Name: Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a iniciar, estender e conectar neuritos rapidamente usando câmaras microfluídicas e micropipetas guiadas por esferas revestidas com poli-D-lisina. Este método permite estudar taxas de crescimento neuronal e influências mecânicas.

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Gostaríamos de agradecer a Yoichi Miyahara por muitas discussões e informações úteis. MA e PG reconhecem o financiamento do CRSNG.

Todos os procedimentos detalhados abaixo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade McGill e estão de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais. 1. Padronização de culturas neuronais usando dispositivos microfluídicos: montagem de dispositivos <ol><li> Selecione um dispositivo microfluídico adequado para a experiência desejada. Para conectar neurônios dentro da mesma população, use o Neuro Devices ( Figura 1 ) e para conectar neurônios em diferentes populações, use os Dispositivos de Co-Cultura ( Figura 6 ). </li><li> Limpe e prepare o número desejado de lâminas estéreis ou pratos de fundo de vidro. Para obter melhores resultados em superfícies plásticas, use pratos de 35 mm, em vidro use lâminas de 25 mm ou pratos de fundo de vidro de 35 mm. Selecione a espessura do vidro com base no sistema de imagem, por exemplo 0,15 mm. </li><li> Revestir os pratos ou lâminas com 0,5-1 mL de 100 μg / mL de PDL durante 2 h ou durante a noite em temperatura ambienteAture. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado no dia seguinte, se desejado. Além disso, os pratos podem ser revestidos com PDL diluída com tampão borato, poli-L-lisina (PLL), laminina ou qualquer outra molécula de adesão celular. </li><li> Lave o prato duas vezes com água (não use solução salina tamponada com fosfato (PBS), pois os cristais de sal podem bloquear os canais), retire todo o líquido e deixe secar em um ambiente estéril, como um gabinete de biossegurança por 5-10 min ou até A superfície está completamente seca. Nota: Tenha cuidado para garantir que os lamínulas estejam absolutamente secas, pois qualquer líquido restante irá interferir com a aderência dos sistemas microfluídicos. </li><li> Coloque dispositivos microfluídicos com padrões voltados para cima sob luz UV em um ambiente estéril (gabinete de biossegurança) por 10 min. Certifique-se de seguir procedimentos estéreis quando estiver trabalhando no gabinete de segurança de biossegurança 10 . </li><li> Ao usar pinças, coloque um dispositivo microfluídico com padrão virado para baixo em contato com a capa limpaIp / prato. Use a pinça para pressionar suavemente o dispositivo para que ele adira ao copo. Nota: A transparência da região aderida será visível ao olhar contra a luz. Verifique se todos os cantos estão entrando em contato com o vidro. Faça isso com todos os dispositivos microfluídicos. Veja a Figura 1a . </li><li> Para preencher o dispositivo de população individual com meio, apontar a pipeta para os canais e adicionar 50 μL de meio celular completo suplementado com B-27 livre de soro (razão de volume 1:50) e 500 μg / mL de penicilina / estreptomicina / glutamina (coletivamente Chamado NBM) para o poço superior direito e, em seguida, adicione mais 50 μL ao poço deitado diagonalmente. Faça isso para todos os dispositivos, certificando-se de que o meio flua entre os poços. Em seguida, adicione 50 μL de meio aos dois poços restantes. Veja a Figura 2a . <ol><li> Para preencher o dispositivo de população múltipla com meio, apontar a pipeta para os canais e adicionar 30 μLDe NBM completo para os poços certos, consulte a Figura 6a . Faça isso para todos os dispositivos, certificando-se de que o meio flua entre os poços. Em seguida, adicione 50 μL de meio aos restantes 4 poços. </li></ol></li><li> Coloque os dispositivos em uma placa maior com um prato aberto com água autoclavada (câmara molhada) e coloque na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de umidade) durante 1-2 h enquanto prepara a cultura celular. Veja a Figura 2b . </li></ol> 2. Galvanização de neurônios em sistemas microfluídicos <ol><li> Seguindo o protocolo descrito na Ref. 8 , obtém neurônios dissociados de hipocampo ou cortical de embriões de ratos Sprague Dawley (qualquer gênero). </li><li> Ressuspenda os neurônios embrionários em NBM em uma concentração de 1-2 milhões de neurônios / mL. Verifique as concentrações celulares no microscópio usando um hemocitómetro e seguindo a referência 8 . Ajuste a concentração da célulaG para a densidade celular desejada. Para aumentar as chances de obter axônios do hipocampo simples por canal, apresente 10.000 neurônios por dispositivo. Para ter múltiplos axônios no mesmo canal, aplique 60.000 neurônios por dispositivo. Nota: Estes números variam de acordo com o tipo de neurônio utilizado. </li><li> Remova o meio dos dispositivos microfluídicos sem esvaziar os poços. Deixe