Name: Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprenda a imaginar linfócitos T CD8 residentes em fatias de tumor pulmonar humano usando microscopia confocal. Este método permite analisar em tempo real a migração celular em ambiente tumoral preservado.

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Gostaríamos de agradecer a Pierre Bourdoncle e Thomas Guilbert da Cochin Imaging facilidade (Institut Cochin, Paris) para aconselhamento e assistência com microscópios. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do francês Ligue Nationale contre le Cancer, pelo CARPEM (pesquisa do câncer para medicina personalizada), pelo Fondation de France e da União Europeia Horizonte 2020 pesquisa e inovação do programa sob concessão n 667980 (CARAT) de acordo.

Tumores humanos foram obtidos com o acordo do Comité francês de ético e pela assistência Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) no aplicativo com o artigo L.1121-1, da lei francesa. Obteve-se um termo de consentimento informado dos pacientes antes da inclusão no estudo.
1. obtenção de tumores de pulmão humano
<ol>
	<li>Obter amostras de tumor de pulmão frescas de pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas estágio-III, que foi submetido a uma ressecção cirúrgica completa de seus tumores de pulmão4.</li>
	<li>Transporte o tumor fresco não fixa em tubo cônico de 15 mL contendo meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) gelado. Reserve no gelo por 30 min até passo 2.7. Nota: Quando os tumores são recebidos no período do tarde, colocá-los em 4 ° C durante a noite e o processo no dia seguinte. Neste caso, complementar a mídia RPMI-1640 com 5% de soro fetal bovino (FBS).</li>
</ol>
2. Agarose incorporação e vibratome de corte de tumores de pulmão humano
Nota: Execute todas as etapas até 2.10 sob condições estéreis.
<ol>
	<li>Prepare a solução de agarose de 5% para incorporação pela dissolução de 1 g agarose de ponto baixo ponto de fusão em 20 mL estéril de tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio. Microondas esta solução até a agarose é completamente dissolvido. Permitir que a agarose esfriar a 37 ° C, colocando a solução em uma incubadora a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Em uma capa de cultura de tecidos, prepare meio RPMI-1640 completo (sem vermelho de fenol) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 4 mM L glutamina e 1x penicilina e estreptomicina.</li>
	<li>Adicionar meio RPMI-1640 completo de 1,1 mL por alvéolo para uma placa de cultura de células de 6-poços e coloque uma inserção de cultura de célula de 30 mm em cada poço. Reserve a placa em uma incubadora a 37 ° C por 30 min até passo 2.12.</li>
	<li>Lugar esterilizado arruelas planas de aço inoxidável (diâmetro interno de 5 mm, fora de 10 mm de diâmetro e espessura de 1 mm) em um prato de plástico-35mm preenchido com completo meio RPMI. Anilhas serão mais usadas para concentrar os anticorpos a fatia de vibratome de corte.</li>
	<li>Coloque a biópsia do tumor em um prato de plástico de 10 cm e corte o tumor com uma lâmina afiada em fragmentos de forma cubo pequeno de aproximadamente 5 x 5 mm de comprimento.</li>
	<li>Retire o agarose da incubadora e despeje a solução em um prato de plástico-35mm.</li>
	<li>Use um par de pinças para transferir com cuidado, os fragmentos do tumor para uma limpeza de tecido para retirar o excesso do meio. Inserir os fragmentos o agarose e posicioná-los no fundo do prato plástico. Deixe o gel de agarose no gelo por 5 min solidificar.</li>
	<li>Uma vez que a agarose solidifica, inverta o prato plástico e use uma espátula para liberar o gel todo.</li>
	<li>Use uma lâmina afiada para aparar o excesso agarose cercam o fragmento do tumor, deixando de 3 a 5 mm de gel ao redor do tecido.</li>
	<li>Monte cada bloco de agarose no disco espécime do vibratome com uma gota de cola de tecido de cianoacrilato butílico de tóxicos. Encha a bandeja de tampão vibratome com PBS estéril gelada e instalar o disco de amostra na bandeja.</li>
	<li>Corte o agarose incorporado tecido em 350 µm de espessura. Ajustar as definições de vibratome a uma velocidade lenta de gama (0.2-0.3 mm/s) e a frequência de vibração em um intervalo médio (1,5 mm).</li>
