Name: Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como Ferramenta de Triagem In Vitro na Pesquisa Auditiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a técnica de explante coclear murino neonatal para pesquisa auditiva in vitro. Este método permite estudar células ciliadas, sinapses e neurônios cocleares simultaneamente, acelerando a triagem de compostos terapêuticos.

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Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Surdez e Distúrbios da Comunicação R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (suporte de SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-15-1-0472 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS), o Nancy Sayles Day Foundation (KMS) e o Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Agradecemos a Jessica E. Sagers, BA por comentários perspicazes sobre o manuscrito.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) do Massachusetts Eye and Ear. Os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial. 1. Preparando a dissecação <ol><li> Preparando a mesa cirúrgica <ol><li> Use etanol a 70% para desinfectar a mesa cirúrgica. </li><li> Coloque duas pastilhas não preparadas ao lado do microscópio. </li><li> Prepare a bandeja do instrumento, incluindo tesouras de operação esterilizadas por calor, uma alça de bisturí, uma microcarga e fórceps (duas em cada # 4 e # 55). Coloque a bandeja do instrumento e uma placa de Petri com fundo de parede de paredes claras de 50 mm sobre uma almofada não-estéril. </li><li> Obter uma lâmina de bisturi # 15 estéril; Uma bolsa ou recipiente de plástico selável (para descartar as carcaças de acordo com as diretrizes institucionais); Gelo em um balde; E solução de sal equilibrada Hank, estéril e fria (HBSS). Coloque esses itens noOutra almofada não-esterilizada. </li><li> Transfira o HBSS para um tubo de laboratório plástico de 50 mL e coloque-o sobre gelo. </li></ol></li><li> Preparando a cultura <ol><li> Prepare todos os materiais em uma capa de fluxo laminar. Para cada quatro espécimes, coloque quatro lâminas de cobertura de vidro redondas de 10 mm em autoclavagem nas quatro incrustações da placa de Petri de 35 mm de 4 poços. </li><li> Para cada 4 espécimes, misture um volume total de 300 μL que consiste no seguinte em um tubo de microcentrífuga: 10 μL de adesivo de tecido, 285 μL de NaHCO 3 e 5 μL de NaOH. </li><li> Coloque 45 μL da solução resultante em cada folha de cobertura e deixe-a lá durante pelo menos 20 minutos à TA; Esta solução pode ser deixada no lamínula durante várias horas, mas não pode ser deixada O / N. </li><li> Coloque uma ou duas placas de petri de 4 mm de 4 mm no interior de uma placa de Petri de 10 cm para criar duas barreiras contra a contaminação. </li><li> Preparar meio de cultura contendo 98% de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), 1% de N-2 e 1% de ampicilina (65 μL por poço em um tubo de (micro) centrífuga). Aquecer a solução até 25 ° C antes da utilização. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção Extrica Cochlear Murina <ol><li> Decapitação do mouse neonatal <ol><li> Obtenha uma placa de petri de plástico de 60 mm e pulverize 70% de etanol na sua tampa de modo que a superfície esteja molhada. </li><li> Despeje o HBSS frio do tubo de laboratório de plástico na parte inferior do plástico de 60 mm e a placa de Petri de fundo transparente com 50 mm de parede transparente. Armazene o tubo de laboratório de plástico e ambos os pratos de Petri no gelo para manter o tecido frio sempre que não estiver sendo dissecado. </li><li> Coloque um rato neonatal P3-P5-envelhecido no gelo em um dedo de corte de uma luva de látex e aguarde até que a hipotermia induz perda de consciência (aproximadamente 1-3 min). </li><li> Decapite o mouse rapidamente com tesoura em funcionamento e descarte o corpo na bolsa de plástico selável. Coloque a cabeça de recém-nascido em70% de etanol na tampa da placa PETRI de plástico de 60 mm. </li></ol></li><li> Dispersão macroscópica do osso temporal <ol><li> Remova a pele do crânio fazendo um corte superficial da parte anterior à posterior (diretamente na parte superior da sutura sagital) usando a lâmina do bisturi. </li><li> Corte os dois canais auditivos externos com a lâmina do bisturi e dobre a pele anteriormente para expor todo o crânio. NOTA: Embora não seja necessário nenhum microscópio de dissecação para esta etapa, ele pode ser usado para uma melhor visualização. </li><li> Abra o crânio ao longo da sutura sagital usando a lâmina # 15 do bisturi. Certifique-se de cortar o crânio movendo suavemente a lâmina para cima e para baixo de anterior para posterior para evitar a compressão das cócleas. NOTA: O crânio não deve ser ossificado nesta idade e deve cortar facilmente. </li><li> Remova e descarte o focinho fazendo um corte vertical diretamente posterior às órbitas usando o bisturi # 15lâmina. NOTA: A parte posterior do crânio ainda deve conter o cérebro e as cócleas. </li><li> Descarte o prosencéfalo, cerebelo e tronco cerebral através de dissecção sem corte com fórceps # 4. </li></ol></li><li> Extração microscópica das cócleas <ol><li> Ajuste o microscópio (ampliação 6.5X) e a fonte de luz colocando a pinça sob o escopo e otimizando a iluminação e o foco. </li><li> Coloque as duas metades do crânio na placa de petri de plástico de 60 mm, preenchida com