aproximadamente 5 μL em cada um. </li><li> Para plaquear células no dispositivo de população única, adicione 50 μL de NBM no poço inferior direito. Neste ponto, o meio flui por si só para preencher o outro poço inferior. Adicione 20 μL da solução de célula concentrada no poço superior direito do dispositivo microfluídico, conforme indicado na Figura 1b . <ol><li> Para células de placa no dispositivo de população múltipla, adicione 20 μL da solução de célula de concentrado em cada um dos poços certos na Figura 6a . </li></ol></li><li> Verifique no microscópio se as célulasEstão dentro das câmaras e colocam os dispositivos na incubadora por 15 a 30 minutos para promover a fixação celular ao substrato. </li><li> Verifique no microscópio se houver células suficientes nas câmaras. Se for necessário mais, repita as etapas 2.4 e 2.5. </li><li> Adicione 50 μL de NBM aos 2 poços superiores do dispositivo de população única e 20 μL de NBM no mesmo bem que as células foram injetadas no dispositivo de população múltipla. A mídia sobe ligeiramente para formar um menisco positivo dando aos poços um aspecto de muffin top. Novamente, veja a Figura 2a . </li><li> Manter as células a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de umidade. </li></ol> 3. Manter as Culturas Neuronais <ol><li> Remova NBM (aproximadamente 30 μL com uma pipeta) das células e aplique novo NBM pré-aquecido no dia seguinte à sua introdução aos dispositivos (ou seja, 1 d após o passo 2). </li><li> Verifique a cada 2 dias se houver média suficiente em cada canal. Se o muffin tO op é baixo, apenas adicione mais poços médios aos melhores. </li><li> Células culturais durante pelo menos 7 d antes da remoção dos dispositivos microfluídicos. As células podem sobreviver nestes dispositivos por várias semanas. Remova os dispositivos 1-2 dias antes de as experiências serem realizadas em amostras. </li></ol> 4. Remoção de dispositivos microfluídicos <ol><li> 1 - 2 d antes da remoção de dispositivos microfluídicos, adicione 2 mL de NBM pré-aquecido a 37 ° C em cada prato de amostra, inundando as câmaras e mantendo os dispositivos na incubadora. </li><li> Use uma pinça estéril e uma ponta para remover os dispositivos microfluídicos das lamelas deixando uma configuração padronizada de neurônios. Use a ponta para segurar a lamínula no lugar e as pinças para apertar a borda do dispositivo no canto inferior esquerdo do poço. Aplicar delicadamente a torção, elevando o dispositivo com as pinças para que ele cai fora da lamínula. Veja a Figura 2c - 2d . </li><li> A cada 2-3 dias, substitua haSe o NBM for utilizado até a amostra para experiências. </li><li> Antes de realizar experimentos de re-câmbio na amostra, verifique se os neurites nos canais de dispositivo de população única e as populações neuronais no dispositivo de população múltipla são isolados examinando as lacunas entre eles no microscópio para garantir que não haja filamentos que liguem as populações neuronais. </li></ol> 5. Preparação de grânulos revestidos com PDL <ol><li> Adicione 2 x 50 μL de gotas de pérolas de poliestireno de 4, 10 ou 20 μm diluídas em água (1: 500) para 1 mL de PDL (100 μg / mL). Deixe durante pelo menos 2 h à temperatura ambiente. Nota: O protocolo pode ser pausado aqui e retomado no dia seguinte. </li><li> Centrifugar a solução a 8 820 xg durante 1 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as contas acumuladas no fundo do recipiente. </li><li> Lave as contas duas vezes com 1 mL de solução esterilizada 10 mM de HEPES pH 8.4. </li><li> Ressuspender os grânulos revestidos com PDL em 200 mL de HEPES 10 mM pH 8.4solução. </li></ol> 6. Preparando Micropipetas <ol><li> Prepare pipetas de tubos capilares de vidro (1 mm de diâmetro interno, 1,5 mm de diâmetro externo) usando um extrator de eletrodo horizontal. Ajuste as configurações para que a ponta externa da micropipeta puxada seja ~ 2-5 μm. Antes de puxar, certifique-se de que os tubos de vidro estejam limpos. </li><li> Fixar pipetas para lâminas de vidro para armazenamento e garantir que a ponta não entre em contato com a superfície do slide, pois a ponta é frágil. Armazenar à temperatura ambiente em um recipiente coberto para proteger da poeira. Use pipetas no mesmo dia em que são puxados. </li></ol> 7. Adesão do pêndulo PDL aos neurônios <ol><li> Adicionar 40-60 μL de pérolas revestidas com PDL preparadas no passo 5 para uma cultura celular preparada no passo 4. Centre a ponta da pipeta sobre os neurônios, que são visivelmente visíveis na lamela e adicione as contas (veja a Figura 3 ). </li><li> Devolver a amostra à incubadora por 1 h para promover a formação de syContatos napticos 8 , 9 . </li><li> Após a incubação, remova todas as pérolas não aderidas lavando suavemente a cultura com NBM pré-aquecido. </li></ol> 8. Preparando Solução Salina Fisiológica (para Experimentos de Temperatura do Quarto) <ol><li> Prepare