	<li>Usando a pinça fina, cuidadosamente colete as fatias de tumores, como eles estão sendo cortados e colocá-los horizontalmente para as inserções de cultura de células de uma placa de 6 (passo 2.3). Transferi 1 fatia em cada inserção. Use muito cuidado ao manusear as fatias como eles podem ser facilmente danificados.</li>
	<li>Use pinça fina para colocar arruelas de aço inoxidável em cada fatia individual. Certifique-se que as anilhas estão bem posicionadas no tecido do tumor o agarose.</li>
	<li>Manter a placa de cultura a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 durante 10 min. proceder de imunocoloração.</li>
</ol>
3. imunocoloração de residentes células T CD8 e células tumorais
<ol>
	<li>Dilua os anticorpos (concentração final de 10 µ g/mL) e o corante nuclear (concentração final de 1 µ g/mL) em mídia RPMI 1640 sem vermelho de fenol. Nota: Usar fluorescente acoplados anti-CD8 (IgG murino, clonar SK1) e anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) (murino IgG HEA-125) anticorpos para rotular os linfócitos T CD8 e tumor células epiteliais, respectivamente. Use anticorpos acoplados fluorescente anti-CD90/Thy1 (IgG murino, clone 5E10) rótulo fibroblastos e células endoteliais ativadas. Use 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para rotular o núcleo das células com uma membrana de plasma comprometida a fim de avaliar a viabilidade do tecido.</li>
	<li>Remover as placas de cultura de incubadora e usar uma pipeta para aspirar qualquer líquido dentro as anilhas de aço inoxidável. Não remova a mídia de 1,1 mL de RPMI-1640 colocada sob as inserções de cultura celular (passo 2.3).</li>
	<li>Sem tocar a fatia e utilize uma ponta de pipeta, adicione 40 µ l da solução que contém os anticorpos para cada fatia de tumor.</li>
	<li>Incube a placa a 37 ° C por 15 min permitir que a mancha do anticorpo.</li>
	<li>Com a pinça fina, retire as anilhas, tire as fatias e mergulho os 10 s em RPMI-1640 mídia sem vermelho de fenol. Coloque de volta as fatias para as inserções de cultura celular e adicionar uma gota de vermelho de fenol-livre RPMI-1640 médio em cada fatia individual. Manter a placa a 37 ° C por 10 min. proceder à imagem.</li>
</ol>
4. imaging e analisando a migração de células T CD8 residente dentro de fatias de tumor de pulmão humano
Nota: O microscópio confocal utilizado neste protocolo é uma verticalidade girando o disco equipado com um 25 x objetivo de imersão de água (25 x / 0.95 N.A.).
<ol>
	<li>Preparando a instalação do microscópio<ol>
		<li>Defina a temperatura da câmara de calor microscópio a 37 ° C, algumas horas antes de iniciar a sessão de imagens.</li>
		<li>Configurar um sistema para perfundir constantemente fatias do tumor com oxigenada (5% CO2, 95% O2) meio RPMI de vermelho de fenol-livre (Figura 1). Use uma bomba peristáltica para fluxo de mídia a perfusão na câmara de imagens e de aspirar a solução para um balão de recolha de resíduos.</li>
		<li>Execute a bomba peristáltica para permitir que a solução oxigenada para passar os tubos de perfusão.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Com a pinça fina, retire a fatia da placa de 6 e transferência para o prato de plástico-35mm encheu de vermelho de fenol-livre médio RPMI. Imobilize a fatia com uma âncora de fatia 19,7 mm de diâmetro com 2 mm espaçadas-tópicos. Coloque o prato de Petri no palco de imagem do microscópio. Conecte as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão. Ligue o sistema de perfusão e definir a taxa de fluxo de mídia de 0,8 mL/min.</li>
	<li>Baixe o objectivo da água-imersão a fatia. Concentre-se no topo a fatia com luz de campo brilhante.</li></ol>Com luz fluorescente apropriado, selecione uma região de interesse que contém células T CD8, ilhotas de tumor (positivas para EpCAM) e uma área de estroma (positiva para CD90). Verificar a viabilidade de células dentro da fatia, avaliando DAPI mancha na superfície de corte e mais profunda no tecido. Nota: Uma fatia saudável contém apenas uma minoria de células positivas DAPI a vários mícrons de superfície de corte.
