Name: Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprenda a quantificar o efeito de pistas químicas ambientais no comportamento de acasalamento em Drosophila melanogaster. Este ensaio comportamental flexível permite testar compostos voláteis e não voláteis em 24 horas.

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Agradecemos ao Bloomington Drosophila Stock Center pelas ações da mosca; C. Gahr, JT Alkema e S. van Hasselt por sua tentativa inicial de desenvolver o ensaio de ar pressurizado; Jasper Bosman, pelo conselho sobre o cultivo de fermento; E Rezza Azanchi e Joel Levine por desenvolverem originalmente o monitoramento do lapso de tempo do comportamento de acoplamento de Drosophila . A JA Gorter foi apoiada por uma bolsa do Programa de Pós-Graduação da Escola de Pesquisa de Neurociências BCN / NWO. Este trabalho foi apoiado em parte pela organização holandesa de pesquisa científica (NWO) (referência: 821.02.020) a JC Billeter.

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Os autores não têm interesses concorrentes a divulgar.

Este protocolo descreve um ensaio para testar o comportamento de acasalamento ao longo de 24 h, enquanto controla continuamente as pistas ambientais que um casal de acasalamento tem a hipótese de usar para determinar a freqüência de acasalamento. É possível aumentar a frequência de acasalamento em resposta ao ar de fermento entregue através de um sistema de ar pressurizado quando o meio também contém levedura ( Figura 2B ). Além disso, uma resposta semelhante na freqüência de acoplamento pode ser observ...

Os comportamentos reprodutivos tipicamente têm altos custos de energia, especialmente para as mulheres, que produzem gametas maiores do que os machos e devem escolher cuidadosamente as condições para elevar sua prole em desenvolvimento. Devido ao custo da energia, não é surpreendente que a reprodução esteja ligada a condições nutricionais. Isso é verdade na maioria, se não em todos, animais, incluindo mamíferos, cuja puberdade pode ser adiada pela desnutrição e cuja excitação sexual pode ser afetada negativamente pela restrição alimentar 1 . A reprodução do organismo modelo genético Drosophila melanogaster também é afetada por condições nutricionais. Tribunal dos machos em nível superior na presença de voláteis alimentares 2 , e as mulheres são mais receptivas sexualmente na presença de fermento, um importante nutriente para a produção de ovos e a sobrevivência da prole 3 , 4 , 5 . esteA resposta reprodutiva reproduzida evolutiva aos alimentos oferece a oportunidade de estudar mecanismos que conectem a disponibilidade de alimentos ambientais à reprodução sexual em um organismo genéticamente atraente e eficiente em termos de tempo. Na verdade, o trabalho em D. melanogaster implicou a via da insulina como um importante regulador da conexão entre alimentação e comportamento de acasalamento 6 . Também mostrou que o ato de se acasalar altera a preferência alimentar das fêmeas, bem como os neurônios quimiossensíveis associados 7 , 8 , 9 . É claro que as indicações alimentares afetam os comportamentos reprodutivos em D. melanogaster . Esses efeitos parecem afetar principalmente as fêmeas, especificamente aqueles que já se acasalaram 5 . No entanto, para testar esses efeitos agudos das condições ambientais, o ensaio clássico usado para o comportamento de acasalamento feminino podeNão seja muito adequado devido às longas interrupções entre os episódios de acasalamento. No clássico ensaio de rematamento, uma fêmea virgem primeiro mata com um macho e é imediatamente isolada e apresentou um novo macho 24 a 48 h depois. Este ensaio clássico tem sido usado com grande sucesso para identificar componentes da ejaculação masculina que modificam o comportamento feminino e a resposta feminina 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . O ensaio de acoplamento contínuo demonstrado aqui é, portanto, uma adição aos ensaios clássicos de acoplamento que podem ser usados ​​para estudar o efeito agudo das condições ambientais nos comportamentos reprodutivos. Usando o ensaio contínuo para comportamento de acasalamento que é explicado aqui, anteriormente mostramos que um par de moscas expostas à fermento irá remeter sSempre em um período de observação de 24 h 5 , 19 , 20 , 21 , enquanto as moscas não expostas aos alimentos só serão rematadas uma vez 5 . Esta descoberta pode ser intrigante à luz de uma grande parte da literatura de D. melanogaster , indicando que as fêmeas não remontam por vários dias após um acasalamento inicial (revisado nas referências 10 , 11 ). No entanto, esta discrepância pode ser facilmente explicada por condições de ensaio, onde uma fêmea é isolada por um a vários dias antes de uma nova oportunidade de acasalamento ser fornecida. Se o par não se acasalar nesse período de observação de uma hora, a fêmea é caracterizada como não receptiva. Além disso, a alta freqüência de acasalamento não deve ser surpreendente, dado que os dados de moscas selvagens mostram que as fêmeas contêm esperma de 4 a 6 machos em seus órgãos de armazenamento; Assim, emDicionando que as fêmeas naturalmente remontam várias vezes 22 , 23 . Aqui, demonstramos o uso deste ensaio de acoplamento contínuo para desvendar como as moscas se reúnem e combinam informações sobre condições ambientais para modular a freqüência de acasalamento. Este ensaio permite testar um número relativamente grande de casais de acasalamento para estudos genéticos e testar a influência de pistas ambientais voláteis e não voláteis. O ensaio normalmente é executado por 24 h, mas pode ser prolongado para 48 h, permitindo o teste de pistas ambientais de ciclagem, como o ciclo luz-escuro (LD). Demonstramos este ensaio testando a influência das pistas voláteis de uma cultura de fermento dentro de um sistema de ar pressurizado em combinação com a disponibilidade de nutrientes de fermento não volátil no substrato alimentar. O sistema de ar pressurizado bombeia continuamente sinais voláteis para uma arena de acasalamento que contémUm substrato alimentar e um casal teste (cujo comportamento de acasalamento é monitorado). Para determinar ainda mais as especificidades através das quais a levedura influencia o acasalamento, testamos um grande composto volátil de fermento, a saber, ácido acético 24 , em combinação com um teor de aminoácidos que corresponde ao de fermento no substrato alimentar, na forma de peptona (amino Ácidos derivados da digestão enzimática de proteínas animais). Juntos, essas experiências demonstram como o efeito de pistas ambientais sobre o comportamento de acoplamento de D. melanogaster pode ser testado com este ensaio.

