Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

O objetivo geral deste procedimento é iniciar novos neurites, estendê-los rapidamente e conectá-los com precisão às células-alvo. Este procedimento só é possível usando células cultivadas em um ambiente controlado e reprodutível. Este método nos permite responder a questões-chave da neurociência.

O que limita a taxa de crescimento dos neurônios? Quão rápido eles podem crescer? As pistas mecânicas desempenham um papel?

Também podemos estudar como as sinapses são formadas, como os neurônios encontram uma célula-alvo? Como as sinapses envelhecem, amadurecem? E em terceiro lugar, podemos começar a construir sistematicamente redes neurais, estudar como os neurônios computam.

As principais vantagens dessa técnica são que ela permite fácil manipulação, reprodutibilidade experimental e, finalmente, um alto grau de controle no nível de uma única célula. Para iniciar este procedimento, limpe e prepare o número desejado de lamínulas estéreis. Em seguida, cubra cada lamínula com 0,5 a 1 mililitros de 100 microgramas por mililitro PDL por pelo menos duas horas em temperatura ambiente.

Depois disso, lave as lamínulas duas vezes com água e retire todo o líquido. Deixe-os secar em um ambiente estéril por 5 a 10 minutos ou até que a superfície esteja completamente seca. Em seguida, coloque os dispositivos microfluídicos com os padrões voltados para cima sob a luz ultravioleta em um gabinete de biossegurança por 10 minutos.

Após 10 minutos, coloque um dispositivo microfluídico com o padrão voltado para baixo em contato com a lamínula limpa. Use a pinça para pressionar suavemente o dispositivo para que ele adira ao vidro. Para preencher o dispositivo de população única com meio, adicione 50 microlitros de meio de célula completa ao poço superior direito.

E então adicione mais 50 microlitros de meio celular completo ao poço na diagonal dele. Para preencher o dispositivo de múltiplas populações com meio, adicione 30 microlitros de NBM completo a uma fileira de poços. Certifique-se de que o meio flua entre os poços.

Em seguida, adicione 50 microlitros de meio a cada um dos poços restantes. Coloque os dispositivos em um prato maior com um prato aberto de água autoclavada e coloque o prato na incubadora por uma a duas horas enquanto prepara a cultura de células. Agora, remova o meio dos poços superiores dos dispositivos microfluídicos sem esvaziar os poços.

Em seguida, adicione 20 microlitros da solução celular concentrada no poço superior direito do dispositivo microfluídico e verifique no microscópio como as células fluem dentro do dispositivo microfluídico de população única. Para plaquear células no dispositivo de múltiplas populações, adicione 20 microlitros da solução celular concentrada em cada um dos poços superiores. Sob o microscópio, verifique se as células estão dentro das câmaras.

Em seguida, coloque os dispositivos na incubadora por 15 a 30 minutos para promover a fixação das células ao substrato. Depois que as células se ligarem ao substrato, adicione 40 microlitros de NBM aos dois poços superiores do dispositivo de população única. Isso ajudará a remover as bolhas de ar dos microcanais.

Adicione 20 microlitros de MBM aos poços superiores do dispositivo de populações múltiplas, os mesmos poços onde as células foram injetadas. A mídia deve se projetar ligeiramente para formar um menisco positivo e dar aos poços um aspecto de topo de muffin. Um a dois dias antes da remoção do dispositivo microfluídico, adicione dois mililitros de NBM pré-aquecido a cada prato de amostra e inunde as câmaras.

Em seguida, mantenha os dispositivos na incubadora. Em seguida, use uma pinça estéril e uma ponta de pipeta para remover os dispositivos microfluídicos das lamínulas, deixando uma configuração padronizada de neurônios. Neste procedimento, e 40 a 60 microlitros dos grânulos revestidos com PDL preparados para a cultura de células.

