Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em Drosophila melanogaster

O objetivo geral deste ensaio comportamental é quantificar o efeito das filas ambientais nos comportamentos reprodutivos, como namoro e acasalamento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia comportamental e da eurogenética. Como a inferência de fatores genéticos e ambientais sobre comportamentos reprodutivos e os mecanismos que moderam esses comportamentos.

Essa técnica oferece velocidade e flexibilidade no teste de uma ampla gama de filas ambientais que afetam a reprodução. E isso com um número muito bom de réplicas. Demonstrando o procedimento estará Jenke Gorter, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Comece o experimento preparando um litro de meio rico em mosca. Despeje um litro de água da torneira em um copo de vidro de dois litros com barra de agitação magnética. E coloque o copo em uma placa magnética.

Mantenha a agitação desligada e aumente o fogo até 300 graus Celsius, até atingir a temperatura de ebulição. Ligue a agitação a 500 rpm e adicione os ingredientes à água fervente. Espere o fermento espumar vigorosamente.

Em seguida, diminua a temperatura da placa quente para 120 graus Celsius. Após 10 minutos, abaixe a placa de aquecimento para 30 graus Celsius. E deixe a mistura mexer, até esfriar a 48 graus Celsius.

Monitore a temperatura inserindo um termômetro diretamente nos alimentos. Dissolva dois gramas de Tegosept em 10 mililitros de etanol a 96%. Combine a mistura e cinco mililitros de ácido propiônico molar no copo.

Mexa por três minutos. Aqueça uma agulha até a vermelhidão em um bico de bunsen. E faça um furo de 0,3 centímetros de diâmetro na parte superior de uma placa de Petri de plástico de 3,5 centímetros por 1,0 centímetro.

Ao preparar o meio alimentar, com compostos odoríferos, primeiro pipete 30 microlitros do composto desejado no prato para 1/2 dos pratos experimentais. Deixe a outra 1/2 dos pratos vazia para comparação. Usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, despeje três mililitros de meio alimentar, cobrindo o fundo do prato.

Cubra-o com um pano de algodão para evitar contaminação e deixe o meio solidificar por uma hora, em temperatura ambiente. Em seguida, coloque uma tampa na louça e feche as tampas com fita adesiva nos dois lados. Prepare pequenos tampões de filme de parafina para cobrir os orifícios dos pratos, enrolando pedaços de filme de parafina em rolos de dois centímetros de espessura.

E então corte-os em segmentos de cinco centímetros de ponto zero. Faça dois pequenos orifícios no septo para encaixar perfeitamente os encaixes farpados da antepara. Coloque tampas de garrafa abertas de quatro pontos e cinco centímetros com um septo Silcone de três pontos e dois centímetros de espessura.

Conecte o pequeno tubo de PVC a ambas as saídas que saem da garrafa e a apenas uma das entradas que entram na garrafa. Em seguida, conecte um tubo de vidro à saída de cada frasco de cultura YPD, usando um tubo pequeno. Encha o tubo com fibra de vidro.

E autoclave-o antes de usar. Enrole as tampas e tubos instalados em papel alumínio. E autoclave-os por 25 minutos a 120 graus Celsius e pressão de uma bar.

Mergulhe uma ponta de pipeta estéril de 100 microlitros em uma das colônias de levedura da placa de ágar YPD e coloque-a no frasco de meio líquido YPD autoclavado. Tampe este frasco de fermento e meio líquido YPD oculado, bem como um frasco de controle de meio YPD, sem fermento, com tampas autoclavadas, montadas dentro de uma saída. Para evitar a contaminação do meio YPD com microorganismos, conecte o pequeno tubo a um filtro de seringa estéril de quatro e cinco micrômetros de ponto zero, com um empurrão de plástico no conector do tubo do anteparo, indo em direção ao filtro.

E um parafuso no conector de anteparo de plástico saindo do filtro. Em seguida, conecte o tubo à entrada do frasco de cultura YPD. Coloque as garrafas em placas magnéticas separadas.

E agite a solução a 100 rpm, à temperatura ambiente, durante 24 horas antes do início da experiência. Conecte as entradas de ambas as garrafas a um tubo conectado ao ar pressurizado. Certifique-se de conectar a saída do frasco de fermento experimental a um tubo que libera o cheiro de fermento para fora da sala experimental, para evitar interferência no experimento.

Prenda o tubo de PVC ao lado de saída do tubo de vidro e leve-o em direção aos orifícios inferiores da caixa de experimento. Usando um divisor em T, com diâmetro externo maior ou igual a zero vírgula cinco centímetros, e pedaços curtos de pequenos tubos de PVC, conecte duas pipetas sorológicas a cada uma das duas saídas em ambos os lados. Cole as pipetas na folha de papel branco sob as câmeras, na caixa de aço.

Use uma pipeta de boca para colocar uma fêmea experimental em uma pequena placa de Petri em ZT seis. E permita que a mosca se acostume à arena de acasalamento por uma hora. Após uma hora, no ZT sete, transfira um macho do tipo selvagem para a placa de Petri.

E clique em Iniciar monitoramento por 24 horas. Para o experimento da bomba de ar, coloque o prato de forma que uma saída de pipeta seja conectada ao orifício de entrada da arena de acasalamento. Para analisar o comportamento de acasalamento do casal, selecione e abra todas as fotos, em um software de visualização de imagens.

E folheie-os em ordem cronológica. Anote a data, o número do experimento, o número do prato e a hora de início em uma planilha na mesma linha. Pegue a hora de início de cada arena a partir do momento em que ela é colocada sob a câmera da webcam.

Registre o carimbo de data/hora das fotos. Marque a hora de início de cada cópula na mesma linha, na planilha. Conte um acasalamento como um incidente, quando o macho montou na fêmea e o casal permanece moderadamente parado e na mesma postura, por pelo menos cinco quadros consecutivos.

A análise do ar de levedura, separado para o meio alimentar, mostra que um casal em acasalamento não responde aos odores de levedura quando não há levedura presente no meio alimentar. Mas eles aumentam sua frequência de acasalamento no ar de levedura quando a levedura também é adicionada ao meio alimentar. A receptividade feminina aumenta com a presença de ácido acético.

Mas apenas quando a peptona está presente no meio, demonstrando que as moscas precisam sentir simultaneamente aminoácidos e ácido acético, para aumentar sua frequência de acasalamento. Uma vez dominada, essa técnica pode ser configurada em seis horas. E a análise comportamental pode ser realizada em cinco horas, se feita corretamente.