HBSS frio. </li><li> Exponha completamente a cóclea / e, identificável como adjacente à artéria estapedial circundante (uma artéria tortuosa dentro do osso temporal) e separe sem rodeios o órgão do osso temporal usando fórceps # 4. </li><li> Transfira a cóclea para a placa de Petri com fundo de vidro de 50 mm, de paredes claras e posicione o prato sob o microscópio. </li><li> Coloque a placa de petri de plástico de 60 mm com a outra metade do crânio no gelo. </Li&gt; <li> Remova a cóclea do sistema vestibular e dissecar cuidadosamente a cápsula ocula coclear (tipicamente cartilaginosa a esta idade) com fórceps # 4. Use pinças # 55 para todas as etapas adicionais. </li></ol></li><li> Etapas finais do processamento de tecidos <ol><li> Continue com o processamento do tecido da orelha interna separando cuidadosamente o ligamento espiral aderente ao órgão de Corti do resto da cóclea e o modiolus usando a microcadeia ou duas fórceps. <ol><li> Corte na área mais escura e translúcida na fenda entre o ligamento espiral e a região das células ciliadas e proceda à remoção subseqüente do ligamento espiral, agarrando-o no aspecto mais basal e relaxando suavemente enquanto se move apicalmente. </li></ol></li><li> Posicione a amostra para obter uma visão longitudinal e sagital da cóclea e corte a cóclea em duas a três seções usando a microcâmara, classificando essas seções como apical, (meio) e bVoltas do Asal. Remova o tecido superior e inferior à camada real de células ciliadas e neurites, a fim de obter uma peça de explante coclear que pode ser colocada horizontalmente na placa de Petri. NOTA: Um tamanho apropriado para a adesão estável ao prato de cultura é aproximadamente metade de uma volta coclear. </li><li> Remova a membrana tectorial, uma camada translúcida muito fina, imediatamente superior ao órgão de Corti, descascando suavemente com fórceps. </li><li> Remova a membrana de Reissner, imediatamente superior às SGNs, tocando-a com fórceps em ambos os lados e descascando-a. NOTA: Remova todas as áreas de células de cabelo danificadas localizadas lateralmente, cortando-as com a microcadeira. </li></ol></li></ol> 3. Transferência de espécimes para as placas de cultura <ol><li> Remova os 45 μL de solução adesiva de tecido das quatro folhas de cobertura. Lavar cada deslizamento de cobertura com 50 μL de H2O estéril. Aspirar a água. </li><li> Pegue a pipeta de 1 mL. Molhe a ponta da pipeta com aproximadamente 120 μL de DMEM para evitar que a amostra adira ao interior da ponta. </li><li> Transfira os espécimes individualmente usando a pipeta de 1 mL. Pipetar um máximo de 70 μL da placa de Petri com fundo de vidro, pequeno, de paredes claras e com base em HBSS e colocar a amostra juntamente com o líquido em uma das 4 incrustações (preparadas com folhas de cobertura) na placa Petri de 4 poços . </li><li> Verifique sob o microscópio (aumento de 50X) que a amostra está na orientação correta. Certifique-se de que a área das células ciliadas a partir da qual a membrana tectorial foi removida fica voltada para cima. Certifique-se de que a membrana basilar, juntamente com a parte basal reduzida do modiolus, esteja voltada para baixo e adere ao lamínula. <ol><li> Se o espécime for orientado de cabeça para baixo após a inspeção, deposite o HBSS que permanece na ponta da pipeta na embutição e reposicione a peça até que esteja corretamente orientada. NÃOTE: isto impedirá que células ciliadas flutuem em meio de cultura sem suporte estrutural da lamínula, o que pode levar à degeneração. </li></ol></li><li> Aspirar excesso de HBSS usando a pipeta de 1 mL. Aguarde 15 s. </li><li> Pipetar 60 μL do meio de cultura quente preparado (98% de DMEM, 1% de N-2 e 1% de ampicilina) diretamente sobre a amostra. Tenha cuidado para não tocar na amostra com a pipeta. Substitua as tampas interna e externa do prato de Petri e incube O / N a 37 ° C. </li><li> Coloque todas as soluções de reserva em seus locais apropriados, descarte carcaças e resíduos residuais, descontaminar a mesa cirúrgica de acordo com diretrizes institucionais ( por exemplo, usando etanol ou hipoclorito), limpe e autoclave os instrumentos e descarte os objetos afiados no recipiente apropriado . </li></ol> 4. Adicionando meios culturais finais e substâncias de interesse NOTA: Os explantes cocleares estarão prontos para uso 10-16 h depois. <ol><li> Prepare um mixtuRe 97% de DMEM, 1% de soro bovino fetal (FBS), 1% de N-2 e 1% de ampicilina (65 μL por poço em um tubo de microcentrífuga, aquecer a solução até 25 ° C antes da utilização). </li><li> Adicione outras substâncias de interesse para as soluções para os respectivos grupos de tratamento. Se forem adicionadas substâncias fluorescentes ( p. Ex. Vírus da proteína fluorescente verde (GFP), em uma publicação recente, uma concentração de 10 10 GC de Vírus Adeno-Associados (AAVs) foi utilizada durante 48 h em 50 μL) 18 , proteja de luz. </li><li> Transfira as placas de Petri contendo explantes cocleares da incubadora e coloque-as sob o capô de fluxo laminar. </li><li> Aspirar o meio de cultura antigo (sem FBS) com a pipeta das inlays. </li><li> Adicionar 60 μL por poço do meio de cultura quente (tratamento) preparado (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% de ampicilina e as substâncias de interesse). </li><li> Coloque a placa Petri de volta à incubadora (37 ° C). </li><li> Ver rPor exemplo, no