Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de células T CD8 infiltrantes de tumores residentes marcadas com anticorpos acoplados fluorescentemente em fatiadores de tumor de pulmão humano usando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na imunologia tumoral, como a natureza dos elementos que regulam positiva e negativamente a migração de células T dentro de tumores humanos. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite monitorar o comportamento diário das células T CD8 residentes em um ambiente tumoral humano preservado.

Tivemos uma ideia para esse método pela primeira vez quando estabelecemos o método nos linfonodos de Myrin para rastrear células T, plantá-las em fatias, um protocolo publicado originalmente no JoVE em 2011. Para começar, adicione um grama de agarose de baixo ponto de fusão em um recipiente e, em seguida, adicione 20 mililitros de PBS estéril sem cálcio e magnésio. Microondas a solução para dissolver completamente a agarose.

Resfrie esta solução de 5% de agarose em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Na capa de cultura de tecidos, adicione 1,1 mililitros de meio RPMI-1640 completo em cada poço de uma placa de subcultura de subpoço de seis poços. Em seguida, usando um par de pinças estéreis, coloque uma inserção de cultura de células estéril de 30 milímetros em cada poço.

Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos até o uso posterior. Em seguida, coloque a biópsia do tumor em um prato de plástico de 10 centímetros e, usando uma lâmina afiada e estéril, corte o tumor em um pequeno fragmento em forma de cubo de aproximadamente cinco por cinco milímetros. Agora, retire a solução de agarose preparada da incubadora.

Usando uma pinça estéril, transfira cuidadosamente os fragmentos do tumor para um lenço de tecido para drenar o excesso de meio, em seguida, despeje a agarose em um prato de plástico de 35 milímetros e insira os fragmentos do tumor de modo a posicioná-los no fundo do prato de plástico. Deixe o gel de agarose no gelo por cinco minutos para solidificar. Assim que a agarose solidificar, inverta o prato de plástico.

Usando uma espátula, solte todo o gel. Com uma lâmina afiada, apare o excesso de agarose ao redor dos fragmentos do tumor, deixando de três a cinco milímetros de gel ao redor do tecido. Usando uma gota de cola de tecido não tóxica, monte o bloco de agarose no disco de amostra do vibratome.

Encha a bandeja tampão do vibratomo com PBS estéril e gelado e instale o disco de amostra contendo o bloco de agarose na bandeja. Defina a velocidade e a frequência do vibratomo para os valores desejados. Quando a configuração do vibratomo estiver pronta, retire a placa de seis poços da incubadora.

Agora comece a cortar o bloco montado em fatias de 350 mícrons usando o vibratome. Com a ajuda de pinças finas, colete cuidadosamente as fatias do tumor à medida que estão sendo cortadas e coloque-as planas sobre as inserções de cultura de células na placa de seis poços. Transfira uma fatia sobre cada inserção.

Em seguida, usando uma pinça fina, coloque arruelas de aço inoxidável pré-esterilizadas e pré-úmidas em cada fatia. Certifique-se de que as arruelas estejam bem posicionadas na agarose ao redor do tecido tumoral. Deixe a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% antes da imunocoloração.

Dilua os anticorpos marcados com fluorescência necessários e o corante nuclear fluorescente, DAPI, até as concentrações de vinil necessárias no meio RPMI livre de vermelho de fenol. Em seguida, remova a placa de cultura da incubadora e, usando uma ponta fina, aspire o líquido dentro das arruelas de aço inoxidável. Agora, sem tocar na fatia, adicione 40 microlitros dos anticorpos diluídos em cada fatia do tumor.

Para permitir a coloração, incube a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da etapa de coloração, usando uma pinça fina, remova as arruelas. Em seguida, retire delicadamente as fatias e mergulhe-as no meio RMPI-1640 sem vermelho de fenol por 10 segundos.

Coloque as fatias de volta nas inserções de cultura de células e adicione uma gota de meio RMPI-1640 livre de vermelho de fenol sobre cada fatia. Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, prossiga para a imagem. Várias horas antes de iniciar este experimento, ajuste a temperatura da câmara de calor do microscópio para 37 graus Celsius e, em seguida, prepare a configuração do microscópio para profusar constantemente fatias de tumor com meio RMPI livre de vermelho de fenol oxigenado e aspirar o soluto para um frasco de coleta de resíduos usando bomba peristáltica.

Com a ajuda de uma pinça fina, retire a fatia manchada da placa de seis poços e transfira-a para um prato de plástico de 35 milímetros preenchido com meio RMPI livre de vermelho de fenol, coloque uma âncora de fatia sobre a fatia para apoiá-la. Em seguida, coloque esta placa de Petri no estágio de imagem do microscópio. Depois de conectar as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão, ligue a bomba peristáltica para permitir que o meio oxigenado passe pelos tubos de perfusão.

Abaixe a objetiva de emersão de água até a fatia e concentre-se no topo da fatia com luz de campo brilhante ou com o comprimento de onda apropriado. Em seguida, usando filtros apropriados, visualize e selecione uma região de interesse que contenha todas as células de interesse marcadas com fluorescência, ou seja, células T CD8, ilhós tumorais e células estromais CD90 positivas. Configure uma sessão de imagem usando intensidade de laser e tempos de exposição apropriados para se adequar ao brilho dos sinais fluorescentes observados.

Em seguida, configure a espessura da pilha Z para obter imagens dentro da fatia do tumor. Em seguida, selecione o intervalo de tempo da imagem Z-stack e o tempo total de gravação para capturar imagens em intervalos de tempo específicos. Depois de capturar e exportar as imagens fluorescentes, analise a migração de células T CD8 conforme descrito no protocolo de texto.

Aqui é mostrada uma imagem representativa de uma fatia de tumor de pulmão humano corado. Observe a distribuição de células T CD8 positivas verdes, células tumorais coradas com moléculas de adesão de células epiteliais azuis e células estromais CD90 vermelhas ou Thyrum positivas. Em particular, observe que as células T CD8 são mais abundantes no estroma em comparação com os ilhós do tumor.

Aqui estão traçadas as trajetórias das células T CD8 residentes individuais coradas de verde e os compartimentos de células tumorais estromais vermelhas e azuis da fatia do tumor de pulmão humano. O colágeno detectado usando a geração de segundo harmônico e exibido em vermelho marca o compartimento estromal. Embora menos abundantes que os ilhós tumorais, as células T CD8 migram mais ativamente neste compartimento em comparação com o estroma.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em geralmente quatro, cinco horas se for executada corretamente. Após este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter amostras de tumor de humor de imunocoloração, a fim de monitorar células T CD8 residentes usando um microscópio confocal.