<table><tbody><tr><td><forte>Armário</forte>Armário de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>cozinha em aço inoxidável</td><td>Horecaworld</td><td>7412.0105</td><td></td></tr><tr><td>LEDs brancos</td><td>Lucky Light</td><td>ll-583wc2c-001</td><td>Branco frio, 20 mAmp e 2 V</td></tr><tr><td>LEDs vermelhos</td><td>Lucky Ligt</td><td>ll-583vc2c-v1-4da</td><td>Comprimento de onda entre 625 nm, 20 mAmp e 6 V</td></tr><tr><td>Resistor</td><td>Royal Ohm</td><td>CFR0W4J0561A50</td><td>560 ohm, 0,25 W, 250 V e 5% de tolerância</td></tr><tr><td>Aplicativo de medidor de luz para smartphone</td><td>Patrick Giudicelli</td><td></td><td>Medidor de luz/lux GRÁTIS, versão 1.1.1</td></tr><tr><td>Temporizador de energia</td><td>Alecto</td><td>TS-121</td><td></td></tr><tr><td>Suportes</td><td></td><td></td> de metal <td>Ângulo agudo 5 por 5 mm,&nbsp; 2 x 5450 e 1 x 1100 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de vidro fosco <td>1190 x 545 x 5 mm</td></tr><tr><td>Papel de filtro lençóis</td><td>Filtros LEE</td><td>220</td><td>White frost</td></tr><tr><td>Ventilador pequeno</td><td>Nanoxia Silêncio profundo</td><td>4260285292828</td><td>80 mm Ventilador de PC ultra-silencioso, 1200 RPM</td></tr><tr><td>Ventilador grande</td><td>Nanoxia Silêncio profundo</td><td>4260285292910</td><td>Ventilador de PC ultra-silencioso de 120 mm, câmera de webcam de 650-1500 RPM</td></tr><tr><td></td><td>Logitech</td><td>950270</td><td>B910 HD WEBCAM OEM, Ângulo: 78 graus, resolução: 5 milhões de pixels&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software da câmera</td><td>DeskShare</td><td></td><td>Monitor de segurança pro</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Criação de moscas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de criação de moscas</td><td>Flystuff</td><td>32-130</td><td>6oz Estoque de Drosophila garrafa</td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Flystuff</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Moscas</td><td></td><td></td> do tipo selvagem <td>Canton-S</td></tr><tr><td>Frascos de criação de moscas</td><td>Dominique Dutscher</td><td>789008</td><td>tubos de Drosophila estreitos 25x95 mm</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MIR-154</td><td></td></tr><tr><td>Placa quente magnética</td><td>Heidolph</td><td>505-20000-00</td><td>MR Hei-Standard</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Caldic Ingredientes B.V.</td><td>010001.26.0</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Gezond& wel</td><td>1019155</td><td>Dextrose/Druivensuiker</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Van Gilse</td><td></td><td>Açúcar granulado</td></tr><tr><td>Fubá</td><td>Flystuff</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>Gérmen de trigo</td><td>Gezond& wel</td><td>1017683</td><td></td></tr><tr><td>Farinha de soja</td><td>Flystuff</td><td>62-115</td><td></td></tr><tr><td>Melaço</td><td>Flystuff</td><td>62-117</td><td></td></tr><tr><td>Levedura seca ativa</td><td>Red Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Flystuff</td><td>20-258</td><td>100%</td></tr> <tr><td>Peptona (bacto)</td> <td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>Glacial, 100% </td></tr><tr><td>Greiner bio-one de petris pequeno</td><td></td><td>627102</td><td>35 x 10 mm com aberturas Filme de</td></tr><tr><td>parafina</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Configuração de levedura e ar pressurizado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petridish grande</td><td>Gosselin</td><td>BP140-01</td><td>140 x 20,6 mm</td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Millipore corporation</td><td></td><td>MiliQ</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Ágar (puro)</td><td>BD</td><td>214530</td><td>bacto</td></tr><tr><td>Glicose (0(+)-glicose monohidratada)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>18270000004</td><td></td></tr><tr><td>Open caps</td><td>Schott</td><td>29 240 28&nbsp;</td><td>GL45</td></tr><tr><td>Septo de silicone</td><td>VWR</td><td>548-0662</td><td></td></tr><tr><td>Conexões de anteparo farpado</td><td>Nalgene</td><td>6149-0002</td><td></td></tr><tr><td>Grande diâmetro do tubo de</td><td></td><td></td> PVC<td>: externo 1,2 cm e interno 0,9 cm</td></tr><tr><td>Diâmetros pequenos dos</td><td></td><td></td> tubos de PVC<td>: externo 0,8 cm e interno 0,5 cm</td></tr><tr><td>tubo de 15 ml</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquarium pump</td><td>Sera precision</td><td></td><td>Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W e pressão >100 mbar</td></tr><tr><td>Carvão ativado</td><td>Superfish</td><td>A8040400</td><td>Norit Carvão ativado</td></tr><tr>Unidade<td>de filtro descartável</td><td>Whatman</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas</td><td>VWR</td><td>612-1600</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Cola quente</td><td>Pattex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Whatman</td><td></td><td>FP 30/tamanho dos poros 0,45 mm CA-S</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>AnáliseSoftware estatístico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Pacote <td>R</td><td></td><td>lme4</td></tr></tbody></table>

