Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox
22 de junho de 2017
Aqui apresentamos um protocolo Golgi-Cox com detalhes detalhados. Este método de mancha de tecido confiável permite uma avaliação de alta qualidade da citoarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro, com solução de problemas mínima.
O objetivo geral desta metodologia é corar adequadamente o tecido cerebral de Golgi para examinar e quantificar a morfologia e a complexidade dendrítica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência. Como a coloração de Golgi mancha apenas um pequeno subconjunto de células, essa técnica pode ser usada para rastrear a estrutura dos neurônios.
A principal vantagem dessa técnica é que as seções cerebrais podem ser facilmente manchadas sem risco de ressecar ou cair durante qualquer uma das etapas de lavagem. Demonstrando o procedimento estarão Fred Kiffer, Tyler Alexander e Julie Anderson, alunos de pós-graduação no laboratório do Dr. Allen. Comece imergindo semicérebros de roedores recém-colhidos e não fixados em cinco mililitros ou solução à base de cloreto de mercúrio.
Como a solução de cloreto de mercúrio é sensível à luz, cubra o tubo com papel alumínio. Armazene as amostras no escuro em temperatura ambiente. No dia seguinte, decantar lentamente a solução para um recipiente temporário antes de descartá-la adequadamente em um recipiente de resíduos de risco biológico.
Adicione cinco mililitros de solução fresca de cloreto de mercúrio e certifique-se de que os cérebros estejam imersos. Retorne as amostras ao escuro em temperatura ambiente por mais 13 dias. Após 14 dias, prepare o tampão pós-impregnação adicionando 30 gramas de tampão pós-impregnação energizado a 90 mililitros de água destilada ou deionizada, DH2O.
Encha cada poço da placa de seis poços com 6,5 mililitros do tampão pós-impregnação, um poço por cérebro. Em seguida, remova a solução de cloreto de mercúrio do tecido cerebral como antes. Enxágue o tecido com DH2O e, em seguida, transfira o tecido para as placas de seis poços com tampão pós-impregnação.
Cubra os pratos com papel alumínio e guarde em temperatura ambiente no escuro. No dia seguinte, aspire e substitua o tampão pós-impregnação. Cubra novamente o prato e guarde em uma geladeira de quatro graus Celsius.
Prepare duas ou três placas de 12 poços por cérebro, primeiro rotulando as placas em suas tampas com números em ordem crescente da esquerda para a direita e de cima para baixo. Adicione o número de identificação do cérebro seccionado. Pipete dois mililitros de 1X PBS em cada poço de cada placa, configure o stage e ligue o vibratome.
Em seguida, coloque fita adesiva no bloco de tecido do suporte da amostra e adicione um pouco de cola de cianoacrilato por cima. Remova um cérebro da placa de seis poços e coloque-o em um prato de plástico ou vidro. Use uma lâmina de aço inoxidável de dois gumes para cortar o cerebelo caudalmente, certificando-se de que a parte do cerebelo restante no cérebro seja plana.
Em seguida, coloque a superfície plana do cerebelo restante sobre a cola. Depois que a cola estiver seca, coloque o suporte da amostra com o tecido no banho da amostra. Coloque o banho de amostra no vibratomo e cubra a amostra de tecido com PBS.
Em seguida, prenda a lâmina ao porta-lâmina do vibratomo e abaixe lentamente a lâmina no banho de amostra até que esteja totalmente submersa e ligeiramente abaixo do topo do tecido. Em seguida, defina a velocidade do vibratomo para sete, a amplitude para seis e o ângulo de corte para 12 graus. Inicie a vibração e corte seções de 200 mícrons.
Use um pincel grande para mover as seções de tecido do banho de amostra para cada poço designado das placas de 12 poços. Continue a cortar o tecido até que o número desejado de seções de tecido seja alcançado. Após o seccionamento, use uma pipeta de transferência para aspirar o PBS dos poços da placa de 12 poços, adicione dois mililitros de PBS-T e lave por 30 minutos com agitação.