microscópio para identificar sinais de contaminação, migração celular ou desprendimento do explante coclear e realizar manchas após um máximo de 7 dias. </li></ol> 5. Imunofluorescência - Dia 1 <ol><li> Preparar a solução de bloqueio (94% de solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro normal de cabra ou cavalo (NGS / NHS, dependendo dos anticorpos secundários) e 1% de surfactante não iónico (ver Tabela de Materiais )) e estoque Solução de anticorpo (98,6% de PBS, 1% de NHS e 0,4% de surfactante não iónico com os respectivos anticorpos). NOTA: Os anticorpos incluem o coelho anti-Myo7A a uma concentração de 1: 400+ (miosina 7A, para células ciliadas internas e externas) e anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, para SGNs) OU mouse (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (proteína de ligação c-terminal, para presinapse), mouse (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (densidade pós-sináptica, pós-sincronismo) e frango anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilamento, Para SGNs e fibras nervosas). &quot;+&quot; MeaNs &quot;ou superior&quot;. </li><li> Aspirar o meio de cultura usando uma pipeta. Tenha cuidado para não tocar na amostra. </li><li> Sob o capô de fluxo laminar, enxágue os explantes cocleares duas vezes com PBS estéril, colocando os espécimes em um agitador durante 5 minutos após cada lavagem. </li><li> Corrigir o tecido em paraformaldeído a 4% (PFA - CUIDADO) por 20 minutos no agitador (sob o capô). Aspirar o PFA. </li><li> Aplique 60 μL de PBS nos explantes cocleares e coloque a placa de Petri em um agitador durante 5 min. Aspirar o PBS. Repita 3x. </li><li> Coloque os explantes cocleares na solução de bloqueio preparada (94% de PBS, 5% de NHS e 1% de surfactante não iónico) durante 30 min no agitador. </li><li> Coloque os explantes cocleares em uma solução de anticorpo de estoque preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS e 0,4% de surfactante não iónico) com os respectivos anticorpos primários (vortex antes do uso) O / N em um contador na RT. NOTA: Enrole as placas de Petri com toalhas de papel úmidas, incluídas em plástico (ou papel alumínio, se a solução adicionadaIon contém materiais fluorescentes, como vírus que expressam GFP) para manter a louça úmida e para evitar a evaporação da solução de anticorpo O / N. </li></ol> 6. Imunofluorescência - Dia 2 <ol><li> Prepare a mancha de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (300 nM) e use a solução de anticorpo de reserva para obter as misturas de anticorpos secundários corretas, complementares aos anticorpos primários no passo 5.1. (Por exemplo , cabra anti-coelho 488 1: 200+ e cabra anti-rato 568 1: 200+ OU cabra anti-rato (IgG1) 568 1: 1000+, cabra anti-rato (IgG2a) 488 1: 500+, E cabra anti-frango 647 1: 200+ OU Phalloidin 568 1: 200+ (para células ciliadas internas e externas)). </li><li> Aspirar a solução primária de anticorpos. </li><li> Aplique 60 μL de PBS nos explantes cocleares e coloque a placa de Petri em um agitador durante 5 min. Aspirar o PBS. Repita 3x. </li><li> Colocar os explantes cocleares na solução preparada de anticorpo em estoque (98,6% de PBS, 1% de NHS e 0,4% de surfactante não iónico) com resAnticorpos secundários pectivos (vortex antes do uso) durante 1,5 h em um contador e protegem da luz. </li><li> Aspirar a solução secundária de anticorpos e enxaguar os explantes cocleares com uma mancha DAPI (colocando em um agitador durante 1 min e depois aspirar). </li><li> Aplique 60 μL de PBS nos explantes cocleares e coloque a placa de Petri em um agitador durante 5 min. Aspirar o PBS. Repita 3x. </li><li> Use fórceps para remover lamínulas com espécimes da placa de 4 poços, mergulhe-os em um recipiente repleto de H 2 O destilado e retire os lamíninhos colocando-os verticalmente em contato com toalhas de papel. </li><li> Coloque uma gota de meio de montagem antifade no slide do microscópio e inverta as lamelas para mergulhar o tecido voltado para baixo no meio. </li><li> Selar a lamínula usando esmalte de asa transparente cobriu circunferencialmente a borda (sem esmagar a amostra sob o vidro). Deixe as lâminas deitado na área coberta longe da luz por 15 a 20 minutos até a secagem e a temperaturaColocá-los em uma caixa ou examinar sob o microscópio confocal. NOTA: A coloração fluorescente é melhor conservada armazenando as lâminas a 4 ou -20 ° C. </li></ol> 7. Imagens confocais <ol><li> Obtenha uma visão geral e imagens ampliadas para o órgão da região de Corti, incluindo neurites e SGNs. NOTA: Configurações padrão para o processo de imagem: Formato de 1.024 x 1.024 pixels, velocidade de 400 Hz, média de trama de 3, 20% de intensidade geral do laser e, geralmente, lente de 20X e 63X com imersão em óleo (potencialmente combinada com zoom digital 2X). As configurações de canal para o protocolo de coloração DAPI, Myo7A e TuJ1 são descritas acima: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766.8V, &quot;Smart Offset&quot; 0.0% - 488 15% isotiocianato de fluoresceína (FITC), &quot;Smart Gain&quot; 622.2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% de isotiocianato de tetrametilrhomadina (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562,4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Mesclar as imagens em uma pilha z usando oSoftware para obter uma projeção do eixo z. </li></ol>