	<li>Defina uma sessão de imagens com as seguintes ações.<ol>
		<li>Dependendo da intensidade do sinal fluorescente dos 3 fluorophores, defina o tempo de exposição entre 50 a 800 ms e a intensidade do laser entre 20 a 40%.</li>
		<li>Selecione a espessura de pilha de z a imagem dentro da fatia de tumor. Nota: 10-12 aviões ópticos abrangendo uma profundidade total de 60-70 µm na dimensão z aqui, foram capturados.</li>
		<li>Selecione a posição inicial em aproximadamente 10 µm abaixo as primeiras células T CD8 rotuladas.</li>
		<li>Definir o intervalo de tempo entre cada imagem de z-pilha entre 10 a 30 s e o tempo de gravação total entre 10 a 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analise a migração de células T CD8 residente conforme descrito na referência4.<ol>
		<li>Depois de importar os dados para um software de rastreamento, crie pontos para cada célula T CD8 no campo. Ajuste o diâmetro das células e o limite de deteção de acordo sobre as células fluorescentes imagens.</li>
		<li>Inspecione as faixas e remover qualquer faixa irrelevante por excluí-los. Corretas trilhas conectando e desconectando faixas diferentes e pontos de tempo diferentes das mesmas faixas. Exporte os dados (faixa de velocidade, faixa de comprimento de deslocamento) para um software de planilha eletrônica.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054(2011).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li>
<li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500(2015).</li>
<li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+Oncology+Meets+Immunology%3A+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li>
<li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exclusion%2C+immune+privilege%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

É descrita uma técnica simples, rápida e robusta para a geração de fatias de tumor de pulmão humano e avaliação do comportamento dinâmico de residentes células T CD8 em um ambiente preservado tumor usando um microscópio confocal. Este protocolo é um refinamento do anterior artigo JoVE que descreve o monitoramento chapeadas de pilhas de T no linfonodo murino fatias2.
Branqueamento de corantes fluorescentes deve ser considerado especialmente com corantes de primeira geração como isotiocianato de fluoresceína e ficoeritrina. Nós achamos que um pronunciado fotobranqueamento de anticorpos acoplados diretamente ocorreu com um microscópio de dois fotões. Por outro lado, percebeu-se fotobranqueamento mínimo com microscópios confocal, especialmente usando corantes fluorescentes brilhantes desenvolvidos recentemente.
Os anticorpos são moléculas relativamente grandes e, portanto, a sua penetração no tecido pode ser difícil. Esta etapa pode ser melhorada, aumentando o tempo de incubação. Além disso, o uso de uma menor coloração reagentes tais como diretamente acoplados Fab fragmentos de anticorpos representa uma boa alternativa.
Todos os anticorpos descritos neste protocolo foram previamente validados e conhecidos para produzir a coloração brilhante4. Portanto, o isotipo controles não são necessários. No entanto, se as modificações para este método usando outros anticorpos são desejadas, então o uso de anticorpos do isotipo controle é altamente recomendável.
Este sistema experimental apresenta algumas limitações. O procedimento de corte irá danificar o tecido, que pode afetar o comportamento de células T CD8, especialmente perto da superfície de corte. Além disso, uma série de fatores solúveis (por exemplo, quimiocinas) instrumentais em controlar a migração de células T pode ser perdida. Uma maneira de contornar estes problemas é através da monitorização de células T, localizadas em várias dezenas de mícrons da superfície em regiões supostamente mais saudáveis do tecido. Experimentos publicados revelam que as células T localizadas profundamente dentro do tecido migram mais ativamente do que células T localizadas perto da superfície corte4. Nós usamos microscópios confocal para nossos estudos, mas é provável que dois fotões microscópios irão aumentar a resolução espacial em profundidade.
