Gravação de grampos-grampo de células inteiras de células epiteliais primárias isoladas do epidídimo

O objetivo geral deste procedimento é isolar as células epiteliais do epidídimo de rato e medir as propriedades elétricas dessas células principalmente dissociadas usando o método de patch-clamp de células inteiras. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia reprodutiva, como a função do epidídimo, que é importante para a maturação do esperma e a herança de características paternas. Esta técnica permite ao usuário cauterizar as propriedades elétricas de células epiteliais epididimais isoladas para que a função fisiológica desconhecida dessas células possa ser ilustrada.

Demonstrando o procedimento estará Bao Li Zhang, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar o procedimento, desinfete as ferramentas de dissecção por imersão em etanol a 70%. Em seguida, deixe-os secar ao ar.

Em seguida, prepare o IMDM completo. Em seguida, crie alíquotas de 50 ml em condições assépticas, feche com Parafilm e armazene a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare uma solução de digestão enzimática colágena dissolvendo a colagenase tipo I e a colagenase tipo II em RPMI, resultando em um miligrama por mililitro de cada colagenase na solução.

Filtrar a solução através de uma membrana de 0,22 micrómetros. Em seguida, marque-o como solução de colagenase e mantenha a solução em temperatura ambiente até o uso. Em seguida, ajuste o volume da solução enzimática com base no peso da enzima.

O volume mínimo necessário para ambos os epidídimos da cauda de um único rato é de dois mililitros. Para dissecar os epidídimos da cauda do rato, sacrifique o animal usando pentobarbital sódico via injeção IP ou usando uma câmara de isoflurano até que o animal não responda à estimulação do beliscão da cauda, seguida de luxação cervical. Depois, desinfete a parte inferior do abdômen limpando-a com etanol 70%.

Empurre suavemente os dois testículos para baixo até a parte inferior do abdômen e, em seguida, abra a parte inferior do abdômen perto do escroto. Em seguida, remova a gordura do epidídimo e disseque todos os órgãos reprodutivos. Depois, transfira-os para o prato com RPMI.

Em uma estação de trabalho limpa e controlada pelo fluxo de ar, disseque os epidídimos da cauda dos tecidos conjuntivo e adiposo e da cápsula do epidídimo. Coloque um epidídimo com 0,2 mililitros de solução de colagenase em um tubo de 1,5 mililitro. Para dissociar células individuais do epidídimo da cauda, corte os epidídimos na solução de colagenase usando uma tesoura fina até que o tecido se torne um fluido pastoso.

Em seguida, enxágue a tesoura suavemente com o restante da solução enzimática no tubo. Em seguida, coloque o tubo em um termomisturador de metal por 30 minutos a 37 graus Celsius com uma velocidade de agitação de 1.000 rpm. Em seguida, centrifugue a mistura de tecido enzimático à temperatura ambiente por três minutos.

Depois disso, transvase o sobrenadante pegajoso que contém principalmente o esperma. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de IMDM completo para extinguir toda a atividade enzimática. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros contendo 49 mililitros de RPMI.

Centrifugar a mistura de células e decantar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de IMDM completo com trituração suave por pelo menos cinco minutos para dissociar as células individuais da mistura de tecido epididimal tratada com enzima. Separe as células epiteliais de outras células em condições assépticas e cultive a suspensão celular em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo IMDM completo por pelo menos oito horas ou durante a noite em uma incubadora a 32 graus Celsius.

Na manhã seguinte, prepare as lamínulas estéreis por imersão em álcool 100%. Seque ao ar e mergulhe-os em uma pequena quantidade de meio de cultura. Em seguida, coloque as lamínulas em placas de cultura de seis centímetros ou em poços individuais de uma placa de 24 poços.

Agora, colha as células epiteliais dissociadas coletando suavemente a suspensão celular da placa de Petri, que consiste principalmente de células epiteliais. Centrifugar a suspensão da célula a 30 vezes G à temperatura ambiente durante cinco minutos e decantar em seguida o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de IMDM cheio.

Semeie 0,2 mililitros da suspensão celular colhida no centro de cada lamínula estéril. Deixe a suspensão celular assentar na gota de líquido por pelo menos 10 minutos para permitir que as células adiram frouxamente às lamínulas de cobertura. Em seguida, adicione cuidadosamente um mililitro de IMDM cheio na borda de um prato de seis centímetros ou 0,3 mililitros de IMDM cheio a cada poço de uma placa de 24 poços, sem perturbar as células.