um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; drosophila melanogaster</em

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A movimentação sexual de um indivíduo é influenciada pelo genótipo, experiência e condições ambientais. A forma como esses fatores interagem para modular os comportamentos sexuais permanece mal compreendida. Em Drosophila melanogaster , as pistas ambientais, como a disponibilidade de alimentos, afetam a atividade de acasalamento oferecendo um sistema atraente para investigar os mecanismos que modulam o comportamento sexual. Em D. melanogaster , as sugestões ambientais são muitas vezes detectadas através dos sistemas gustativos e olfativos quimiossensíveis. Aqui, apresentamos um método para testar o efeito de pistas químicas ambientais sobre o comportamento de acasalamento. O ensaio consiste em uma pequena arena de acasalamento contendo meio alimentar e um casal de acasalamento. A frequência de acasalamento para cada casal é monitorada continuamente por 24 h. Aqui apresentamos a aplicabilidade deste ensaio para testar compostos ambientais de uma fonte externa através de um sistema de ar pressurizado, bem como a manipulação dos componentes ambientais diretamente na arena de acasalamento. VocêUm sistema de ar pressurizado é especialmente útil para testar o efeito de compostos muito voláteis, enquanto a manipulação de componentes diretamente na arena de acasalamento pode ser útil para determinar a presença de um composto. Este ensaio pode ser adaptado para responder a perguntas sobre a influência de pistas genéticas e ambientais sobre comportamento e fecundidade de acasalamento, bem como outros comportamentos reprodutivos masculinos e femininos.

O uso desse ensaio contínuo, comportamento de acasalamento e freqüência de acoplamento em específico, pode ser determinado em condições ambientais experimentais. Para controlar as condições ambientais, transformamos um armário de cozinha de aço inoxidável em uma área de teste, com sua própria fonte de luz e difusão, o que garante uma alta abundância de luz e um mínimo de brilho do topo das arenas de acoplamento ( Figura 1A ) . A área de teste interna é completamente enca...

Demonstramos um ensaio para analisar as pistas ambientais e genéticas que influenciam o comportamento de acasalamento na mosca da fruta Drosophila melanogaster .