Esta abordagem baseia-se na utilização de anticorpos acoplados fluorescente que não são moléculas neutras. Anticorpos de tamanho são susceptíveis de afectar o funcionamento normal das células T em maneiras diferentes. Primeiro, anticorpos anti-CD8 podem alterar a migração de células T provocando uma cascata de sinalização intracelular capaz de afetar o citoesqueleto do linfócito. Em segundo lugar, os anticorpos anti-CD8 podem modular a interação entre o CD8 e MHC classe I moléculas, um passo importante no processo de reconhecimento de antígeno. Anticorpos em terceiros lugar, intactos podem ligar aos receptores Fc expressados por muitas células mieloides distribuídas no tumor e, portanto, suscetíveis para aumentar o sinal específico. Não temos indicação que tal problema afetou nossos dados, provavelmente porque os receptores Fc de células mieloides residentes são, ao contrário de células em cultura, saturados com imunoglobulinas presentes dentro do meio do tumor. Com efeito, a adição de soro durante o procedimento de rotulagem, um processo conhecido para bloquear os receptores Fc livre, não alterou a imuno-coloração. Não obstante, Fab fragmentos de anticorpos, desprovido de região Fc, bem como anticorpos mutado em sua região de Fc e de fragmentos de anticorpos derivados camelid8 representam outras estratégias alternativas para rastrear as células residentes com marcadores fluorescentes.
Nas últimas décadas, vários sistemas de modelo foram desenvolvidos e utilizados para o tratamento de imagens em tempo real de linfócitos T. Estes incluem em vitro preparações de T células previamente purificadas e cultas com células apresentadoras. Tais preparações permitiram progressos notáveis na definição dos mecanismos de reconhecimento do antígeno e capacidade de resposta. No entanto, falta-lhes a complexidade do ambiente tecido. Foram estabelecidas outras preparações que mais estreitamente imitam a estrutura de um tecido nativo. Para obter exemplos, matrizes de gel de colágeno tridimensional na qual células T purificadas tem sido incorporadas, bem como a cultura do tecido reaggregated fragmentos têm sido utilizados para monitorar o comportamento dinâmico de linfócitos T com fluorescentes imaging technologies9 . Estes sistemas apresentam a vantagem de uma arquitetura perto do tecido nativo, mas falta-lhes outros factores importantes de celulares e solúveis. No rato, microscopia intravital dois fotões tem sido empregada para rastrear as células T no ambiente verdadeiramente fisiológica de um órgão intacto10. No entanto, tal abordagem é tecnicamente difícil de configurar. Além disso, o rato modelos mostram notáveis diferenças com a fisiologia humana.
A técnica descrita neste protocolo representa um ambiente de complexos multicelulares tumor que está singularmente posicionada para atuar como um elo importante entre a co-cultura estudos e modelos animais.
O protocolo descrito neste documento também pode ser usado para rastrear a motilidade de outras células que os linfócitos T CD8, para o qual foram gerados anticorpos. Além disso, a técnica pode ser adaptada para outros tumores humanos e murino e tecidos. Por exemplo, nós fomos capazes de imagem em tempo real a dinâmica das células B rotulada com um anticorpo anti-CD19 em amígdalas humanos frescos.
A técnica descrita neste protocolo permite que a tela para moléculas terapêuticas controlando a motilidade de células T em tecidos. A acessibilidade do sistema de cultura permite aplicar alguns reagentes farmacológicas e testar as suas consequências sobre a migração de células T. Ele agora é aceito que, no crescimento de tumores, as células T CD8 apresentam uma baixa migração e reduzidos contatos com células de tumor11. Importante, a escassa presença de células T em regiões de células de tumor está associada um resultado ruim e é considerada um dos mecanismos de resistência, a imunoterapia baseada em células T. Foram identificados vários obstáculos, limitando as células T de migração em tumores incluindo uma densa matriz extracelular. A este respeito, a identificação de moléculas capazes de restaurar a motilidade da célula T e interação com células malignas representa um importante passo na imunoterapia. Em um estudo anterior, achamos que uma degradação parcial de colágeno com colagenase, agudamente aplicado a fatias de pulmão humano, melhora o contato das células T com as células do tumor.
Finalmente, a possibilidade de manter as fatias de tumor humano na cultura por até vários dias7,12,13 oferece uma série de aplicações promissoras em termos de células T e imunoterapia.No entanto, a estabilidade do sistema de modelo durante a cultura de longo prazo é um parâmetro importante que deve ser cuidadosamente avaliada.
Obtenção de tecido fresco e saudável é um fator crítico para produzir fatias de qualidade com boa imunocoloração de elementos estromais, células tumorais e células CD8. Manter a biópsia do tumor a 4 ° C antes do processamento é crucial.
A manipulação de fatias com pinça fina representa mais um passo crítico no âmbito do presente protocolo. Isto deve ser realizado com muito cuidado, como a agarose pode ser facilmente danificado. Um corte no agarose irá comprometer o selo feito pela arruela de aço inoxidável, resultando em um vazamento do anticorpo contendo soluções.