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<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os pesquisadores devem aperfeiçoar a técnica de dissecação antes de realizar experiências envolvendo explantes cocleares. As células do cabelo são comumente danificadas durante as dissecações realizadas no início da curva de aprendizado e um momento particularmente problemático para sua integridade é a remoção da membrana tectorial, que requer mãos firmes, ferramentas adequadas e experiência. Para economizar tempo e recursos, um controle visual deve ser realizado sob o microscópio de dissecação e áreas potencialmente da...

Perda auditiva sensorial (SNHL) reflete dano ao ouvido interno ou via auditiva ascendente. Embora a perda de audição seja o déficit sensorial mais comum em humanos 1 , as terapias curativas ainda não existem 2 . Embora os implantes de tronco encefálicos cocleares ou auditivos possam restaurar algum grau de audição para pacientes com SNHL grave a profunda, a audiência fornecida por esses dispositivos ainda é muito diferente da audiência &quot;natural&quot;, especialmente durante as tentativas de entender a fala em ruído ou para ouvir música. Embora a degeneração de células ciliadas tenha sido considerada a principal conseqüência de eventos auditivos traumáticos ( por exemplo, exposição ao ruído alto), há evidências crescentes de que as sinapses que transportam informações de células ciliadas para o nervo auditivo são pelo menos tão vulneráveis ​​a trauma acústico 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . Uma vez que os limiares audiométricos humanos, o padrão ouro atual para a avaliação da função auditiva, não prevêem danos celulares específicos na orelha interna, são necessárias ferramentas mais refinadas para detectar a degeneração celular o mais rápido possível e para iniciar um tratamento adequado 7 . Os tratamentos farmacêuticos promissores para a perda auditiva são freqüentemente testados em culturas celulares homogêneas in vitro , mas esses sistemas não modelam com precisão o microambiente coclear. Sabe-se que as células cocleares secretam fatores tróficos que influenciam outros tipos de células dentro da cóclea 8 , 9 , um processo in vivo crucial que se perde quando o órgão de Corti 10 , 11 ou Neurônios de Ganglion Espiral (SGNs) 12 são cultivados isoladamente ou quando Marcadores moleculares são analisados13. No entanto, estudos in vivo que podem ser necessários para a validação de dados in vitro para estabelecer novos tratamentos personalizados para a perda de audição na busca de &quot;medicina de precisão&quot; requerem recursos e tempo significativos. Isto é especialmente relevante quando se considera Quanto esforço é necessário para aperfeiçoar e realizar injeções de membrana de orelha média ou arredondada com testes auditivos e a subsequente dissecção de montagens inteiras cocleares. O rastreio eficiente de compostos promissores em culturas orgotípicas ex vivo conhecidas como explantes cocleares fornece uma alternativa econômica e confiável 14 , 15 , 16 , 17 . Este artigo detalha um protocolo para gerar, manter e avaliar explantes cocleares tratados. As aplicações específicas para este modelo são enfatizadas, incluindo seu uso na seleçãoDe compostos potencialmente terapêuticos e a avaliação comparativa de vetores virais para terapia genética. Uma abordagem de explante ex vivo permite aos pesquisadores visualizar os efeitos de um determinado tratamento em diferentes populações celulares in situ , facilitando a identificação de mecanismos específicos do tipo celular e o aprimoramento subseqüente de terapias específicas. No geral, esta técnica fornece um modelo para estudar a cóclea ex vivo, ao mesmo tempo em que preserva a conversação vital entre os tipos de células muito diferentes que coexistem dentro da cóclea.