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

O objetivo geral deste ensaio comportamental é quantificar o efeito de estímulos ambientais sobre comportamentos reprodutivos, como corte e acasalamento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia comportamental e eurogenética, tais como a inferência de fatores genéticos e ambientais sobre comportamentos reprodutivos e os mecanismos que regulam esses comportamentos.Essa técnica oferece velocidade e flexibilidade para testar uma ampla variedade de fatores ambientais que afetam a reprodução. E isso com um número muito bom de réplicas. O procedimento será demonstrado por Jenke Gorter, um aluno de pós-graduação do meu laboratório.Inicie o experimento preparando um litro de meio rico para moscas. Despeje um litro de água da torneira em um béquer de vidro de dois litros com barra magnética. E coloque o béquer em uma placa aquecedora magnética.Mantenha a agitação desligada e aumente o calor até 300 graus Celsius, até que a temperatura de ebulição seja atingida. Ligue a agitação em 500 rpm e adicione os ingredientes à água fervente. Aguarde a levedura espumar vigorosamente.Em seguida, reduza a temperatura da placa aquecedora para 120 graus Celsius. Após 10 minutos, diminua a temperatura da placa aquecedora para 30 graus Celsius. Deixe a mistura sob agitação até esfriar a 48 graus Celsius.Monitore a temperatura inserindo um termômetro diretamente no alimento. Dissolva dois gramas de Tegosept em 10 mililitros de etanol 96%. Combine a mistura e cinco mililitros de ácido propiônico um molar no béquer.Agite durante três minutos. Aqueça uma agulha até ficar incandescente em um bico de Bunsen. E faça um furo com diâmetro de 0,3 centímetros no lado superior de uma placa de Petri plástica de 3,5 centímetros por 1,0 centímetro.Ao preparar o meio alimentar com compostos odoríferos, pipete primeiro 30 microlitros do composto desejado na placa para 1/2 das placas experimentais. Deixe a outra metade das placas vazia para comparação. Usando uma pipeta serológica de cinco mililitros, despeje três mililitros de meio alimentar, cobrindo o fundo da placa.Cubra com um pano de gaze para prevenir contaminação e deixe o meio solidificar por uma hora, à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a tampa nas placas e feche as tampas com fita adesiva em dois lados. Prepare pequenos tampões de filme de parafina para cobrir os orifícios das placas enrolando pedaços de filme de parafina em rolos com espessura de zero vírgula dois centímetros.E então corte-os em segmentos de zero vírgula cinco centímetros. Corte dois pequenos orifícios na rolha para encaixar firmemente conexões roscadas tipo bulkhead. Adapte tampas de frascos de quatro vírgula cinco centímetros com uma rolha de Silcone de zero vírgula três dois centímetros de espessura.Conecte o tubo pequeno de PVC a ambas as saídas que saem do frasco e a apenas uma das entradas que entram no frasco. Em seguida, conecte um tubo de vidro à saída de cada frasco de cultura YPD, utilizando um tubo pequeno. Encha o tubo com fibra de vidro.E esterilize em autoclave antes do uso. Envolva as tampas ajustadas e os tubos em papel alumínio. E esterilize-os por 25 minutos a 120 graus Celsius e pressão de um bar.Mergulhe uma ponteira estéril de micropipeta de 100 microlitros em uma das colônias de levedura da placa de ágar YPD e coloque-a no frasco de meio líquido YPD autoclavado. Tampe o frasco de meio líquido YPD com levedura inoculada, bem como um frasco controle de meio YPD sem levedura, com