Células T CD8 desempenham um papel chave na batalha contra o câncer. No entanto, muitos mecanismos supressivos impedem linfócitos T matar células malignas. Nos últimos anos, várias estratégias promissores que liberam os freios em células T foram desenvolvidas e utilizadas na clínica5. As duas abordagens que retêm a atenção considerável são alvos de ponto de verificação imune-anticorpos, tais como terapias anti-PD-1 e adotivos célula T. No entanto, apesar dos sucessos recentes, apenas um subconjunto de pacientes beneficiar estas terapias6. Um grande desafio é identificar mecanismos de resistência à imunoterapia para desenvolver tratamentos mais eficazes. Outro desafio é desenvolver sistemas de modelo no qual romance terapias podem ser caracterizadas e testadas pela sua potência e segurança. Até agora, a maioria destes ensaios se baseiam em vitro celular cultura sistemas que imitam mal a complexidade do tecido do tumor.
Ex vivo fatias de tecido é uma técnica promissora, que conserva o original tecido microambiente7. Ao longo dos anos, criámos esta abordagem para acompanhar a dinâmica dos linfócitos T em vários tecidos. Nossos resultados indicam que a fluorescente etiquetadas células T adicionadas no topo do nó de linfa murino fatias migram para o tecido e respondem às suas sugestões microenvironmental apropriado1,2. Da mesma forma, linfócitos T, sobrepostos em fatias de tumor de pulmão humano são rapidamente recrutou para o tumor estroma3. Usando esta técnica, nós identificamos a matriz extracelular como um elemento importante para controlar a distribuição e a migração de células T dentro de tumores humanos3,4. Porque o comportamento do ex vivo purificado e chapeadas células T não reflete necessariamente o comportamento dos linfócitos T de residente intratumoral, nós recentemente refinaram esta abordagem4.
Aqui descrevemos um protocolo para controlar residentes linfócitos T dentro de fatias de tumores de pulmão humano fresco. As diferentes etapas da preparação de fatias de tumor de pulmão humano (incluindo incorporação de agarose e vibratome de corte do tecido incorporado), consistem a coloração endógenas de pilhas de T com anticorpos fluorescentes fatias frescas de tumor, e o controlo da Estas células com um microscópio confocal.

<table><tbody><tr><td>Microscópio confocal vertical</td><td>Leica</td><td></td><td>O uso de um disco giratório confocal é recomendado</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Este software é usado para visualização de imagens e rastreamento da migração de células T</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>World Precision Instruments</td><td>14142</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Inserções de cultura</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio, GlutaMAX Suplemento</td><td>ThermoFisher</td><td>61870010</td><td>completo RPMI-medium é feito pela adição de 10% de soro fetal de bezerro inativado por calor e penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solução salina balanceada (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170088</td><td></td></tr><tr><td>Baixa temperatura de gelificação Agarose, tipo VII-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Cola de cianoacrilato butílico não tóxico, Vetbond</td><td>3M</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>Âncoras de fatia, 19,7 de diâmetro, espaçamento de 2 mm de roscas Warner</td><td>Instruments</td><td>64-1415</td><td></td></tr><tr><td>Arruelas de aço inoxidável, 5 mm de diâmetro interno</td><td>Amazon</td><td></td><td></td>B004K1FDGQ</tr><tr><td>anti-CD8 conjugado com BV605 (clone SK1)</td><td>BD Biosciences</td><td>565289</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCAM conjugado com FITC (clone HEA-125)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-113</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD90 conjugado com BV510 (clone 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328125</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imagem de linfócitos de t cd8 residente no tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia confocal

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Células T CD8 são jogadores-chave na luta contra o câncer. Em ordem para as células T CD8 matar células tumorais precisam entrar o tumor, migrar dentro o microambiente do tumor e dar uma resposta adequada aos antígenos do tumor. O recente desenvolvimento de abordagens de imagem melhoradas, como microscopia 2-fóton e o uso de modelos de tumor poderoso rato tem lançar luz sobre alguns dos mecanismos que regulam a actividade anti-tumoral T celular. Considerando que tais sistemas forneceram informações valiosas, eles não sempre prever respostas humanas. Em humanos, nosso conhecimento no campo vem principalmente de uma descrição das amostras de tumor fixo dos pacientes humanos, bem como estudos em vitro . No entanto, em vitro modelos carecem de meio de tumor tridimensionais complexos e, portanto, são aproximações incompletas do in vivo atividades de células T. Fatias frescas feitas de tecido explantado representam um ambiente de tumor multicelulares complexos que pode atuar como um elo importante entre estudos co cultos e modelos animais. Originalmente criada em linfonodos murino1 e descrito anteriormente em um artigo de Júpiter2, esta abordagem agora foi transposta para tumores humanos para examinar a dinâmica de chapeado3 bem como residente de células T4.
