Técnica Explosiva Cochlear Murina Neonatal como um

O objetivo geral deste procedimento é a preparação, cultura, tratamento e imunomarcação de explantes cocleares murinos neonatais, a serem utilizados como uma ferramenta de triagem in vitro na pesquisa auditiva. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa auditiva, como permitir o estudo simultâneo de células ciliadas cocleares, sinapses, neuritos e neurônios em um modelo ex vivo e fornecer insights sobre os mecanismos de ação de moléculas novas para a cóclea, incluindo fatores encontrados em secreções humanas. A principal vantagem desta técnica é que o processo de triagem de compostos terapêuticos candidatos pode ser acelerado antes de seus testes in vivo.

Inicie com uma cabeça de recém-nascido recém-coletada, contida em etanol 70% na tampa de uma placa de Petri. Use uma lâmina de bisturi para fazer um corte superficial na pele do extremo anterior ao posterior do crânio. Em seguida, corte ambos os condutos auditivos externos e dobre a pele anteriormente para expor todo o crânio.

Em seguida, abra o crânio ao longo da sutura sagital movendo suavemente a lâmina do bisturi de cima para baixo, da região anterior para a posterior, para evitar compressão da cóclea. Remova e descarte o focinho fazendo um corte vertical diretamente posterior às órbitas. A parte posterior do crânio ainda deve conter o cérebro e a cóclea.

Em seguida, utilize 4 pinças para dissecar e descartar o prosencéfalo, cerebelo e bulbo raquidiano. Coloque as duas metades do crânio em uma placa de Petri plástica de 60 milímetros cheia com HBSS frio. Em seguida, utilize 4 pinças para expor completamente a cóclea, que está adjacente à artéria estapédica circundante, e separe o órgão da maneira mais romba possível do osso temporal.

Transfira a cóclea para uma placa de Petri de vidro com fundo transparente e paredes claras de 50 milímetros contendo HBSS e posicione a placa sob o microscópio. Coloque a placa de Petri plástica de 60 milímetros com a outra metade do crânio sobre gelo. Em seguida, use 4 pinças para dissecar cuidadosamente a cápsula ótica coclear.

Agora, utilize uma microtesoura ou duas pinças de força 55 para separar cuidadosamente o ligamento espiral, que está aderido ao órgão de Corti, do restante da cóclea e do medialis. Isso pode ser feito segurando o ligamento espiral pela sua porção mais basal e desenrolando-o suavemente enquanto se avança em direção ao ápice. Após a remoção do ligamento espiral, posicione o espécime para obter uma vista sagital longitudinal da cóclea.

Em seguida, corte a cóclea em duas ou três seções usando a microfaca, classificando essas seções como voltas apical e basal. Remova o tecido superior da peça mais apical e o tecido inferior da peça mais basal, até a camada real de células ciliadas e neuritos, para permitir que o explante coclear fique posicionado horizontalmente sobre a placa de Petri. A seguir, use pinças para segurar suavemente e destacar a membrana tectorial, uma camada muito fina e translúcida imediatamente superior ao órgão de Corti.

O passo mais tecnicamente desafiador provavelmente é a remoção da fina e translúcida membrana tectorial, pois é fácil danificar as células ciliadas subjacentes. Ao começar pelas bordas do tecido, as células ciliadas ao longo do comprimento do explante são preservadas, exceto na borda extrema onde a remoção da membrana tectorial foi iniciada. Por fim, remova a membrana de Reissner imediatamente acima dos neurônios do gânglio espiral tocando-a com pinça em ambos os lados e puxando-a para longe.

O espécime coclear está agora pronto para o cultivo após a remoção de quaisquer áreas danificadas nas bordas. Inicie o procedimento de cultivo umedecendo a ponta de uma pipeta de um mililitro com aproximadamente 120 microlitros de DMEM para evitar que o explante adira ao interior da ponta. Em seguida, use a ponta pré-umedecida para pipetar no máximo 70 microlitros do prato de Petri com fundo de vidro e coloque o espécime junto com o líquido em um dos quatro compartimentos do prato de Petri de quatro poços.

Verifique ao microscópio se o explante está na orientação correta. Certifique-se de que a área de células ciliadas da qual a membrana tectorial foi removida esteja voltada para cima e de que a membrana basilar, juntamente com a parte basal aparada da medialis, esteja voltada para baixo e aderida ao disco de cobertura. Se o espécime estiver orientado de cabeça para baixo ao ser inspecionado, como mostrado aqui, adicione HBSS com a ponta da pipeta e reposicione o fragmento até que esteja corretamente orientado.

Uma vez que o explante esteja corretamente orientado, aspire o excesso de HBSS e aguarde 15 segundos. Em seguida, pipete 60 microlitros de meio de cultura aquecido diretamente sobre o espécime, tomando cuidado para não tocar o espécime com a pipeta. Recoloque as tampas interna e externa da placa de Petri e incube durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, transfira o explante coclear contendo as placas de Petri do incubador para a cabine de fluxo laminar. Aspire o meio de cultura antigo, que não contém soro bovino fetal (FBS), do interior da placa. Adicione 60 microlitros por poço do meio de tratamento aquecido e preparado.

Coloque a placa de Petri de volta no incubador até a coloração das culturas após um máximo de sete dias. Como visto nesta imagem confocal, esta técnica preserva a anatomia de toda a volta coclear, incluindo os neurônios do gânglio espiral ou SGNs, permitindo a análise dos efeitos do tratamento sobre neuritos e somatas dos SGNs, além do órgão de Corti. Como mostrado aqui, esses explantes podem ser usados para comparar simultaneamente o efeito do tratamento nas voltas apical e basal após coloração por imunofluorescência.

As células ciliadas são mostradas em verde e as estruturas neuronais aparecem em vermelho. Sinapses intactas podem ser avaliadas por meio da marcação de proteínas pré-sinápticas mostradas em vermelho e proteínas pós-sinápticas mostradas em verde, juntamente com a coloração das estruturas neuronais em azul. Esta figura mostra imagens representativas de explantes cocleares apicais e basais após sete dias em cultura, com 3% de FBS à esquerda ou 1% de FBS à direita.

Células incubadas em 3% de FBS começam a migrar entre os dias quatro e cinco, conforme indicado pelas setas em cinza claro para células ciliadas e pelas setas vermelhas para neuritos. Os explantes em 1% de FBS mantêm a integridade organizacional até o dia sete. Ao realizar este procedimento, é importante verificar visualmente a integridade estrutural e a orientação do tecido da cóclea antes de adicionar o meio de cultura final e as substâncias de interesse.

Após este procedimento, pode-se realizar a reconstrução tridimensional para confirmar a localização específica do tipo celular de células que expressam GFP dentro da medialis.