<table><tbody><tr><td>Ampicilina, sal de sódio</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 anticorpo, camundongo (IgG1)</td> <td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Myo7A, coelho</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H anticorpo, frango</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 anticorpo, camundongo (IgG2a)</td> <td>Anticorpos Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-TuJ1, camundongo</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo de células e tecidos Cell-Tak, 5 mg</td> de tubos de centrífuga <td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR de 15 mL, fundo cônico, graduação, Greiner estéril</td><td>Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de células CELLSTAR, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 35 x 10 mm, 4 anéis internos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células CELLSTAR, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Tubos de Centrífuga, fundo cônico, Graduação, Greiner Estéril</td><td>Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Esmalte</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de Fundo de Vidro de Parede Transparente (Vidro 40mm), PELCO&reg;, Manga/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas, Redondas, Vidro, 10 mm de diâmetro, Espessura #1, 0,13 - 0,16 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, piruvato, sem glutamina, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Fórceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico (EtOH), Puro, 200 provas, anidro, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS), qualificado, regiões aprovadas pelo USDA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>Alíquota em tubos de 50 mL e armazenar em -20&deg; C freezer</td></tr><tr><td>cabra anti-frango-647 anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato (IgG) -568 anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato (IgG1) -568 anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato (IgG2a) -488 anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secundário anti-coelho-488 de cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, estéril, Água Ultra Pura EmbryoMax, 500 mL</td><td>EMD Solução</td> salina balanceada de 500 mL Millipore <td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's (HBSS), cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol, 500 mL</td> Bandeja de instrumentos <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>com tampa Faca</td> Micro (dissecante) <td>TechMed4255</td><td></td><td>da Mountainside Medical</td> em Aço Inoxidável</tr><tr><td>- angular 30&deg;</td>Lâminas de microscópio <td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>, VistaVision, codificadas por cores, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm de espessura, brancas, pacote de 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, Solução de bicarbonato de sódio 7,5%, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, solução de hidróxido de sódio, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>Paraformaldeído <td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>(PFA), Grau Reagente, Cristalino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Antes de usar: Estabeleça Procedimentos Operacionais Padrão com base em protocolos disponíveis online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Faloidina, Alexa Fluor 568&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Preparação, Não Estéril&nbsp;</td>Tubos de Microcentrífuga <td>Safe-Lock Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>, Polipropileno, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Safe-Lock, Polipropileno, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave antes do uso</td></tr><tr><td>Lâminas de Bisturi - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de Bisturi - #4</td><td>Fine Science Tools</td>Microscópio Estéreo Stemi 2000-C <td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (surfactante não iônico)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield meio de montagem antifade para fluorescência</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>Bolsa com zíper H-1000</td><td></td></tr><tr><td>, reutilizável, 4 x 6 '' - 2 mm de espessura</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica explosiva cochlear murina neonatal como um<em&gt; in vitro</em&gt; ferramenta de seleção na pesquisa auditiva