Aqui, um protocolo para a preparação de fatias de tumor de pulmão humano, imunocoloração de células T CD8 e tumor residentes e rastreamento de linfócitos T CD8 dentro o microambiente do tumor utilizando microscopia confocal é descrito. Este sistema é exclusivamente colocada a tela para agentes de imunoterapia romance, favorecendo a migração de células T em tumores.

Tumores de pulmão humano são geralmente altamente infiltradas em células T CD8 que encontram-se preferencialmente no estroma3,4. Seguindo este protocolo se deve esperar para visualizar um grande número de immunostained T CD8 em fatias de tumor de pulmão humano. Co de uma rotulagem com anticorpos anti-EpCAM e anti-CD90 deve permitir delinear ilhotas de tumor e áreas do estroma. Fibrillar colágeno, abundante no estroma do tumor, pode ser visualizado sem coloração exógena usando a segunda geração de harmônica em um microscópio de dois fotões3,4. Observe que alguns tumores de pulmão humano não apresentam nenhuma distinção clara entre ilhotas de tumor e estroma. Esses tumores devem ser descartados bem como espécime apresentar grandes áreas de necrose celular identificado por ligação não específica de anticorpos e DAPI coloração. Consistente com resultados publicados obtidos no pulmão humano e carcinomas de ovário, residentes células T CD8 estão mais concentradas no estroma em relação ao tumor de ilhotas4. Um exemplo representativo da distribuição de células T CD8 em relação às células tumorais e CD90 é mostrado na Figura 2.
O ensaio de fatia permite a análise da motilidade residente células T em regiões diferentes do tumor. Critérios úteis para comparar a motilidade de células T CD8 em diferentes regiões incluem a velocidade média (comprimento de caminho dividido pela duração tempo amostrada) e o comprimento do deslocamento (o vetor entre o início e final de uma trilha). Embora escassos em ilhotas do tumor, as células T CD8 migram mais activamente neste compartimento em comparação com o estroma (Figura 3). Em média, a velocidade média de células T CD8 individuais deve ser perto de 4 µm/min no estroma tumor com alta intra e inter tumor variabilities4. No estroma do tumor, a motilidade do residentes células T é fortemente influenciada pela densidade e a orientação da matriz extracelular fibras3,4. Uma experiência bem sucedida resultará em menos células T presentes em áreas de matriz densa em comparação com regiões de matriz solto, consistentes com resultados publicados3,4.
