este protocolo descreve um novo eSensível para avaliar e quantificar a disfunção nucleocitoplasmática de transporte em tempo real. A taxa de importação de uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) pode ser quantificada em tempo real utilizando microscopia de fluorescência. Isto é feito utilizando um inibidor de exportação, tal como descrito anteriormente 18 , permitindo assim que a vaivém-GFP apenas entre no núcleo. Usando a microscopia fluorescente e um software capaz de quantificar alterações fluorescentes em tempo real, é possível quantificar mudanças graduais na intensidade de fluorescência da nave-GFP, localizada no núcleo. Como resultado, pode ser feita uma curva de saturação tipo Michaelis-Menten do eixo de fluorescência ao tempo, representando a quantidade de GFP nuclear de transporte em qualquer momento dado. Usando a taxa linear inicial das curvas, é possível gerar uma inclinação, que representa a taxa de entrada no núcleo antes da saturação de fluorescência. Para validar o ensaio, oForam utilizadas repetições de dipeptídeos C9orf72, poli (GR) e poli (PR), que foram previamente relatados como perturbadores do transporte nucleocitoplasmático, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Utilizando este ensaio, observou-se uma diminuição de 50% na taxa de importação nuclear em comparação com o controlo. Usando este sistema, podem ser examinadas pequenas alterações no transporte nucleocitoplasmático. Além disso, a capacidade de diferentes factores para resgatar um defeito de transporte nucleocitoplasmático pode ser determinada.

<table><tbody><tr><td>Linha celular híbrida semelhante a neurônios de motor de camundongo (NSC-34)</td> <td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g / L L-glicose</td><td>Indústrias biológicas</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS European Grade</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma Série ii Camisa de água CO2 Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura 12 mm de diâmetro, 0,13-0,17 mm de espessura</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfection Reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 microscópio invertido</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomicina B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador motor/controle/mandril/braçadeira de 90 graus</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R Centrífuga, refrigerada</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio para medir o transporte nucleocitoplasmático em tempo real dentro de células nsc-34 do tipo motor-neuron

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

O transporte nucleocitoplasmático refere-se à importação e exportação de grandes moléculas do núcleo celular. Recentemente, vários estudos têm mostrado uma ligação entre a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e deficiências na via nucleocitoplasmática. ALS é uma doença neurodegenerativa que afeta os neurônios motores e resultando em paralisia e, finalmente, na morte, em média 2-5 anos. A maioria dos casos de ELA são esporádicos, sem qualquer ligação genética aparente, mas 10% são herdados de forma dominante. Recentemente, as expansï¿½s de repetiï¿½o de hexanucleï¿½idos (HREs) no gene 72 de leitura aberta do cromossoma 9 (C9orf72) foram identificadas como uma causa genï¿½ica de ALS e demï¿½cia frontotemporal (FTD). É importante notar que diferentes grupos propuseram recentemente que estes mutantes afectam o transporte nucleocitoplasmático. Esses estudos mostram principalmente o resultado final e manifestações causadas por HREs sobre o transporte nucleocitoplasmático, mas eles não demonstram disfunção de transporte nuclear emtempo real. Como resultado, apenas a deficiência grave de transporte nucleocitoplasmático pode ser determinada, principalmente devido à alta sobreexpressão ou inserção de proteína exógena. Este protocolo descreve um ensaio novo e muito sensível para avaliar e quantificar a disfunção nucleocitoplasmática de transporte em tempo real. A taxa de importação de uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP) pode ser quantificada em tempo real utilizando microscopia de fluorescência. Isto é realizado utilizando um inibidor de exportação, permitindo assim que a GFP de transporte apenas entre no núcleo. Para validar o ensaio, utilizaram-se as repetições de dipeptídeos traduzidos por HRE de C9orf72, poli (GR) e poli (PR), que anteriormente foram mostrados como perturbadores do transporte nucleocitoplasmático. Utilizando o ensaio descrito, observou-se uma diminuição de 50% na taxa de importação nuclear em comparação com o controlo. Usando este sistema, podem ser examinadas pequenas alterações no transporte nucleocitoplasmático e a capacidade de diferentes fatores para resgatar (mesmo parcialmente) um trato nucleocitoplasmáticoPode ser determinado.