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Embora tenha havido avanços notáveis ​​na pesquisa auditiva nas últimas décadas, ainda não há cura para a Perda auditiva sensorial (SNHL), uma condição que tipicamente envolve danos ou perda das delicadas estruturas mechanosensoriais da orelha interna. Ensaios sofisticados in vitro e ex vivo surgiram nos últimos anos, permitindo a triagem de um número crescente de compostos potencialmente terapêuticos, minimizando os recursos e acelerando os esforços para desenvolver curas para SNHL. Embora as culturas homogêneas de certos tipos de células continuem a desempenhar um papel importante na pesquisa atual, muitos cientistas agora contam com culturas organotípicas mais complexas de orelhas internas murinas, também conhecidas como explantes cocleares. A preservação de estruturas celulares organizadas dentro da orelha interna facilita a avaliação in situ de vários componentes da infra-estrutura coclear, incluindo células ciliadas internas e externas, neurônios ganglionares espirais, neurItes, e células de apoio. Aqui apresentamos a preparação, a cultura, o tratamento e a imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A preparação cuidadosa desses explantes facilita a identificação de mecanismos que contribuem para o SNHL e constitui uma ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa auditiva.

Enquanto muitos protocolos se concentram no órgão dos explantes de Corti, essa técnica tenta preservar a anatomia de toda a curva coclear, incluindo os SGNs. Isso dá aos pesquisadores a oportunidade de analisar os efeitos de um determinado tratamento sobre neurites e somata de SGNs, além do órgão de Corti. Realizar uma dissecção que preserva parte do modiolus, como descrito aqui, é mais tecnicamente desafiador do que explantar o órgão de Corti sozinho. No entanto, a área de neurite e SGN...

O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação, cultura, tratamento e imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A técnica pode ser utilizada como ferramenta de seleção in vitro na pesquisa auditiva.

Técnica Explosiva Cochlear Murina Neonatal como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ferramenta de seleção na pesquisa auditiva