tampas autoclavadas, montadas em uma saída. Para evitar contaminação do meio YPD com microrganismos, conecte o pequeno tubo a um filtro de seringa estéril de zero vírgula quatro cinco micrômetros, com um conector plástico tipo encaixe na extremidade do tubo, direcionado para o filtro.E um conector plástico rosqueável passando pelo filtro. Em seguida, conecte o tubo à entrada do frasco de cultura YPD. Coloque os frascos em placas magnéticas separadas.E agite a solução a 100 rpm, em temperatura ambiente, por 24 horas antes do início do experimento. Conecte as entradas de ambos os frascos a um tubo ligado ao ar pressurizado. Certifique-se de conectar a saída do frasco com levedura experimental a um tubo que direcione o odor da levedura para fora da sala experimental, evitando interferência no experimento.Conecte uma tubulação de PVC ao lado de saída do tubo de vidro e direcione-a para os orifícios inferiores da caixa de experimento. Usando um divisor em T, com diâmetro externo maior ou igual a zero vírgula cinco centímetros, e pequenos pedaços de tubo de PVC fino, conecte duas pipetas serológicas a cada uma das duas saídas nos dois lados. Fixe com fita as pipetas sobre a folha de papel branca abaixo das câmeras, dentro da caixa de aço.Use um pipetador de boca para colocar uma fêmea experimental em um pequeno recipiente de Petri no ZT seis. Deixe a mosca aclimatar-se à arena de acasalamento por uma hora. Após uma hora, no ZT sete, transfira um macho selvagem para o recipiente de Petri.E clique em Iniciar Monitoramento por 24 horas. Para o experimento com bomba de ar, posicione a placa de modo que a saída da pipeta esteja conectada ao orifício de entrada da arena de acasalamento. Para analisar o comportamento de acasalamento do casal, selecione abrir todas as imagens em um software de visualização de imagens.E percorra-os em ordem cronológica. Anote a data, o número do experimento, o número da placa e o horário de início em uma planilha, na mesma linha. Considere o horário de início de cada arena a partir do momento em que ela é colocada sob a câmera da webcam.Registre o carimbo de data e hora das imagens. Marque o horário de início de cada cópula na mesma linha, na planilha. Conte um acasalamento como um incidente quando o macho montar a fêmea e o casal permanecer moderadamente imóvel e na mesma postura por pelo menos cinco quadros consecutivos.A análise do ar com levedura, separado para o meio de alimento, mostra que um casal em acasalamento não responde aos odores de levedura quando não há levedura presente no meio de alimento. Porém, eles aumentam sua frequência de acasalamento no ar com levedura quando a levedura também é adicionada ao meio de alimento. A receptividade feminina aumenta na presença de ácido acético.Mas somente quando a peptona está presente no meio, demonstrando que as moscas precisam sentir simultaneamente aminoácidos e ácido acético para aumentar sua frequência de acasalamento. Uma vez dominada, esta técnica pode ser montada em seis horas. E a análise comportamental pode ser realizada em cinco horas, se feita corretamente.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Drosophila melanogaster é um sistema modelo de genética e comportamentalmente tratável que tem sido usada para compreender a base molecular e celular de muitos processos biológicos importantes para mais de um século 1. Drosophila tem sido bem explorado para obter insights sobre a base genética do comportamento da mosca.

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