Perto do final do período de lavagem, diluir três partes de solução de hidróxido de amônio com cinco partes de DH2O. Em seguida, após remover o PBS-T, adicione a solução diluída de hidróxido de amônio. Proteja da luz com papel alumínio e manche as seções por 19 a 21 minutos.
Em seguida, depois de remover com segurança a solução de hidróxido de amônio, adicione tampão pós-coloração. Proteja com papel alumínio e manche por mais 19 a 21 minutos. Finalmente, enxágue as seções em PBS-T três vezes por cinco a 10 minutos de cada vez.
Monte as seções em lâminas revestidas de gelatina a 1% com o pincel grande. Deixe secar por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente, coloque-os em uma jarra Coplin e deixe durante a noite. Remova as lâminas do Coplin Jar e coloque-as em uma prateleira de plástico na hotte.
Coloque em uma mancha contendo 100% de etanol por cinco minutos. Desidratar as secções através de mais duas lavagens de etanol de cinco minutos. Em seguida, coloque as lâminas em uma prateleira de vidro e use uma alça de metal para abaixar a prateleira em um prato de mancha de vidro contendo 99% de xileno.
Lave as lâminas em duas trocas de xileno por cinco minutos cada. Após o tempo para a segunda lavagem, remova as lâminas do xileno, uma de cada vez, e cubra rapidamente o tecido com aproximadamente 0,25 mililitros de mídia de montagem. Em seguida, pegue uma tampa deslizante e coloque-a sobre a mídia.
Empurre todas as bolhas de ar presas por baixo das tampas deslizantes até a borda com um objeto pontiagudo, como a ponta do pincel. Coloque as lâminas em uma área longe da luz solar direta e deixe-as secar por dois a três dias. Após a secagem, proceda à aquisição das imagens ao microscópio e análise com o software apropriado.
Esta imagem de campo brilhante mostra um neurônio corado com Golgi que atende aos critérios para imagem e análise posterior. Todos os três tipos de coluna podem ser facilmente vistos. A coloração é consistente em todo o comprimento do dendrito e o dendrito é isolado de outros neurônios.
Esta figura mostra que os neurônios corados com Golgi dentro do giro dentado mostraram diminuição do comprimento na quarta e sexta ordem após o tratamento com 5-fluorouracil em comparação com o grupo tratado com solução salina. A coloração de Golgi pode ser usada para detectar diferenças significativas na densidade da coluna. Nos dendritos piramidais apicais CA1, a administração de 5-fluorouracil a camundongos vivos diminuiu significativamente a densidade da coluna.
Nos dendritos basais, não houve mudanças significativas na densidade geral dos espinhos. A análise de Sholl de dendritos piramidais apicais CA1 revelou que o tratamento com 5-fluorouracil diminuiu significativamente a arborização dendrítica a distâncias entre 40 a 160 mícrons de distância do soma. Nos dendritos basais, o tratamento com 5-fluorouracil diminuiu a arborização dendrítica em 30 a 110 mícrons de distância do soma.
Uma vez dominada, essa técnica, responsável pelo processo de coloração de Golgi e montagem, limpeza e cobertura, pode ser feita em três horas por cérebro, se executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurobiologia explorarem conexões neuroanatômicas em um modelo murino. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as seções em solução de hidróxido de amônio por apenas 19 a 21 minutos para não manchar demais os neurônios.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colorir, seccionar e enxaguar adequadamente o tecido cerebral. Não se esqueça de que trabalhar com a solução à base de cloreto de mercúrio, solução de hidróxido de amônio e xileno pode ser extremamente perigoso, portanto, tome precauções e use luvas de laboratório e trabalhe em uma capela ao realizar este procedimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado de Golgi-Cox para coloração de tecido cerebral, permitindo uma avaliação de alta qualidade da citarquitetura no hipocampo e em todo o cérebro. O método minimiza problemas técnicos e facilita o exame da morfologia e complexidade dendríticas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Neuroanatomia
- Histologia
Contexto
- A coloração de Golgi rotula seletivamente um pequeno subconjunto de neurônios.
- Essa técnica é fundamental para o rastreamento das estruturas neuronais.
- Ela permite a avaliação da complexidade dendrítica.