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

O objetivo geral deste procedimento é a preparação, cultura, tratamento e imunomarcação de explantes cocleares murinos neonatais, a serem utilizados como uma ferramenta de triagem in vitro na pesquisa auditiva. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa auditiva, como permitir o estudo simultâneo de células ciliadas cocleares, sinapses, neuritos e neurônios em um modelo ex vivo e fornecer insights sobre os mecanismos de ação de moléculas novas para a cóclea, incluindo fatores encontrados em secreções humanas. A principal vantagem desta técnica é que o processo de triagem de compostos terapêuticos candidatos pode ser acelerado antes de seus testes in vivo.Inicie com uma cabeça de recém-nascido recém-coletada, contida em etanol 70% na tampa de uma placa de Petri. Use uma lâmina de bisturi para fazer um corte superficial na pele do extremo anterior ao posterior do crânio. Em seguida, corte ambos os condutos auditivos externos e dobre a pele anteriormente para expor todo o crânio.Em seguida, abra o crânio ao longo da sutura sagital movendo suavemente a lâmina do bisturi de cima para baixo, da região anterior para a posterior, para evitar compressão da cóclea. Remova e descarte o focinho fazendo um corte vertical diretamente posterior às órbitas. A parte posterior do crânio ainda deve conter o cérebro e a cóclea.Em seguida, utilize 4 pin&ccedil;as para dissecar e descartar o prosenc&eacute;falo, cerebelo e bulbo raquidiano. Coloque as duas metades do cr&acirc;nio em uma placa de Petri pl&aacute;stica de 60 mil&iacute;metros cheia com HBSS frio. Em seguida, utilize 4 pin&ccedil;as para expor completamente a c&oacute;clea, que est&aacute; adjacente &agrave; art&eacute;ria estap&eacute;dica circundante, e separe o &oacute;rg&atilde;o da maneira mais romba poss&iacute;vel do osso temporal.Transfira a cóclea para uma placa de Petri de vidro com fundo transparente e paredes claras de 50 milímetros contendo HBSS e posicione a placa sob o microscópio. Coloque a placa de Petri plástica de 60 milímetros com a outra metade do crânio sobre gelo. Em seguida, use 4 pinças para dissecar cuidadosamente a cápsula ótica coclear.Agora, utilize uma microtesoura ou duas pinças de força 55 para separar cuidadosamente o ligamento espiral, que está aderido ao órgão de Corti, do restante da cóclea e do medialis. Isso pode ser feito segurando o ligamento espiral pela sua porção mais basal e desenrolando-o suavemente enquanto se avança em direção ao ápice. Após a remoção do ligamento espiral, posicione o espécime para obter uma vista sagital longitudinal da cóclea.Em seguida, corte a cóclea em duas ou três seções usando a microfaca, classificando essas seções como voltas apical e basal. Remova o tecido superior da peça mais apical e o tecido inferior da peça mais basal, até a camada real de células ciliadas e neuritos, para permitir que o explante coclear fique posicionado horizontalmente sobre a placa de Petri. A seguir, use pinças para segurar suavemente e destacar a membrana tectorial, uma camada muito fina e translúcida imediatamente superior ao órgão de Corti.O passo mais tecnicamente desafiador provavelmente é a remoção da fina e translúcida membrana tectorial, pois é fácil danificar as células ciliadas subjacentes. Ao começar pelas bordas do tecido, as células ciliadas ao longo do comprimento do explante são preservadas, exceto na borda extrema onde a remoção da membrana tectorial foi iniciada. Por fim, remova a membrana de Reissner imediatamente acima dos neurônios do gânglio espiral tocando-a com pinça em ambos os lados e puxando-a para longe.O espécime coclear está agora pronto para o cultivo após a remoção de quaisquer áreas danificadas nas bordas. Inicie o procedimento de cultivo umedecendo a ponta de uma pipeta de um mililitro com aproximadamente 120 microlitros de DMEM para evitar que o explante adira ao interior da ponta. Em seguida, use a ponta pré-umedecida para pipetar no máximo 70 microlitros do prato de Petri com fundo de vidro e coloque o espécime junto com o líquido em um dos quatro compartimentos do prato de Petri de quatro poços.Verifique ao microscópio se o explante está na orientação correta. Certifique-se de que a área de células ciliadas da qual a membrana tectorial foi removida esteja voltada para cima e de que a membrana basilar, juntamente com a parte basal aparada da medialis, esteja voltada para baixo e aderida ao disco de cobertura. Se o espécime estiver orientado de cabeça para baixo ao ser inspecionado, como mostrado aqui, adicione HBSS com a ponta da pipeta e reposicione o fragmento até que esteja corretamente orientado.Uma vez que o explante esteja corretamente orientado, aspire o excesso de HBSS e aguarde 15 segundos. Em seguida, pipete 60 microlitros de meio de cultura aquecido diretamente sobre o espécime, tomando cuidado para não tocar o espécime com a pipeta. Recoloque as tampas interna e externa da placa de Petri e incube durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, transfira o explante coclear contendo as placas de Petri do incubador para a cabine de fluxo laminar. Aspire o meio de cultura antigo, que não contém soro bovino fetal (FBS), do interior da placa. Adicione 60 microlitros por poço do meio de tratamento aquecido e preparado.Coloque a placa de Petri de volta no incubador até a coloração das culturas após um máximo de sete dias. Como visto nesta imagem confocal, esta técnica preserva a anatomia de toda a volta coclear, incluindo os neurônios do gânglio espiral ou SGNs, permitindo a análise dos efeitos do tratamento sobre neuritos e somatas dos SGNs, além do órgão de Corti. Como mostrado aqui, esses explantes podem ser usados para comparar simultaneamente o efeito do tratamento nas voltas apical e basal após coloração por imunofluorescência.As células ciliadas são mostradas em verde e as estruturas neuronais aparecem em vermelho. Sinapses intactas podem ser avaliadas por meio da marcação de proteínas pré-sinápticas mostradas em vermelho e proteínas pós-sinápticas mostradas em verde, juntamente com a coloração das estruturas neuronais em azul. Esta figura mostra imagens representativas de explantes cocleares apicais e basais após sete dias em cultura, com 3% de FBS à esquerda ou 1% de FBS à direita.Células incubadas em 3% de FBS começam a migrar entre os dias quatro e cinco, conforme indicado pelas setas em cinza claro para células ciliadas e pelas setas vermelhas para neuritos. Os explantes em 1% de FBS mantêm a integridade organizacional até o dia sete. Ao realizar este procedimento, é importante verificar visualmente a integridade estrutural e a orientação do tecido da cóclea antes de adicionar o meio de cultura final e as substâncias de interesse.Após este procedimento, pode-se realizar a reconstrução tridimensional para confirmar a localização específica do tipo celular de células que expressam GFP dentro da medialis.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