solução salina fisiológica combinando os ingredientes listados nas referências 7 , 8 . Isto é para regular o ambiente celular fora da incubadora. </li><li> Verifique os níveis de osmolaridade e pH como indicado nas referências 7 , 8 . </li><li> Infundir continuamente a solução com O 2 para minimizar as flutuações do pH ao realizar experimentos. </li><li> Calor até a temperatura ambiente. </li><li> Configure o sistema de perfusão inserindo uma extremidade de um tubo de plástico (dimensões opcionais) em solução fisiológica induzida por O2 e corrigindo o outro eE a uma agulha inserida no suporte da amostra. Coloque a tubulação e a solução mais alta que a amostra (veja a Figura 4 ). <ol><li> Desconecte o tubo da agulha e conecte-o a uma seringa. Use a seringa para exercer pressão e desenhe o líquido, enchendo o tubo. Selar com um grampo de rolo e reconectar a agulha. </li></ol></li></ol> 9. Micromanipulação de grânulos <ol><li> Instale a amostra em uma configuração experimental de modo que as células possam ser acessadas a partir de cima por duas micropipetas montadas em micromanipuladores e acessadas opticamente abaixo, por exemplo, com o objetivo da fase 40X (abertura numérica de 0,6) de um microscópio óptico invertido. Nesta configuração, monte uma câmera CCD para captura de imagem na porta lateral do microscópio. Conecte cada pipeta a seringas de 1 mL por meio de tubos de plástico. Nesta etapa, substitua NBM por solução salina fisiológica (1-2 mL) (veja a Figura 4 ). </li><li> Durante a experiência, Células de perfusão contínuas com a solução salina fisiológica preparada no passo 8 a uma taxa de 0,5-1 mL / min. </li><li> Selecione um PDL-bead NÃO ligado a um neurônio no campo de visão. Alinhe o talão com uma ponta de micropipetas, concentrando-se no talão e até a micropipeta. Traga a ponta para baixo o mais próximo possível da perna monitorando-a através do microscópio. </li><li> Aplique pressão negativa com a seringa de 1 mL conectada à pipeta para retirar o talão. Mantenha a pressão negativa durante todo o experimento. </li></ol> 10. Neurites puxando <ol><li> Selecione um retículo PDL ligado a um neurônio no campo de visão e anexe-o à segunda micropipleta usando sucção como descrito nos passos 9.3-9.4. </li><li> Puxe o complexo PDL-bead-neurônio lentamente (~ 0,5 μm / min) movendo o micromanipulador ou o estágio da amostra em 1 μm e pausando durante 5 minutos para permitir a iniciação dos neurites. </li><li> Repita o passo 10.2 duas vezes. Nota: Os primeiros 3 &amp;# 181; m tem que ser puxado muito devagar para garantir o sucesso experimental, que ocorre em mais de 95% do tempo. </li><li> Puxe o complexo PDL-bead-neurônio lentamente (~ 0,5 μm / min) movendo o micromanipulador ou o estágio da amostra em 2 μm e pausando durante 5 minutos para permitir o alongamento dos neurites. </li><li> Após a iniciação bem sucedida e extensão de neurite para os primeiros 5 μm, puxe a neurite a 20 μm / min em distâncias da escala milimétrica. Nota: A puxar pode ser realizada de forma contínua ou em etapas e em taxas variáveis. Veja a Figura 5b- 5c . </li></ol> 11. Conectando Neurônios <ol><li> Selecione uma região rica em neurites e abaixe o complexo PDL-bead-neurite para contatá-lo fisicamente. Use outras contas para medir a altura da ponta acima da superfície do coxiforme. Veja a Figura 5d . </li><li> Deixe o complexo PDL-bead-neurite em contato com o neurite alvo enquanto manipula o segundo micropiPette. Abaixe a segunda pipeta com o segundo pérolas PDL em cima do neurite recém formado, cerca de 20 μm, formam o primeiro talão. Use o segundo pino PDL para empurrar o novo filamento neurítico para a célula alvo. </li><li> Segure ambas as pérolas no lugar por pelo menos 1 h. Verifique a ausência de inchaço focal, um espessamento dos neurites em contato com o grânulo, com o microscópio 16 . </li><li> Durante este tempo, use a perfusão para mudar lentamente o meio da amostra da solução salina fisiológica para o NBM pré-aquecido e com CO2 equilibrado. </li><li> Solte o cordão da segunda pipeta soltando a sucção. Se o novo neurite permanecer em anexo, solte o primeiro talão também. Veja a Figura 5e . </li><li> Retire suavemente a solução salina e substitua-a com NBM (~ 2 mL). </li><li> Coloque cuidadosamente a amostra na incubadora para fortalecer a conexão neuronal para futuras experiências. Esta conexão é estável por&gt; 24 h 7 </sup&gt;. </li></ol> 12. Verificando a funcionalidade da nova conexão através de gravações de grampos de patchs com células inteiras <ol><li> Siga as referências 7 , 18 , 19 . Para montar uma instalação de eletrofisiologia. </li><li> Siga as referências 7 . Para preparar os eletrodos pré e pós-sinápticos. </li><li> Reúna dados de grampos de patch, novamente seguindo as referências 18 , 19 . </li><li> Compare os resultados com os sinais 7 de ocorrência natural para determinar o tipo de conexão. </li></ol>