Utilizando o procedimento aqui apresentado, as células NSC-34 do tipo neurónio motor foram transfectadas com uma proteína NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Esta proteína, que tem NLS e NES sinal seqüências ( Figura 1 ), pode shuttle entre o núcleo eo citoplasma. A GFP genï¿½ica pode entrar ou sair do nï¿½leo na ausï¿½cia de qualquer marca de sinal de localizaï¿½o apenas por difusï¿½ e, por conseguinte, ï¿½ distribuï¿½a uniformemente entre o nï¿½leo e o citoplasma ( Figu...

Este protocolo descreve um método para medir sensivelmente a taxa de transporte nucleocitoplasmático dentro de células NSC-34 do tipo neurônio motor, quantificando a mudança em tempo real na importação nuclear de uma proteína NLS-NES-GFP.

Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

O objetivo geral deste ensaio é detectar alterações mínimas na taxa de transporte nucleocitoplasmático de células em tempo real, na ausência ou na presença de moléculas potencialmente supressoras da taxa de transporte. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre doenças neurogenéticas específicas, como a ELA, que se acredita terem impacto negativo no transporte nucleocitoplasmático. Algumas vantagens desta técnica são sua alta sensibilidade e caráter quantitativo, além de permitir a análise em tempo real de alterações mínimas na taxa de transporte nucleocitoplasmático.O procedimento será demonstrado por Tom Shani, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece descongelando aproximadamente uma vez 10 elevado à sexta células de neuroblastoma de medula espinhal de camundongo armazenadas em nitrogênio líquido em banho-maria a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem completamente descongeladas, colete-as por centrifugação e re-suspenda o pellet em um mililitro de meio fresco.Em seguida, transfira as células para um frasco de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de cultura celular para uma incubação noturna a 37 graus Celsius em 5% de dióxi

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microscopia única molécula approch forneceu introspecções romance em transporte nuclear.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

Este protocolo descreve a extração de proteínas de células cancerígenas neuronais. As células são lavadas com um tampão e lisadas por meio de interrupção enzimática e mecânica. O sobrenadante rico em proteínas extraído é coletado após centrifugação.

Extração de proteínas de células neuronais

O transporte intracelular de cargas, como vesículas ou organelas, é realizado por proteínas motoras moleculares que rastreiam microtúbulos polarizados. Este protocolo descreve a correlação da direcionalidade do transporte de partículas de carga individuais que se movem dentro dos neurônios, com a quantidade relativa e o tipo de proteínas motoras associadas.

Caracterizar a composição de motores moleculares sobre Movimentação axonal Carga Utilizando Análise &quot;Mapeamento Cargo&quot;

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um bom modelo para estudar o transporte axonal e intracelular. Aqui, eu descrevo um protocolo para análise de transporte axonal e em c. eleganse in vivo de gravação.

Imobilização de Caenorhabditis elegans , para analisar o transporte intracelular nos neurônios

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

Este protocolo descreve como configurar e realizar com eficiência análises automatizadas de dados de imagem de células vivas obtidos do rastreamento do transporte nucleocitoplasmático por meio de ferramentas optogenéticas.

Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Aprenda a medir o transporte nucleocitoplasmático em tempo real em células NSC-34 usando microscopia de fluorescência. Este ensaio quantitativo permite detectar alterações sutis na importação nuclear, sendo valioso para estudar doenças neurodegenerativas como a ELA.

Ensaio para Medir o Transporte Nucleocitoplasmático em Tempo Real dentro de Células NSC-34 do tipo Motor-Neuron

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