A orelha interna do rato é um órgão sensorial placode derivado cujo programa é elaborado de desenvolvimento durante a gestação. Nós definimos...

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Existem vários métodos para a introdução de agentes ototóxicos na cóclea de modelos animais. Apresenta-se um protocolo cirúrgico para entrega de agentes ototóxicos no nicho da janela redonda. O procedimento é confiável, cria lesões intracocleares direcionadas e evita danos mecânicos à microarquitetura. O exame do autorreparo/regeneração coclear é possível.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método confiável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna.

Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal

Modelos animais de implantes cocleares podem avançar o conhecimento das bases tecnológicas de tratamento de perda de audição neurossensorial permanente com estimulação elétrica. Este estudo apresenta um protocolo cirúrgico para agudo ensurdecedor e implante coclear de uma matriz de eletrodo em ratos, bem como a avaliação funcional com auditivo de tronco encefálico.

Cirurgia de implante coclear e gravações de resposta eletricamente evocado auditivo do tronco encefálico em camundongos C57BL/6

O pintinho é um organismo modelo econômico, acessível e amplamente disponível para uma variedade de estudos. Aqui, uma série de protocolos é detalhada para entender os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e regeneração do ouvido interno das aves.

In Ovo e Ex Ovo Métodos para estudar o desenvolvimento do ouvido interno aviário

Porcos em miniatura (mini-porcos) são um modelo animal de grande porte ideal para a pesquisa de implantes cocleares. A cirurgia de implante coclear em mini-porcos pode ser utilizada para fornecer evidências iniciais da segurança e do desempenho potencial de novas matrizes de eletrodos e abordagens cirúrgicas em um sistema vivo semelhante aos seres humanos.

O Porco em Miniatura: Um Modelo Animal de Grande Porte para Pesquisa de Implante Coclear

O protocolo atual atualiza protocolos anteriores e incorpora abordagens relativamente simples para a cultura de explantes cocleares de alta qualidade. Isso fornece aquisição de dados confiável e imagens de alta resolução em células vivas e fixas. Este protocolo apoia a tendência contínua de estudar as células da orelha interna.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Neste trabalho, apresentamos um protocolo detalhado para isolamento e cultivo de células ciliadas primárias da cóclea de camundongos. Inicialmente, o órgão de Corti foi dissecado de cócleas murinas neonatais (idade 3-5 dias) sob um microscópio. Posteriormente, as células foram digeridas enzimaticamente em uma suspensão unicelular e identificadas por imunofluorescência após vários dias em cultura.

Isolamento e Cultura de Células Ciliadas Cocleares Primárias de Camundongos Neonatais

Aprenda a técnica de explante coclear murino neonatal para pesquisa auditiva in vitro. Este método permite estudar células ciliadas, sinapses e neurônios cocleares simultaneamente, acelerando a triagem de compostos terapêuticos.

Técnica Explosiva Cochlear Murina Neonatal como um

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