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A autora Margaret H Magdesian é a CEO da Ananda Devices que produz instrumentos utilizados neste artigo.

Usando micromanipulação padrão e dispositivos microfluídicos inovadores, uma nova técnica foi desenvolvida para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em grandes distâncias. A micromanipulação de pipeta é uma ferramenta comum na maioria dos laboratórios de neurociência 4 , 13 . O verdadeiro desafio para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis ​​foi a padronização de culturas neuronais saudáveis ​​e posicionadas com p...

As lesões do sistema nervoso central do adulto (SNC) podem levar à incapacidade permanente devido a múltiplos mecanismos que limitam o crescimento do crescimento axonal 1 . Após a lesão, muitos axônios do SNC não formam um novo cone de crescimento e não conseguem montar uma resposta regenerativa efetiva 2 . Além disso, danos e tecido cicatricial que envolvem lesões do SNC inibem significativamente o crescimento axonal 1 , 2 , 3 . As terapias atuais para promover a regeneração do SNC após a lesão se concentraram no aumento do potencial de crescimento intrínseco do neurônio lesado e no encobrimento dos inibidores da extensão axonal associada aos detritos de mielina e à cicatriz glial 1 , 3 . Apesar disso, a capacidade de regenerar axônios longos para alvos distantes e formar sinapses funcionais adequadas permanece severamente limitada 4 , </suP&gt; 5 , 6 , 7 . No presente trabalho, micrometras, micromanipulação de pipeta e dispositivos microfluídicos são usados ​​para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em longas distâncias. O trabalho anterior mostrou que os grânulos revestidos com poli-D-lisina (pílulas PDL) induzem a adesão da membrana seguido pelo agrupamento de complexos de vesículas sinápticas e a formação de boutons presinápticos funcionais 8 . Também foi demonstrado que, quando o retículo PDL é mecanicamente puxado após a diferenciação pré-sináptica, o conjunto de proteína sináptica segue o grânulo, iniciando um novo neurite 9 . O procedimento a seguir explora esse fato, juntamente com a capacidade de cultura de neurônios embrionários do hipocampo de ratos em regiões organizadas em uma lamínula usando dispositivos microfluídicos de polidimetilsiloxano (PDMS) para recarregar precisamente um neurônioo circuito. Estes dispositivos microfluídicos PDMS são não tóxicos, transparentes opticamente e consistem em duas câmaras conectadas por um sistema de microcanais. Uma vez montado em uma lamínula, cada dispositivo serve como um molde para orientar o crescimento neuronal e manter culturas neuronais saudáveis ​​em padrões precisos por mais de 4 semanas in vitro . Aqui, é apresentada uma estrutura para investigar os limites de extensão e funcionalidade do novo neurite. Novites neurites funcionais são criados e posicionados para controlar (re) redes neuronais de rede controláveis. As taxas de extensão alcançadas são mais rápidas do que 20 μm / min em distâncias de escala milimétrica e as conexões funcionais são estabelecidas. Estes resultados mostram, inesperadamente, que a capacidade intrínseca desses neurites para o alongamento é muito mais rápida do que se pensava anteriormente. Esta abordagem mecânica proposta ultrapassa as estratégias químicas lentas e permite a conexão controlada a um alvo específico. ºA técnica abre novos caminhos para o estudo in vitro de novas terapias para restaurar a conectividade neuronal após a lesão. Também permite a manipulação e reconexão de redes neuronais para investigar aspectos fundamentais do processamento de sinal neuronal e função neuronal in vitro .

<table><tbody><tr><td>Dispositivos de co-cultura</td><td>Ananda Devices</td><td></td><td>Comercialmente disponível na http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Neuro devices</td><td>Ananda Devices</td><td></td><td>Comercialmente disponível na http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0705</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Plates #0, não revestido, irradiado por gama</td><td>MatTex Incorporação</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 35 mm, não pirogênica, placa de</td> Petri <td>430165</td><td></td>de <td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm estéril Corning Inc, tampa deslizável, poliestireno estéril</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL com graduações impressas e tampas planas</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 15 mL, estilo 17 x 120 mm, não pirogênico, falcão estéril</td><td></td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Solução extracelular</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), suplemento B-27 sem soro</td><td>(50X),</td> solução <td>extracelular</td><td>sem 17504044</td> sem soro</tr><tr><td>Penoniclinina, Estreptomiocina, Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11995-065</td><td>Solução extracelular</td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipettors</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mu; L Pipettors</td><td>Pontas Resistentes a Aerossóis</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 3mL Pipetas de Transferência [Não Estéril]</td><td>BD Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Gibco</td><td>15023-021</td><td>Solução extracelular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Solução extracelular / Beads</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Solução</td></tr> <tr><td>extracelularKCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Solução extracelular</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>Solução extracelular</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Solução extracelular</td></tr><tr><td>#5 Pinças Dumont Dumostar 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina Hidrobrometo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Micropartículas à base de poliestireno, 10 &mu; m</td> Tubos de borosilicato <td>Sigma-Aldrich</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td></td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>Extrator de Pipetas Horizontal 14696-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators, Série PCS-5000</td><td>SD Instruments</td><td>MC7600R</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD Luer-Lok</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UIS2, LUCPLFLN 40X</td><td></td></tr><tr><td>CCD Câmera</td><td>Photometrics</td><td>Cascade II: 512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1x) L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td>Dissecção de Rato</td></tr><tr><td>Typsin-EDTA (0,05%), Fenol vermelho</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>Dissecção</td></tr> <tr><td>de RatoDMEM (1x) Meio Eagle Modificado de Dulbecco [+4,5 g/L D-Glicose, + L-Glutamina, + 110 mg/L de Piruvato de Sódio]</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>Dissecção de Rato</td></tr><tr><td>HBSS (1x) Solução Salina Balanceada de Hank [- Cloreto de Cálcio, - Cloreto de Magnésio, - Sulfato de Magnésio]</td><td>Life Technologies</td><td>14170-112</td><td>Dissecção de Rato</td></tr></tbody></table>

rewiring neuronal circuits: um novo método para fast neurite extension e functional neuronal connection