Mantenha as células isoladas em lamínulas na incubadora a 32 graus Celsius até que os experimentos de grampo de adesivo. No dia do experimento de patch-clamp, descongele uma alíquota de solução intracelular em gelo e mantenha-a resfriada durante o experimento de patch-clamp para evitar a degradação. Em seguida, transfira as células epiteliais de cultura na lamínula de vidro para a câmara de gravação cheia de PSS padrão à temperatura ambiente.

Troque cuidadosamente o PSS de banho pelo menos duas vezes usando uma pipeta antes de qualquer experimento de patch-clamp. Para estabelecer a configuração de toda a célula, mergulhe a pipeta na solução do banho na velocidade mais alta do micromanipulador. Encontre a ponta da pipeta na tela conectada à câmera digital.

Em seguida, diminua a velocidade do micromanipulador para o modo médio-alto. Verifique rapidamente a resistência da micropipeta usando o comando da interface de aquisição de dados aplicando um passo de tensão gerado a partir do amplificador controlado por computador. Mude para uma nova micropipeta se a resistência estiver significativamente fora dessa faixa.

E defina o potencial de junção de líquido entre a pipeta e a solução do banho para zero usando o comando de deslocamento da pipeta na interface do comandante do software. Monitore a resistência com o teste de membrana. Se a resistência for maior que 500 megaohms, mas menor que um gigaohm, aplique um potencial negativo para ajudar a formar o gigaseal.

Enquanto isso, compense a corrente capacitiva transitória da micropipeta. Neste momento, aplique um degrau de hiperpolarização de 10 milivolts a partir de um potencial de retenção de zero milivolts para a determinação da resistência da vedação. Imediatamente após atingir uma configuração bem-sucedida de toda a célula, aplique uma etapa de hiperpolarização de 10 milivolts a partir de um potencial de retenção de 60 milivolts negativos.

Mude o voltage modo para o modo de corrente zero e execute uma gravação sem intervalos de 10 segundos para medir o potencial de membrana em repouso da célula. Depois, volte rapidamente e permaneça no modo de tensão. Aplicar os protocolos de tensão de acordo com os experimentos planejados e medir as respostas de corrente.

Aqui estão os exemplos das células epiteliais isoladas dos epidídimos da cauda do rato antes e depois da recolheita da cultura durante a noite no prato antes dos experimentos de patch-clamp. Esta figura mostra as correntes típicas de células inteiras registradas de células epiteliais epididimais únicas usando um protocolo de eliciação de pulso. A linha pontilhada indicava os níveis atuais zero.

Aqui está a relação de tensão de corrente das respostas de corrente medidas nos pontos de tempo indicados. Estes são os traçados representativos do potencial de membrana em repouso das células principais dialisadas com uma solução de pipeta, com ATP ou sem ATP. E este gráfico de barras não mostra diferença significativa entre o potencial inicial da membrana em repouso de mais ATP e menos ATP.

Os números entre parênteses dentro das barras indicam o número de células testadas de, pelo menos, três animais. E aqui estão as análises de correlação da resistência de vedação e da resistência de entrada de todas as células, ou apenas das células principais, versus os potenciais de repouso medidos no grampo de corrente zero logo após o estabelecimento de toda a célula e as magnitudes de corrente medidas na etapa de hiperpolarização para menos 100 milivolts do potencial de retenção. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em nove horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de interromper a digestão enzimática imediatamente durante as etapas de isolamento celular. Caso contrário, pode ocorrer superdigestão, o que pode levar à difícil formação de vedação gigaohm e falha nos experimentos de patch-clamp. Para manter a saúde da cultura, é importante girar a mistura de células dissociadas enzimaticamente na velocidade baixa de 30 G por dois a três minutos e, em seguida, decantar o sobrenadante pegajoso que contém principalmente espermatozóides.

Após esses procedimentos, outros métodos, como imagens de células vivas e técnicas de cultura de uma célula, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o potencial de membrana em repouso em células epiteliais virgens que podem regular o comportamento extracelular sob condições controladas. Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia reprodutiva explorarem as propriedades eletrofisiológicas das células epiteliais do epidídimo para a regulação da maturação espermática e herança de características adquiridas paternas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como isolar células epiteliais do epidídimo de rato e como medir as propriedades elétricas dessas células usando o método patch-clamp de células inteiras.