Análise do Promotor de Ligando C-KIT Usando Imunoprecipitação de Cromatina

O objetivo geral deste procedimento de imunoprecipitação da cromatina é avaliar a ligação induzida por TGF beta 1 do fator de transcrição SMAD2 aos elementos de ligação SMAD no promotor do kit C. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia celular, como a transcrição gênica induzida por citocinas. A principal vantagem dessa técnica é que ela tem o potencial de demonstrar a ligação direta de fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras da transcrição aos seus locais de ligação ao DNA in vivo.

Cultive as células entre 70 e 80% de confluência em placas de cultura de tecidos de dez centímetros. Estimular as células de acordo com os objetivos experimentais. Remova o meio de cultura de tecidos e adicione cinco mililitros de solução de fixação.

Em seguida, incube as células por 10 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma agitada. Remova a solução de fixação e lave as células duas vezes com 10 mililitros de um X PBS gelado. Remova o X PBS e adicione cinco mililitros de solução de parada de glicina.

Depois de incubar as células por cinco minutos em temperatura ambiente em uma plataforma agitável, remova a solução de parada de glicina e lave as células duas vezes com 10 mililitros de um X PBS gelado. Depois de remover o PBS, adicione dois mililitros de solução de raspagem de células e colha as células usando um raspador de células. Em seguida, transfira as células colhidas para um tubo cônico no gelo.

Centrifugue as amostras por 10 minutos a 600 vezes G e quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante, ressuspenda o pellet em um mililitro de um tampão de lise de células X e incube em gelo por 30 minutos. Assim que o pellet for ressuspenso no tampão de lise celular, transfira a suspensão celular para um homogeneizador Dounce gelado e Dounce por 10 golpes usando um pilão tipo B para ruptura celular.

Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga e centrifugue a amostra por 10 minutos a 2.400 vezes G e quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 350 microlitros de tampão de digestão de núcleos. Depois de incubar as amostras por cinco minutos a 37 graus Celsius, adicione nuclease microcócica e misture por vórtice.

Incubar as amostras a 37 graus Celsius por cinco a 20 minutos, misturando as amostras a cada dois minutos por inversão. O tempo em alguma concentração, se você estiver entre as linhagens celulares, pode exigir otimização em caso de cisalhamento enzimático abaixo do ideal. Um procedimento alternativo de tosquia usando sonicare disponível comercialmente pode ser encontrado no protocolo de texto.

Após a incubação com a nuclease microcócica, adicione sete microlitros de EDTA molar 0,5 molar gelado para interromper a reação. Centrifugue as amostras com o DNA cisalhado por 10 minutos a 16, 200 vezes G e quatro graus Celsius. Transferir o ADN cortado contendo sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.

Alíquota de 50 microlitros em um tubo de microcentrífuga separado, para confirmar o cisalhamento bem-sucedido do DNA, conforme descrito no protocolo de texto. Use o volume restante imediatamente para imunoprecipitação ou armazene-o a menos 80 graus Celsius. Combine 10 a 25 microgramas da cromatina reticulada cisalhada com 25 microlitros de esferas magnéticas de proteína G de grau de imunoprecipitação da cromatina.

Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão de diluição de imunoprecipitação e um microlitro de coquetel inibidor de protease. Após quatro horas de incubação, adicione um a 10 microgramas de anticorpo a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. E adicione água destilada a um volume final de 100 microlitros.

Incube as amostras em um rotador de ponta a ponta por quatro a 12 horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, coloque os tubos em um suporte magnético. Assim que as esferas magnéticas se agregarem ao lado do tubo, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.

Lave as contas três vezes com 800 microlitros de tampão de lavagem um. Para cada lavagem, misture as contas invertendo o tubo várias vezes. Em seguida, coloque o tubo no suporte magnético e remova cuidadosamente o tampão de lavagem assim que as contas magnéticas se agregarem na lateral do tubo.

Em seguida, lave as contas uma vez com 800 microlitros de tampão de lavagem dois usando o mesmo procedimento. Após as lavagens, ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de tampão de eluição e incube as amostras em um rotador de ponta a ponta por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo com o auxílio do suporte magnético.

Adicione seis microlitros de cloreto de sódio de cinco molares para reverter a reticulação seguido por dois microlitros de proteinase K. Depois de misturar as amostras, incube-as por duas horas a 65 graus Celsius. Neste ponto, as amostras podem ser analisadas diretamente quanto a locais de ligação a proteínas, conforme descrito no protocolo de texto, ou podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Para confirmar a ligação de SMAD2 induzida por TGF beta 1 ao promotor SCF, foi realizado o ensaio de imunoprecipitação da cromatina.

O tratamento com TGF beta 1 resultou na ligação de SMAD2 ao promotor SCF em linhagens de câncer de fígado humano, HepG2 e Hep3B. Na ausência de estimulação com TGF beta 1, nenhuma ligação SMAD foi observada. Como controle positivo, para a ativação de SMAD induzida por TGF beta 1, foi realizada imunoprecipitação de cromatina para PAI-1.

O promotor PAI-1 é um alvo conhecido de TGF beta e SMAD. A especificidade da imunoprecipitação SMAD2 foi confirmada através do uso de anticorpos IgG inespecíficos. Nenhuma ligação de SMAD2 ao SBE foi observada após imunoprecipitação com IgG.

Para confirmar a ligação de STAT3 induzida por TGF Beta 1 ao gene do ligante beta TGF, ensaios de imunoprecipitação de cromatina foram realizados usando células HepG2 e Hep3B tratadas com TGF beta 1. O tratamento com TGF beta 1 resultou na ligação de STAT3 ao segundo sítio de ligação STAT3 putativo do gene TGF beta, mas não ao primeiro. Neste exemplo, a ligação positiva do STAT3 ao STB-2 serve como um controle positivo interno.

Semelhante ao outro experimento de imunoprecipitação da cromatina, a ligação de STAT3 ao ST-2 não foi observada após a imunoprecipitação usando IgG. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um ou dois dias, dependendo do anticorpo, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante seguir as diretrizes de segurança do laboratório e ser altamente preciso em todas as etapas do protocolo.

Precauções como verificar a FISPQ e usar equipamentos de proteção, como luvas, jaleco branco e óculos de segurança, devem ser tomadas durante a realização deste procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a ligação de proteínas às sequências específicas de ligação ao DNA. Seguindo este protocolo, outros métodos como ensaios promotores podem ser realizados para confirmar a relevância funcional da ligação ao DNA proteico demonstrada pela imunoprecipitação da cromatina.