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Lesões do cérebro e da medula espinhal podem levar à incapacidade permanente e à morte, porque ainda não é possível regenerar os neurônios em longas distâncias e reconectá-los com precisão com um alvo apropriado. Aqui, um procedimento é descrito para iniciar, alongar e conectar com precisão novos circuitos neuronais funcionais em longas distâncias. As taxas de extensão alcançadas atingem mais de 1,2 mm / h, 30-60 vezes mais rápido do que as taxas in vivo dos axônios de crescimento mais rápido do sistema nervoso periférico (0,02 a 0,04 mm / h) 28 e 10 vezes mais rápido do que o relatado anteriormente para o mesmo Tipo neuronal em um estágio anterior de desenvolvimento 4 . Em primeiro lugar, as populações isoladas de neurônios do hipocampo de ratos são cultivadas por 2-3 semanas em dispositivos microfluídicos para posicionar com precisão as células, possibilitando uma fácil micromanipulação e reprodutibilidade experimental. Em seguida, as pérolas revestidas com poli-D-lisina (PDL) são colocadas em neurites para formar contatos de adesivoOs atos e a micromanipulação de pipeta são usados ​​para mover o complexo resultante do bead-neurite. À medida que o talão é movido, ele tira um novo neurite que pode ser estendido sobre centenas de micrômetros e funcionalmente conectado a uma célula alvo em menos de 1 h. Este processo permite reprodutibilidade experimental e facilidade de manipulação, ignorando estratégias químicas mais lentas para induzir o crescimento de neurites. As medidas preliminares aqui apresentadas demonstram uma taxa de crescimento neuronal muito superior aos fisiológicos. A combinação dessas inovações permite o estabelecimento preciso de redes neuronais em cultura com um grau de controle sem precedentes. É um método inovador que abre a porta a uma infinidade de informações e insights sobre a transmissão e comunicação de sinais dentro da rede neuronal, além de ser um campo de jogos para explorar os limites do crescimento neuronal. As aplicações e experiências em potencial são generalizadas com implicações diretas para terapias que visam reconectar a neuronaL após trauma ou em doenças neurodegenerativas.

Os neurônios do hipocampo do rato embrionário são cultivados em dispositivos microfluídicos para permitir o posicionamento preciso de células, PDL-beads e micromanipuladores. O primeiro passo é montar adequadamente o dispositivo microfluídico em uma lamínula de vidro ou prato. É essencial que o dispositivo microfluídico esteja bem ligado ao substrato para evitar células que saem das câmaras e se movendo sob as partes do dispositivo que devem ser seladas ( Figura 1a</...

Este procedimento descreve como iniciar rapidamente, estender e conectar neurites organizados em câmaras microfluídicas usando pérolas revestidas de poli-D-lisina fixadas em micropipetas que guiam o alongamento de neurites.

Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

O objetivo geral deste procedimento é iniciar novos neuritos, estendê-los rapidamente e conectá-los com precisão a células-alvo. Esse procedimento só é possível utilizando células cultivadas em um ambiente controlado e reprodutível. Este método nos permite responder perguntas fundamentais na neurociência.O que limita a taxa de crescimento dos neurônios? Quão rápido eles podem crescer? Os sinais mecânicos desempenham um papel?Também podemos estudar como as sinapses são formadas, como os neurônios encontram uma célula-alvo? Como as sinapses envelhecem, amadurecem? E, em terceiro lugar, podemos começar a construir sistematicamente redes neurais, estudando como os neurônios realizam cálculos.As principais vantagens desta técnica são que ela permite manipulação fácil, reprodutibilidade experimental e, em última instância, um alto grau de controle no nível de célula única. Para iniciar este procedimento, limpe e prepare o número desejado de lamínulas estéreis. Em seguida, recubra cada lamínula com 0,5 a 1 mililitro de PDL a 100 microgramas por mililitro por pelo menos duas horas à temperatura ambiente.Em seguida, lave as lamínulas duas vezes com água e remova todo o líquido. Deixe secar em um ambiente estéril por 5 a 10 minutos ou até que a superfície esteja completamente seca. Então, posicione os dispositivos microfluídicos com os padrões voltados para cima sob luz UV em uma câmara de segurança biológica por 10 minutos.Após 10 minutos, posicione um dispositivo microfluídico com o padrão voltado para baixo em contato com a lamínula limpa. Use a pinça para pressionar suavemente o dispositivo, fazendo com que adira ao vidro. Para preencher o dispositivo de população única com meio, adicione 50 microlitros de meio celular completo no poço superior direito.Em seguida, adicione mais 50 microlitros de meio celular completo ao poço diagonal a ele. Para preencher o dispositivo de múltiplas populações com meio, adicione 30 microlitros de NBM completo a uma fileira de poços. Certifique-se de que o meio flua entre os poços.Em seguida, adicione 50 microlitros de meio a cada um dos poços restantes. Coloque os dispositivos em uma placa maior com um recipiente aberto contendo água autoclavada e posicione o recipiente na incubadora por uma a duas horas enquanto prepara o cultivo celular. Agora, remova o meio dos poços superiores dos dispositivos microfluídicos sem esvaziar os poços.Em seguida, adicione 20 microlitros da solução concentrada de células no poço superior direito do dispositivo microfluídico e verifique ao microscópio como as células fluem dentro do dispositivo microfluídico de população única. Para semear as células no dispositivo de múltiplas populações, adicione 20 microlitros da solução concentrada de células em cada um dos poços superiores. Ao microscópio, verifique se as células estão dentro das câmaras.Em seguida, coloque os dispositivos no incubador por 15 a 30 minutos para promover a adesão das células ao substrato. Após as células aderirem ao substrato, adicione 40 microlitros de NBM aos dois poços superiores do dispositivo de população única. Isso ajudará a remover as bolhas de ar dos microcanais.Adicione 20 microlitros de MBM aos poços superiores do dispositivo de múltiplas populações, exatamente aos poços onde as células foram injetadas. O meio deve protruir levemente, formando um menisco positivo e conferindo aos poços uma aparência semelhante à de um muffin. Um a dois dias antes da remoção do dispositivo microfluídico, adicione dois mililitros de NBM pré-aquecido a cada placa de amostra e alague as câmaras.Em seguida, mantenha os dispositivos no incubador. Posteriormente, utilize pinças estéreis e uma ponta de pipeta para remover os dispositivos microfluídicos das lamínulas, deixando uma configuração padronizada de neurônios. Neste procedimento, adicione 40 a 60 microlitros das microesferas revestidas com PDL preparadas à cultura celular.Em seguida, retorne a amostra ao incubador por uma hora para promover a formação de contatos sinápticos. Posteriormente, instale a amostra em uma configuração