- As secções cerebrais permanecem intactas durante o processo de coloração.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método confiável para coloração de Golgi de tecido cerebral.
- Facilitar a análise da morfologia neuronal.
- Fornecer um protocolo que minimize o risco de dano tecidual.
Métodos Utilizados
- Imersão de hemisférios cerebrais de roedores não fixados em solução à base de cloreto de mercúrio.
- Aplicação do protocolo de coloração de Golgi-Cox.
- Avaliação da morfologia e complexidade dendríticas.
- Demonstração por estudantes de pós-graduação em um ambiente laboratorial.
Resultados Principais
- Coloração bem-sucedida de seções cerebrais sem secagem ou danos.
- Visualização de alta qualidade de estruturas neuronais.
- Rastreamento eficaz da morfologia dendrítica.
- Mínima necessidade de solução de problemas para o protocolo.
Conclusões
- O protocolo de Golgi-Cox é um método confiável para o estudo do tecido cerebral.
- Essa técnica aprimora a compreensão da arquitetura neuronal.
- É adequado para diversas aplicações em pesquisas de neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação da complexidade dendrítica no hipocampo fornece subsídios mecanicistas sobre as alterações neurocognitivas associadas ao envelhecimento e à exposição a quimioterápicos, auxiliando na validação de alvos no desenvolvimento de fármacos para o sistema nervoso central. O método de Golgi-Cox permite a avaliação quantitativa da arborização dendrítica e da densidade de espinhos dendríticos, oferecendo um sistema relevante para doenças no desvio pré-clínico de compostos neurotóxicos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao associar alterações estruturais neuronais a desfechos funcionais em modelos murinos envelhecidos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas a alterações neuroestruturais no hipocampo envelhecido.
- Valor Operacional: Oferece desvio biológico por meio da validação funcional do alvo relacionado à integridade dendrítica.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao quantificar alterações induzidas por compostos na densidade de espinhos e na arborização.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara tecido hipocampal validado para triagem de compostos em etapas subsequentes, com qualidade de coloração consistente.
- Saída Quantitativa: Fornece medidas reprodutíveis de comprimento dendrítico, ramificação e densidade de espinhos em sub-regiões hipocampais.
- Utilidade da Plataforma: Permite avaliação confiável de compostos por meio de fenotipagem neuroanatômica padronizada.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a vulnerabilidade hipocampal relacionada à idade a agentes quimioterápicos como o 5-fluorouracil.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica por meio de análise dendrítica específica por região.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta decisões de avanço ao identificar precocemente a suscetibilidade à neurotoxicidade na fase inicial do desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método Golgi-Cox integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação de hipóteses com alvos até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica de segurança, especialmente para compostos que penetram no SNC.
- Biologia de Descoberta: Apoia testes de hipóteses de vias neuroestruturais e desvio biológico de ambiguidade mecanicista.
- Triagem: Fornece tecido pronto para ensaio com saídas quantitativas de morfometria para comparação do efeito de compostos.
- Análises: Permite análise de Sholl e quantificação da densidade de espinhos para comparar condições e avaliar o impacto de compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta alterações estruturais do hipocampo à continuidade pré-clínica por meio de vulnerabilidade específica a regiões como CA1, CA3 e DG.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma histológica reutilizável para triagem neuroanatômica em diferentes áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista nas alterações estruturais neuronais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da avaliação da morfologia dendrítica em diferentes regiões cerebrais.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre avançar ou interromper projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento de neuroterapias.
- Impacto na Carteira: Priorização ajustada ao risco com base na complexidade dendrítica e na densidade de espinhos como biomarcadores translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em neurohistologia e manipulação de tecidos para a correta execução da coloração de Golgi.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo vibrátomo para corte e microscopia de campo claro para obtenção de imagens.
- Necessita padronização entre equipes distintas, envolvendo histologia, aquisição de imagens e análise, para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes regiões cerebrais ou modelos de doenças.
- Inclui limitações práticas, como o manuseio de reagentes perigosos (cloreto de mercúrio, hidróxido de amônio, xileno), exigindo o uso de capela de exaustão e EPI.