Observe que alguns tumores de pulmão humano apresentam um nível muito alto de autofluorescência impedindo a imagem latente de residentes células T. Tal característica é observada rapidamente no início da sessão de imagens. Autofluorescent tumores devem ser descartados. Um exemplo representativo de residentes células T CD8 em um tumor de autofluorescent é mostrado na Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
Figura 1: fotografias do sistema de perfusão. A) a solução de vermelho de fenol-livre RPMI é enriquecida em 5% C02, 95% O2. B) a solução é então perfundida por uma bomba peristáltica. C) a solução RPMI entra o prato de cultura através da entrada. Na saída, a solução é aspirada pela bomba da câmara em um recipiente de resíduos. Note que a ponta de aspiração é fixada a um nível para determinar a altura de solução. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
Figura 2: distribuição de T de CD8 residente células em um tumor de pulmão humano. Imagem representativa de uma fatia de tumor de pulmão humano manchado para CD8 (verde), EpCAM (azul) e CD90 (vermelho). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
Figura 3: motilidade do residente T CD8 células em um tumor de pulmão humano. Trajetórias das células individuais de T CD8 residentes nas regiões de célula (azul) tumor de uma fatia de carcinoma de pulmão humano e do estroma (vermelho). A fatia foi manchada com os anticorpos indicados e fotografada por 20 min com um microscópio confocal. O colágeno fibrilar foi detectado no final usando a segunda geração de harmônica (SHG) em um microscópio de dois fotões. Faixas são codificados por cores de acordo com o comprimento de deslocamento de células T CD8. Esta imagem foi modificada em 4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
Figura 4: imagem representativa de um tumor de pulmão humano autofluorescent. A fatia do tumor foi manchada para CD8 (verde) e EpCAM (azul). O sinal SHG está em vermelho. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de linfócitos T CD8 residentes que infiltram tumores, marcados com anticorpos conjugados a fluoróforos, dentro de fatias de tumor pulmonar humano utilizando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na imunologia tumoral, como a natureza dos elementos que regulam positiva e negativamente a migração dos linfócitos T dentro de tumores humanos. A principal vantagem desta técnica é que ela nos permite monitorar diariamente o comportamento dos linfócitos T CD8 residentes em um ambiente tumoral humano preservado.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao estabelecer o protocolo em linfonodos de Myrin para rastrear linfócitos T, cultivando-os em fatias, um protocolo originalmente publicado no JoVE em 2011. Para começar, adicione um grama de agarose de ponto de fusão baixa em um recipiente e, em seguida, acrescente 20 mililitros de PBS estéril, livre de cálcio e magnésio. Aqueça a solução em forno de micro-ondas para dissolver completamente a agarose.Resfrie esta solução de agarose a 5% em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Na cabine de cultura de tecidos, adicione 1,1 mililitro de meio RPMI-1640 completo em cada poço de uma placa de subcultura de seis poços. Em seguida, utilizando um par de pin&ccedil;as est&eacute;reis, coloque um inserto est&eacute;ril de cultura celular de 30 mil&iacute;metros em cada po&ccedil;o.Incube a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos até uso posterior. Em seguida, coloque a biópsia tumoral em uma placa plástica de 10 centímetros e, usando uma lâmina afiada e estéril, corte o tumor em um fragmento em forma de cubo pequeno com aproximadamente cinco por cinco milímetros. Agora, retire a solução de agarose preparada do incubador.Usando um par de pin&ccedil;as est&eacute;reis, transfira cuidadosamente os fragmentos tumorais para um len&ccedil;o de tecido para drenar o meio em excesso, em seguida despeje a agarose em uma placa pl&aacute;stica de 35 mil&iacute;metros e insira os fragmentos tumorais de modo a posicion&aacute;-los no fundo da placa. Deixe o gel de agarose sobre gelo por cinco minutos para solidificar. Uma vez solidificada a agarose, inverta a placa pl&aacute;stica.Usando uma espátula, solte inteiramente o gel. Com uma lâmina afiada, corte o excesso de agarose ao redor dos fragmentos tumorais, deixando três a cinco milímetros de gel ao redor do tecido. Usando uma gota de cola para tecidos não tóxica, monte o bloco de agarose no disco de espécime do vibrátomo.Encha a bandeja de buffer do vibrátomo com PBS estéril e gelado, e instale o disco de espécime contendo o bloco de agarose na bandeja. Ajuste a velocidade e a frequência do vibrátomo aos valores desejados. Quando a configuração do vibrátomo estiver pronta, retire a placa de seis poços do incubador.Agora, comece a cortar o bloco montado em fatias de 350 mícrons utilizando o vibrátomo. Com a ajuda de pinças finas, colete cuidadosamente as fatias tumorais à medida que são cortadas e coloque-as planas sobre os insertos de cultura celular na placa de seis poços. Transfira uma fatia para cada inserto.Em seguida, utilizando pin&ccedil;as finas, posicione arruelas de a&ccedil;o inoxid&aacute;vel pr&eacute;-esterilizadas e pr&eacute;-umedecidas sobre