experimental de modo que as células possam ser avaliadas por cima por duas micropipetas e também sejam acessíveis opticalmente. Nessa configuração, uma câmera CCD está localizada na porta lateral do microscópio para captura de imagens.Conecte cada pipeta preenchida com solução salina a uma seringa de um mililitro, em seguida, perfuse a amostra com solução salina fisiológica. Depois, sob o microscópio, verifique a lacuna entre as duas populações neuronais isoladas para garantir que as duas populações não estejam naturalmente conectadas. Selecione uma microesfera de PDL que não esteja ligada ao neurônio no campo de visão.Alinhe a esfera com a ponta de uma micropipeta focalizando primeiro na esfera e depois na micropipeta. Em seguida, aproxime ao máximo a ponta da esfera monitorando-a pelo microscópio. Então, aplique pressão negativa à pipeta para capturar a esfera e mantenha a pressão negativa durante todo o experimento.Agora, selecione uma microesfera de PDL ligada a um neurônio no campo de visão e fixe-a à segunda micropipeta usando sucção. Puxe o complexo de microesfera de PDL e neurônio movendo lentamente o micromanipulador ou a platina da amostra a 0,5 micrômetros por minuto por 1 micrômetro e pause por cinco minutos para permitir a iniciação do neurito. Puxe o complexo de microesfera de PDL e neurônio movendo-o lentamente lateralmente a 0,5 micrômetros por minuto por dois micrômetros, depois pause por cinco minutos para permitir a alongamento do neurito.Após a iniciação bem-sucedida e extensão do neurito pelos primeiros cinco micrômetros, puxe continuamente o neurito a uma velocidade de 20 micrômetros por minuto. Para conectar os neurônios, selecione uma região rica em neuritos. Utilize outras esferas para avaliar a altura da ponta da pipeta acima do lamínula e abaixe o complexo de esfera PDL com neurito de modo que entre em contato físico com os neuritos.Deixe o complexo de neurite com esfera de PDL em contato com o neurite alvo enquanto manipula a segunda micropipeta. Em seguida, abaixe a segunda pipeta com a segunda esfera de PDL sobre o neurite recém-formado, a cerca de 20 micrômetros da primeira esfera, e use a segunda esfera de PDL para empurrar o novo filamento de neurite em direção à célula-alvo. A seguir, mantenha ambas as esferas fixas por pelo menos uma hora.Verifique a ausência de inchaço focal, um espessamento dos neuritos que entram em contato com a esfera, utilizando o microscópio. Durante esse período, troque lentamente o meio da amostra de salina fisiológica para NBM equilibrado com dióxido de carbono e pré-aquecido. Solte a esfera da segunda pipeta ao liberar a sucção.Se o novo neurite permanecer preso, solte também a primeira esfera. Depois, coloque cuidadosamente a amostra de volta no incubador para fortalecer a conexão neuronal para experimentos futuros. Você pode utilizar gravações por fixação de patch de célula inteira para investigar a funcionalidade elétrica da conexão micromanipulada.Mostram-se aqui as populações neuronais isoladas separadas por uma lacuna de 100 micrômetros em microdispositivos de PDMS. Realizaram-se pares de gravações por patch clamp em configuração de célula inteira, e analisaram-se as conexões induzidas mecanicamente, comparando-as com aquelas em populações neuronais naturalmente conectadas e populações não conectadas. As respostas elétricas após o potencial de ação pré-sináptico registradas dos neurônios conectados naturalmente e por micromanipulação são significativamente maiores e correlacionam-se temporalmente com a atividade pré-sináptica.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em oito horas se for feita corretamente, e ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter culturas celulares de longo prazo saudáveis e bem organizadas para garantir resultados rápidos e reproduzíveis. Após este procedimento, diferentes métodos podem ser utilizados para verificar a funcionalidade elétrica da conexão micromanipulada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar populações celulares em câmaras microfluídicas e utilizar manipulações com pipeta para iniciar, estender e conectar neuritos.