Em seguida, devolva a amostra à incubadora por uma hora para promover a formação de contatos sinápticos. Posteriormente, instale a amostra em uma configuração experimental de modo que as células possam ser avaliadas de cima por duas micropipetas e também acessadas opticamente. Nesta configuração, uma câmera CCD está localizada na porta lateral do microscópio para captura de imagem.

Conecte cada pipeta cheia de solução salina a uma seringa de um mililitro e, em seguida, perfunda a amostra com solução salina fisiológica. Em seguida, sob o microscópio, verifique a lacuna entre as duas populações neuronais isoladas para garantir que as duas populações não estejam naturalmente conectadas. Selecione um cordão PDL que não esteja conectado ao neurônio no campo de view.

Alinhe o cordão com uma ponta de micropipeta concentrando-se no cordão e depois na micropipeta. Em seguida, aproxime a ponta o mais possível do cordão, monitorando-a ao microscópio. Em seguida, aplique pressão negativa na pipeta para pegar o cordão e mantenha a pressão negativa durante todo o experimento.

Agora, selecione um grânulo PDL conectado a um neurônio no campo de visão e conecte-o à segunda micropipeta usando sucção. Puxe o complexo de neurônios do grânulo PDL movendo lentamente o micromanipulador ou o estágio de amostra a 0,5 micrômetros por minuto por 1 micrômetro e faça uma pausa de cinco minutos para permitir o início do neurite. Puxe o complexo de neurônios do grânulo PDL movendo-o lentamente lateralmente a 0,5 micrômetros por minuto em dois micrômetros e, em seguida, faça uma pausa de cinco minutos para permitir o alongamento do neurito.

Após a iniciação bem-sucedida e a extensão do neurite nos primeiros cinco micrômetros, puxe continuamente o neurite a 20 micrômetros por minuto. Para conectar os neurônios, selecione uma região rica em neurites. Use outros grânulos para medir a altura da ponta da pipeta acima da lamínula e abaixe o complexo de neuritos do grânulo PDL para que ele entre em contato fisicamente com os neuritos.

Deixe o complexo de neurite do grânulo PDL em contato com o neurite alvo enquanto manipula a segunda micropipeta. Em seguida, abaixe a segunda pipeta com o segundo cordão PDL em cima do neurite recém-formado a cerca de 20 micrômetros do primeiro grânulo e use o segundo cordão PDL para empurrar o novo filamento de neurite em direção à célula-alvo. Em seguida, segure as duas contas no lugar por pelo menos uma hora.

Verifique a ausência de inchaço focal, um espessamento dos neuritos em contato com o cordão, com o microscópio. Durante esse tempo, mude lentamente o meio da amostra de solução salina fisiológica para NBM equilibrado com dióxido de carbono pré-aquecido. Solte o cordão da segunda pipeta liberando a sucção.

Se o novo neurite permanecer preso, solte também o primeiro cordão. Depois, coloque cuidadosamente a amostra de volta na incubadora para fortalecer a conexão neuronal para experimentos futuros. Você pode usar gravações de patch clamp de célula inteira para investigar a funcionalidade elétrica da conexão micromanipulada.

Aqui são mostradas as populações neuronais isoladas separadas por uma lacuna de 100 micrômetros em microdispositivos PDMS. As gravações de grampo par a patch foram realizadas na configuração de células inteiras, e as conexões induzidas mecanicamente foram analisadas e comparadas com aquelas em populações neuronais naturalmente conectadas e populações não conectadas. As respostas elétricas após o potencial de ação pré-sináptico registradas a partir dos neurônios conectados naturalmente e por micromanipulação são significativamente maiores e temporariamente se correlacionam com a atividade pré-sináptica.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em oito horas se feita corretamente e, ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de ter culturas de células de longo prazo saudáveis e bem padronizadas para garantir resultados rápidos e reprodutíveis. Seguindo este procedimento, diferentes métodos podem ser usados para verificar a funcionalidade elétrica da conexão micromanipulada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aumentar as populações de células em câmaras microfluídicas e usar manipulações de pipetas para iniciar, estender e conectar neurites.