cada fatia. Certifique-se de que as arruelas estejam bem posicionadas sobre o agarose ao redor do tecido tumoral. Deixe a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos em um incubador com atmosfera umidificada contendo 5% de di&oacute;xido de carbono antes da imunomarca&ccedil;&atilde;o.Dilua os anticorpos marcados com fluoróforo e o corante nuclear fluorescente, DAPI, até as concentrações desejadas em meio RPMI sem vermelho de fenol. Em seguida, retire a placa de cultura do incubador e, utilizando uma ponteira fina, aspire o líquido presente dentro dos anéis de aço inoxidável. Agora, sem tocar no fragmento, adicione 40 microlitros dos anticorpos diluídos sobre cada fatia tumoral.Para permitir a coloração, incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após a conclusão da etapa de coloração, utilizando pinças finas, remover os lavadores. Em seguida, retirar cuidadosamente as fatias e mergulhá-las no meio RMPI-1640 sem Vermelho de Fenol por 10 segundos.Coloque as fatias novamente sobre os insertos de cultura celular e adicione uma gota de meio RMPI-1640 sem Fenol Vermelho sobre cada fatia. Incube a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, prossiga para a aquisição de imagens. Algumas horas antes de iniciar este experimento, ajuste a temperatura da câmara de aquecimento do microscópio para 37 graus Celsius, depois prepare a configuração do microscópio para perfundir constantemente as fatias tumorais com meio RMPI sem Fenol Vermelho oxigenado e para aspirar o soluto para um frasco coletor de resíduos utilizando uma bomba peristáltica.Com a ajuda de pin&ccedil;as finas, levante a fatia corada para fora da placa de seis po&ccedil;os e transfira-a para um recipiente pl&aacute;stico de 35 mil&iacute;metros cheio com meio RMPI livre de vermelho de fenol; em seguida, coloque uma &acirc;ncora de fatia sobre a fatia para suport&aacute;-la. A seguir, posicione este recipiente sobre a platina de imagem do microsc&oacute;pio. Ap&oacute;s conectar as pontas de entrada e sa&iacute;da do sistema de perfus&atilde;o, ligue a bomba perist&aacute;ltica para permitir que o meio oxigenado passe pelos tubos de perfus&atilde;o.Abixe o objetivo de imersão em água até o corte e foque no topo do corte com luz de campo claro ou com o comprimento de onda apropriado. Em seguida, utilizando filtros adequados, visualize e selecione uma região de interesse que contenha todas as células marcadas com fluorescência de interesse, nomeadamente as células T CD8, os focos tumorais e as células estromais positivas para CD90. Configure uma sessão de imageamento usando intensidade de laser e tempos de exposição apropriados, de acordo com o brilho dos sinais fluorescentes observados.Em seguida, configure a espessura do Z-stack para obter imagens dentro da fatia tumoral. Depois, selecione o intervalo de tempo do Z-stack e o tempo total de gravação para capturar imagens em intervalos de tempo específicos. Após capturar e exportar as imagens fluorescentes, analise a migração das células T CD8 conforme descrito no protocolo textual.É mostrada aqui uma imagem representativa de um corte corado de tumor humano de pulmão. Observe a distribuição das células T verdes positivas para CD8, das células tumorais coradas em azul para a molécula de adesão de células epiteliais e das células estromais vermelhas positivas para CD90 ou tímico. Em particular, observe que as células T CD8 são mais abundantes no estroma em comparação com os islotes tumorais.Plotados aqui estão os trajetos de células T CD8 residentes individuais coradas em verde, e os compartimentos estromais vermelhos e tumorais azuis da fatia de tumor pulmonar humano. O colágeno detectado por geração de segundo harmônico e exibido em vermelho marca o compartimento estromal. Embora menos abundantes que os islotes tumorais, as células T CD8 migram mais ativamente neste compartimento em comparação com o estroma.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada normalmente em quatro ou cinco horas, se for executada corretamente. Após este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como obter uma coloração imunológica de amostras de tumores, com o objetivo de monitorar linfócitos T CD8 residentes utilizando um microscópio confocal.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este protocolo descreve um método para células T imagem fluorescentes introduzido em fatias de linfonodos. A técnica permite análises em tempo real de migração de células T com o tradicional campo amplo de fluorescência ou microscópios confocal.

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O protocolo romance relatado no presente estudo permite a detecção seletiva de metástases pulmonares em resolução única célula em camundongos...

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Este vídeo descreve a imagem de células T CD8 infiltrantes de tumor residentes marcadas com anticorpos acoplados fluorescentemente em fatias de tumor de pulmão humano. Essa técnica permite análises em tempo real da migração de células T CD8 por meio de microscopia confocal.

Análise em tempo real da migração de células T residentes em diferentes regiões tumorais usando microscopia confocal

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