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Neuroscience

Neurociência

Perspectivas sobre Neuroscience

Este vídeo demonstra uma técnica para a rápida iniciação e extensão de um neurônio e criação de novas conexões com um neurônio alvo usando um dispositivo microfluídico e micromanipulação. Isso pode ser usado para terapias que visam reconectar circuitos neuronais após trauma ou em doenças neurodegenerativas.

Iniciando a extensão e formação rápidas de neuritos Conexões neuronais funcionais

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.

Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Este manuscrito detalha a fabricação de redes neurais manipuladas com micro-tecidos: construções tridimensionais de tamanho micrométrico, constituídas por longos trilhos axonais alinhados que abrangem a (s) população (s) neuronal agregada (s) envolvida (s) em um hidrogel tubular. Esses andaimes vivos podem servir como relés funcionais para reconstruir ou modular circuitos neurais ou como bancas biofidais que imitam a neuroanatomia de matéria cinza-branca.

Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Aqui nós apresentamos um método para um modelo humano em vitro de lesão de estiramento em um formato de 96 poços, numa escala de tempo relevante para o impacto do trauma. Isto inclui métodos para a fabricação de placas stretchable, quantificando o insulto mecânico, cultivo e ferindo células, imagem e análise de conteúdo elevado de quantificar a lesão.

Método para alta velocidade lesão de estiramento de humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de neurônios em um formato de 96 poços

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Os ensaios de crescimento de neuritos fornecem um valor quantitativo sobre os processos neuronais regenerativos. A vantagem deste software semiautomático é que ele segmenta corpos celulares e neurites separadamente, criando uma máscara e mede vários parâmetros, como comprimento de neurites, número de pontos de ramificação, área de aglomerado de células-corpo e número de aglomerados de células.

Padronização de um novo software semiautomático para medição de crescimento de neuritos 

Aprenda a iniciar, estender e conectar neuritos rapidamente usando câmaras microfluídicas e micropipetas guiadas por esferas revestidas com poli-D-lisina. Este método permite estudar taxas de crescimento neuronal e influências mecânicas.

Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

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